Ku基因在微生物中的研究进展

ku基因介导的非同源末端连接(NHEJ)途径是DNA双链断裂(DSBs)的一种修复机制,它不依赖于同源重组,且通过与之竞争而削弱同源重组。由于ku基因在生物进化过程中的高度保守性,其功能在很多微生物中已经得到研究,尤其在丝状真菌中,将ku基因敲除,在NHEJ途径缺陷的背景下,同源重组发挥主要作用,基因敲除的频率大为提高,从而方便了对基因功能的研究。     

CRISPR/Cas9系统在丝状真菌中的研究进展

丝状真菌(Filamentous fungi)是一种与人类生存密切相关的微生物,除了具有巨大的食用和药用价值外,还被广泛应用于工业开发。近年来,成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats-associated protein 9,CRISPR/Cas9)以其设计简单、操作方便、精准定位、效率高等诸多优点在各个研究领域中迅速发展,并受到了国内外广泛关注,但由于某些真菌如烟曲霉中极低的同源重组率等,使得对其进行遗传操作相对困难,因而该技术在丝状真菌尤其是大型真菌中的应用鲜少。从CRISPR/Cas9技术入手,结合该技术在丝状真菌研究领域的最新应用和研究进展,对其在丝状真菌中实现编辑的各种机制做了详细介绍,并重点分析了其在各类已报道的模式真菌中的应用,旨在为更多真菌实现基因编辑提供参考。     

赤霉菌原生质体DNA转化

DNA转化是基因表达和其它分子生物学研究的一项重要内容。原核生物（如细菌）的DNA转化技术已相当成熟,作为真核生物的丝状真菌其DNA转化过程要相对复杂一些,且转化效率一般也不如细菌的高。但丝状真菌DNA转化的研究对于深入探讨真菌基因表达调控的机理、尤其是研究外源基因在丝状真菌中的表达有着重要意义（唐国敏,1992）。赤霉菌（Gibberellajirjtheroi）在实验室条件下易培养、生长快,是研究赤霉素储类生物合成途径的必需材料,在作为表达体系表达外源基因尤其是储类合成的关键基因方面亦有着潜在的用途。但作为赤霉菌基础研究…     

黑曲霉pepB基因缺失菌株的构建及其功能分析

以黑曲霉(Aspergillus niger)GICC2773基因组DNA为模板,用PCR方法分别扩增pepB基因中的上游约1．4kb和下游约1．3kb两段DNA序列,将此两段序列按同一方向分别插入质粒pMW1中潮霉素抗性基因(hph)表达单元的5′和3′端,构建成重组质粒pMW1-pepB,用于通过同源重组靶向破坏基因组中的pepB基因。同源重组则采用原生质体-PEG方法,将酶切pMW1-pepB得到的线性片段转化A．niger GICC2773菌株,通过潮霉素选择平板得到62个Hgy抗性转化子,然后采用PCR方法从这些抗性转化子中筛选到1个由于同源重组产生的pepB基因缺失突变菌株pepB29。功能分析显示该突变株的酸性蛋白酶活性有明显下降,外源蛋白漆酶的分泌表达有所提高。     

限制酶介导的插入突变及其在丝状真菌中的应用

克隆基因的方法很多,通过突变是克隆基因的常用方法,如转座子标签法常用于克隆植物病原细菌致病相关基因及植物的抗病基因。尽管转座因子在丝状真菌中也普遍存在,但对它们的转座作用和功能了解不多,迄今转座子标签法还没有发展成为标记真菌突变体和基因克隆的常规技术。而一般的ＵＶ或化学突变方法又将使突变基因的鉴定和克隆遇到许多问题。用质粒ＤＮＡ转化真菌时,也会发生非同源随机插入真菌基因组而形成标记的突变体,但往往由于转化频率较低等因素而难以广泛应用。新近的研究发现,在限制酶介导下大多数真菌的质粒ＤＮＡ转化频率明…     

根癌农杆菌介导的定点敲除技术在红色红曲菌中的应用

红曲菌(Monascus spp.)是一种重要的丝状真菌, 广泛应用于食品和医药领域中。目前, 由于对红曲菌遗传背景了解的很少, 因而对其重要功能基因的研究报道很少。本研究采用根癌农杆菌介导的转化技术对红色红曲菌(Monascus ruber)中推断的G-蛋白信号调节子mrfA基因的RGS功能域进行定点缺失研究, 探讨基于同源重组为基础的基因定点缺失技术在红曲菌基因功能鉴定中的可行性。构建的敲除载体pC805S左右同源臂长度分别为958 bp和824 bp, 将其转入受体菌M. ruber 中, 得到的138株转化子中, 有26株转化子发生了同源重组, 重组率达到18.8%。实验结果表明该技术作为红曲菌基因功能鉴定的方法是可行的。     

丝状真菌中的RNA干扰及其应用技术

RNA干扰是真核生物中相对保守的一种基因特录后表达调控机制,它通过双链RNA介导细胞内mRNA发生特异性降解或翻译抑制,从而调控靶基因的表达.对丝状真菌中RNA压制和减数分裂沉默等现象的研究表明,与动、植物一样,丝状真菌中也存在RNA干扰现象.通过对RNA压制缺失突变株和减教分裂沉默缺失突变株的一系列分子生物学研究,获得了与之密切相关的一系列蛋白,而这些蛋白在结构和功能上与动、植物RNA干扰途径的蛋白高度相似,这些结果证明了丝状真菌中的RNA存在干扰现象.RNA干扰技术作为丝状真菌分子生物学研究或遗传改造的工具具有特殊的意义,因为丝状真菌具有多核和发生非同源重组频率高的特点,难以用基因敲除手段进行改造.系统地介绍丝状真菌中的RNA干扰途径以及使用RNA干扰对真菌进行遗传改造的方法.     

