纤维粘连蛋白的分子生物学研究

纤维粘连蛋白是一双链结构、由多个功能区构成的大分子糖蛋白．多肽链分子由三种形式的结构模型重复出现所构成,相邻的几个重复结构组成一个功能区.体内仅一条FN基因,经选择剪切产生多种形式的FN多肽,它们之间的区别在于三个可变区氨基酸残基的不同.纤维粘连蛋白参与广泛的病理及生理过程,其功能区结构及基因结构的深入研究,有利于阐明其结构与功能的关系.     

层粘连蛋白促进实体型瘤细胞粘着、铺展及~3H-TdR参人

 恶性肿瘤细胞或粘着于基膜以及在一定的基质上增殖对于肿瘤的浸润转移至关重要。层粘连蛋白(1aminin,LN)是基膜所特有的非胶原糖蛋白。我们研究了LN在肿瘤细胞粘着、铺展及增殖中的作用。通过测定粘着细胞所释放的LDH活性定量分析细胞粘着率。LN可显著增加体外培养的小鼠S180-V肉瘤及B16-MBK黑色素瘤细胞在玻璃及Ⅳ型胶原基质上粘着及铺展。纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)亦有类似作用。而非糖蛋白(牛血清清蛋白)或其他糖蛋白(鸡卵清清蛋白或免疫球蛋白)均无类似作用。此外,LN或FN抗体可分别抑制细胞粘着于LN或FN。这些结果表明LN或FN促细胞粘着作用是专一性的。扫描电镜观察表明,粘着在LN敷盖的玻璃表面的瘤细胞呈多突扁平形、膜皱襞及微绒毛十分稀少,而粘着在裸露的玻璃表面者为球形,膜皱襞及微绒毛甚多。再者,~3H-TdR向粘着于LN基质上的瘤细胞群的参入量显著高于粘着在裸露玻璃面者。     

胚胎期下颌髁突软骨中糖胺多糖、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白的表达

目的　观察不同时期胎儿髁突软骨中糖胺多糖、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白的表达。方法　应用组织化学和免疫组织化学SP法检测 32例 13周～ 33周 (A组 13～ 17周 ,B组 18～ 2 2周 ,C组 2 3～ 2 7周 ,D组 2 8～ 33周 )胎儿髁突软骨中糖胺多糖、纤维粘连蛋白和层粘连蛋白 ,并行体视学图象分析。结果　髁突软骨中AB PAS在各组的灰度及积分光密度均无显著性差异 (P >0 . 0 5 )。FN、LN阳性表达位于软骨细胞外基质 ,增殖层和成软骨细胞层呈强表达 ,尤其在两层交界处 ,而肥大软骨细胞层中明显减弱。体视学分析表明LN在A组表达最强 ,其灰度及积分光密度均值与B、D组间均有显著性差异 (P <0 . 0 5 )。〔灰度 :A组 175 . 0 18± 8. 30 1、B组 187 16 2± 13 6 44、D组 190 5 5 0± 6 46 0 ;积分光密度 :A组 2 739± 0 799,B组 2 0 11± 0 85 5 ,D组 1 5 33± 0 42 7,均存在显著性差异 (P <0 0 5 )。FN在B组表达最强 ,灰度与A、C、D三组间存在显著性差异 (P <0 0 5或P <0 0 1) ;积分光密度与A、D组间有显著性差异 (P <0 0 5 )。〔灰度 :B组 173 0 89± 8 40 7、A组 182 0 45± 10 138、C组 188 70 1± 8 0 94、D组 195 417± 4 82 7;积分光密度 :A组 1 314± 0 86 9、B组 4 332± 2 5 37、D组 2 12     