用基于"Neo/E"的技术构建重组质粒

根据重组工程原理,建立了一种用于构建重组质粒的“neo／E”(抗生素／单酶切位点)选择与反选择新方法。首先采用PCR方法扩增出线性打靶分子：然后进行两步体内同源重组,(1)neo／E基因敲入,重组子呈现neo抗性表型;(2)目的基因替换M／E基因。用限制酶E消化时,发生第二步重组的DNA分子不能被消化,能够转化大肠杆菌受体菌DH5α。应用该方法构建了重组质粒pGL3-Basic PC1900T。PCR及测序鉴定证明：外源片段重组率为20％,所建立的重组工程选择与反选择新技术为质粒构建提供了新的解决方案。     

niaD基因与uidA基因共转化糖化酶高产菌株Aspergillus niger T21

从Aspergillu niger T21 分离到自发性的氯酸盐抗性株,再经氮源生长试验获得硝酸盐还原酶缺陷的niaD 突变体N44。用含有niaD的质粒pSTA10转化N44,转化频率为5个／μg(转化子/DNA)。转化子的Southem印迹分析表明niaD基因同源整合到N44的染色体DNA中。pSTA10与含葡糖苷酸酶基因(uidA)的质粒pNOM102共转化N44,共转化频率为40％。共转化子的(GUS(葡糖苷酸酶)活力测定结果表明uidA基因已在N44中表达。由此可知,以niaD为选择标记,uidA为报告基因,以N44为受体的转化系统可用于丝状真菌启动子功能检测和已知调控序列的功能分析。     

植物遗传工程

921日00植物甚因标签技术的进展〔英〕/Yoder,J.1.一1 Genet.Eng.(N.Y.)一1991,13一265~275[译自DBA,1991,10(17),91一oosse〕 讨论了以下内容:(A)染色体外重组;(B)基因标签,(C)人为构建位点专一性重组系统, (D)植物中同源重组的生物化学。提高植物中有效同源重组率的2条常规途径是:提高同源插入数、降低非同源擂入数。因多数串联擂人片段可被重复筛选,因此可用正一负交替筛选选择重组体。灵敏的物理检测法,如聚合酶链反应,可提高鉴别特殊擂人片段的有效性。(朱遐)921901限制性片段长度多态性在植物改良中的应用〔会,英〕/K ing,G.…2…     

同源重组及非同源末端连接修复途径介导的基因编辑:CRISPR技术的认知、应用及展望

CRISPR系统具有精确识别及剪切特异性DNA序列功能而被开发成一种高效的基因编辑工具。它以成本低廉、操作简便、效率高及通用性广等优势,成为新一代最具代表性的基因编辑技术。在应用中,CRISPR系统可在特定靶点形成DNA双链断裂,继而诱导同源重组(HDR)或非同源末端连接修复(NHEJ),为基因组定向改造与调控带来了革命性的突破。该文将对近年来生物科学领域中发展迅猛的研究工具CRISPR/Cas系统进行介绍,包括其结构、作用原理、类型及应用等,并重点阐述同源重组或非同源末端连接修复途径介导的基因定向编辑技术及应用。     

基因编辑技术对大肠杆菌yjjW基因点突变的两步法策略

[目的]为了实现对大肠杆菌靶基因的点突变,本研究将同源重组系统与CRISPR-Cas9技术相结合,探索一种高效、简捷的两步法策略.[方法]将靶基因的上下游同源臂和标记基因(amp)与pKOV质粒连接,获得pKOV-HR重组质粒.将pKOV-HR转化至大肠杆菌,借助其自身RecA重组系统,介导DNA发生同源重组,获得靶基...     