去甲斑蝥素对糖尿病大鼠肾小球纤维粘连蛋白及钙调磷酸酶的影响

目的:观察去甲斑蝥索(NCTD)对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病(DM)模型大鼠肾小球纤维粘连蛋白以及钙调磷酸酶表达的影响,探讨去甲斑蝥素抗肾小球纤维化的机制.方法:10只大鼠正常饮食为正常对照组(C)组,30只大鼠给予高脂高糖饮食+链脲佐菌素(STZ)制备DM模型,随机分3组:DM模型(D)组10只,小剂量去甲斑蝥素治疗(N1)组10只,大剂量去甲斑蝥素治疗(N2)组10只,给药8周后检测血糖,血肌酐水平变化;用免疫组化法检测肾组织肾小球纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)以及钙调磷酸酶(calcineurin,CaN)表达,分别用realtime-PCR以及western blot法检测肾组织FN以及CaN mRNA和蛋白水平的表达.结果:模型(D)组血糖,血肌酐水平上升(P<0.05),同时肾小球区FN,CaN的表达高于正常(C)组(P<0.05).去甲斑蝥素干预(N)组与模型组比较,去甲斑蝥素组肾小球区FN,CaN表达下调(P<0.05).大剂量组效果更显著(P<0.05).去甲斑蝥素(N)治疗组血糖水平,肾功能较(D)组无明显变化.结论:去甲斑蝥素能减少糖尿病大鼠肾小球区FN的表达,其作用机制可能是通过使CaN的表达下调而实现.     

正丁酸诱导转化细胞表面纤维粘连蛋白的研究

恶性转化的金仓鼠乳鼠肺成纤维细胞BHLB_4,在2 mmol/L丁酸长期处理下部分表型发生逆转,明显地趋于正常。用间接免疫荧光标记法发现BHLB_4细胞表面纤维粘连蛋白丧失,而丁酸处理可使其在细胞膜表面重新附着,成为纤维索状分布。进一步分离测定金仓鼠细胞表面Fn分子量为250 kDa,在正常对照和丁酸逆转的细胞表面含量相对较高。实验揭示了细胞表面Fn在分布和数量上的变化,同金仓鼠细胞的转化或逆转形态有较密切的关系,可以方便地作为我们初步衡量细胞是否转化的一个较为客观的指标。     

层粘连蛋白糖肽对实体型瘤细胞粘着于层粘连蛋白基质的影响

 本文报告由小鼠EHS瘤提取的层粘连蛋白(Laminin,LN)经链霉蛋白酶(Pronase)消化,再经Sephadex-G50层析分离得到LN总糖肽。它可显著抑制黑色素瘤细胞B16-MBK及S180肉瘤细胞与LN基质的识别及粘着,并具有明显剂量依赖性。与五肽(YIGSR),卵清蛋白及其糖肽,胎球蛋白及其糖肽比较,LN总糖肽的抑制效果显著高于YIGSR及胎球蛋白糖肽,而其它三者均无抑制作用。因而提示:LN分子中一定结构的糖链特异地参与了LN对肿瘤细胞表面LN受体的识别与结合。     

旋磁场对健康人和矽肺病人血清铜蓝蛋白活力的影响

目的 :为了解旋磁场对健康人、矽肺患者血清铜蓝蛋白 (Cp)活力的影响。方法 :Cp采用联大茴香胺法进行测定。结果 :在旋磁场中曝磁 30分钟后 ,健康曝磁组血清Cp( 1 0 1 .1 2± 39.35 )与健康对照组血清Cp( 73.0 9± 36.72 )相比活力显著增加 (p <0 .0 5 ) ;矽肺曝磁组血清Cp( 1 63.36± 32 .64)与矽肺对照组血清Cp( 1 2 3.80± 2 8.2 5 )相比活力显著增加 (p <0 .0 1 )。结论 :旋磁场影响健康人和矽肺患者血清铜蓝蛋白的活力。     

化脓性链球菌纤维粘连蛋白结合蛋白的研究进展

本文介绍化脓性链球菌纤维粘连蛋白（ＥＢＰ）结合蛋白的最新研究进展，对链球菌的粘附机理、纤维粘连蛋白结合蛋白的分子生物学结构特征、在粘附过程中的作用以及其临床意义作了扼要阐述。     

胆管癌组织中层粘连蛋白及67KDa层粘连蛋白受体的表达及其临床意义

目的 探讨层粘连蛋白及67KDa层粘连蛋白受体的表达与胆管癌临床病理学行为的关系。方法 应用S-P免疫组化法对52例人胆管癌组织中层粘连蛋白及67KDa层粘连蛋白受体的表达水平进行研究。结果 层粘连蛋白及67KDa层粘连蛋白受体的高表达与胆管癌淋巴结转移呈明显相关,层粘连蛋白及67KDa层粘连蛋白受体阳性肿瘤淋巴结转移率（83％,55％）明显高于层粘连蛋白及67KDa层粘连蛋白受体阴性肿瘤（15％,20％,P〈0．05）,且层粘连蛋白及67KDa层粘连蛋白受体的表达与胆管癌组织学类型、分化程度亦存在明显相关（P〈0．05）。结论 层粘连蛋白及67KDa层粘连蛋白受体的表达在胆管癌淋巴结转移中起协同作用。     