马尔尼菲青霉基于pkuB基因缺失的高效基因打靶系统构建

马尔尼菲青霉是温度依赖双相性条件性致病真菌,可感染免疫缺陷人群,区域流行于东南亚和我国南方。马尔尼菲青霉已成为研究真菌双相形态转换和病原-宿主相互作用分子机制的模式系统。功能基因组学研究为深入探讨马尔尼菲青霉双相转换和致病分子机制提供了线索,大量的候选基因功能需要高通量的基因修饰方法验证。在许多真菌中已建立基于阻断DNA非同源重组修复途径提高基因打靶效率的实验研究模型。本文报道在马尔尼菲青霉中通过缺失马尔尼菲青霉非同源重组修复途径的关键组分PKUB同源基因pkuB构建了一个高效基因打靶系统。结果表明,以pkuB基因缺失菌株(△pkuB)为出发菌株能降低外源DNA片段的非同源末端连接重组的概率而显著提高基因打靶效率,pkuB基因缺失不影响菌落形态和双相转换能力。高效基因打靶分子遗传实验模型的建立为大规模进行马尔尼菲青霉基因功能研究提供了有力的工具。     

一种基于温敏质粒的新型基因敲除方法

基于温敏型质粒而不用线性DNA的方法用于快速敲除沙门氏菌染色体上的目的基因。以伤寒沙门氏菌S.ty2基因组为模板扩增得到的ssaV基因的上下游同源臂,与两端带有FRT位点的卡那霉素抗性基因片段连接到温敏型质粒pHY304,共同构建同源重组载体;然后转化S.ty2,通过筛选得到带有抗性标记的重组菌。通过转入重组酶表达质粒pCP20,去除抗性标记,得到ssaV基因缺失的重组菌,并在 DNA 水平进行了鉴定。建立了一种改进的基于温敏质粒的沙门氏菌的基因敲除方法,此方法也值得在其他革兰氏阴性菌的基因敲除中尝试应用。     

DNA基因库的同源重组筛选

专利为鉴别和分离真核寄主基因库中目标DNA的同源重组法(Ⅰ),包括:(a)制备真核细胞DNA基因库,其中可发生导入DNA与寄主细胞现有DNA间的重组;(b)导入在真核寄主细胞中可复制并含选择性标记基因,与目标DNA部分同源的DNA序列的目标DNA载体质粒YIp;(c)重组;和(d)选择转化体。专利还包括:(1)用(Ⅰ)分离到的哺乳动物、人或植物DNA或基因;(2)带至少缺失1个选择性标记染色体的酿酒酵母TD7-16d、IV-16d和MGD131-10;(3)质粒p184DLARG及其功能性等同物;(4)在     

医药其它

960247 通过同源重组进行基因破坏构建累积角鲨烯的酿酒酵母突变体[英]/Kamimura,N.…∥Appl.Microbiol. Biotechnol.-1994,42(2～3).-353～357[译自DBA,1995,14(6),95-03277] 通过随机短片段染色体DNA同源重组进行的     

植物内生枯草芽孢杆菌纳豆激酶同源基因的序列分析及其在大肠杆菌中的表达

利用基因组学和生物信息学的方法,从一种植物内生枯草芽孢杆菌菌株Bs0922的基因组DNA中克隆了纳豆激酶的同源基因NK-Bs0922,长度为1 149 bp。通过重组和转化在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了一个大小为48.0 kD的重组蛋白。     

麦迪霉素产生菌中与孢子色素聚酮体生物合成相关的酮基还原酶基因

研究了麦迪霉素产生菌-生米卡链霉菌1748的原生质体形成、再生和DNA转化条件,建立了生米卡链霉菌1748的DNA转化系统.麦迪霉素产生菌酮基还原酶(MKR)基因利用大肠杆菌-链霉菌穿梭温敏型质粒pKCll39(Am^R)进行基因中断实验,结果表明了发生同源交换的重组子在含Am的MY培养基上形成白色孢子,而生米卡链霉菌1748在MY培养基上形成灰色孢子.以MKR基因为探针的South-ern杂交结果证明重组子中确实发生了同源交换,发生了基因中断的重组子仍然产生麦迪霉素.这一结果证明麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因的生物功能是参与麦迪霉素产生菌中决定孢子色素的聚酮体的生物合成,与麦迪霉素的生物合成无关.重组质粒pCN8B12来自麦迪霉素产生菌基因文库,是以pNJ1为载体,插入了28kbDNA片段,该片段中既有与actⅠ同源的区域也有与actⅢ同源的区域.     

基因靶位操作的原理与策略

基因靶位操作(gene targeting)是80年代发展起来的一项重要分子生物学技术, 是通过外源DNA与染色体DNA间的同源重组,定点修饰、改造基因组特定位点的技术.     

一种有效的嗜热真菌杜邦嗜热菌靶向基因替代系统

以嗜热真菌杜邦嗜热菌Thermomyces dupontii NRRL 2155为研究材料,利用同源重组原理和真菌原生质体转化方法,以潮霉素抗性基因替换嗜热真菌目标基因,获得抗潮霉素的靶向基因敲除突变菌株。优化的遗传转化体系为：用15mg/mL裂解酶,在28℃下酶解2g杜邦嗜热菌菌丝5.5h以获得原生质体,经STC缓冲液洗涤重悬后,利用PEG（polyethylene glycol）介导的遗传转化方式,将10μg线性敲除全长片段转化至杜邦嗜热菌原生质体中,通过潮霉素筛选及PCR验证得到基因替换突变菌株,同源重组率达到20%。本研究首次将原生质体转化方法应用在杜邦嗜热菌,并成功建立稳定高效的基因替换体系,为快速构建杜邦嗜热菌的遗传转化体系和研究该嗜热真菌的基因功能提供有效方法。