Structural Analysis of Collagen Type I Interactions with Human Fibronectin Reveals a Cooperative Binding Mode

Despite its biological importance, the interaction between fibronectin (FN) and collagen, two abundant and crucial tissue components, has not been well characterized on a structural level. Here, we analyzed the four interactions formed between epitopes of collagen type I and the collagen-binding fragment (gelatin-binding domain (GBD)) of human FN using solution NMR, fluorescence, and small angle x-ray scattering methods. Collagen association with FN modules ^8–9FnI occurs through a conserved structural mechanism but exhibits a 400-fold disparity in affinity between collagen sites. This disparity is reduced in the full-length GBD, as ⁶FnI^1–2FnII⁷FnI binds a specific collagen epitope next to the weakest ^8–9FnI-binding site. The cooperative engagement of all GBD modules with collagen results in four broadly equipotent FN-collagen interaction sites. Collagen association stabilizes a distinct monomeric GBD conformation in solution, giving further evidence to the view that FN fragments form well defined functional and structural units.     

Type IX Collagen Interacts with Fibronectin Providing an Important Molecular Bridge in Articular Cartilage

Type IX collagen is covalently bound to the surface of type II collagen fibrils within the cartilage extracellular matrix. The N-terminal, globular noncollagenous domain (NC4) of the α1(IX) chain protrudes away from the surface of the fibrils into the surrounding matrix and is available for molecular interactions. To define these interactions, we used the NC4 domain in a yeast two-hybrid screen of a human chondrocyte cDNA library. 73% of the interacting clones encoded fibronectin. The interaction was confirmed using in vitro immunoprecipitation and was further characterized by surface plasmon resonance. Using whole and pepsin-derived preparations of type IX collagen, the interaction was shown to be specific for the NC4 domain with no interaction with the triple helical collagenous domains. The interaction was shown to be of high affinity with nanomolar K_d values. Analysis of the fibronectin-interacting clones indicates that the constant domain is the likely site of interaction. Type IX collagen and fibronectin were shown to co-localize in cartilage. This novel interaction between the NC4 domain of type IX collagen and fibronectin may represent an in vivo interaction in cartilage that could contribute to the matrix integrity of the tissue.     

Definition of the Native and Denatured Type II Collagen Binding Site for Fibronectin Using a Recombinant Collagen System

Interaction of collagen with fibronectin is important for extracellular matrix assembly and regulation of cellular processes. A fibronectin-binding region in collagen was identified using unfolded fragments, but it is not clear if the native protein binds fibronectin with the same primary sequence. A recombinant bacterial collagen is utilized to characterize the sequence requirement for fibronectin binding. Chimeric collagens were generated by inserting the putative fibronectin-binding region from human collagen into the bacterial collagen sequence. Insertion of a sufficient length of human sequence conferred fibronectin affinity. The minimum sequence requirement was identified as a 6-triplet sequence near the unique collagenase cleavage site and was the same in both triple-helix and denatured states. Denaturation of the chimeric collagen increased its affinity for fibronectin, as seen for mammalian collagens. The fibronectin binding recombinant collagen did not contain hydroxyproline, indicating hydroxyproline is not essential for binding. However, its absence may account, in part, for the higher affinity of the native chimeric protein and the lower affinity of the denatured protein compared with type II collagen. Megakaryocytes cultured on chimeric collagen with fibronectin affinity showed improved adhesion and differentiation, suggesting a strategy for generating bioactive materials in biomedical applications.     

蛋白聚糖在维持牙本质胶原空间形貌和水合性能方面的作用

目的:评价牙本质蛋白聚糖对脱矿牙本质胶原纤维形貌和水合性能的影响。方法:新鲜拔除无龋坏人磨牙牙本质酸蚀后分别用胰蛋白酶和硫酸软骨素酶ABC孵育去除牙本质蛋白聚糖和糖胺聚糖侧链,对照组与实验组处理方法相同,但孵育液中不添加酶。然后在牙本质表面不同润湿状态下用场发射扫描电镜和激光共聚焦扫描电镜分别观察牙本质的微观形貌并评价脱矿牙本质的水合性能。结果:硫酸软骨素酶ABC和TRY酶处理改变了牙本质的微观形貌,使胶原纤维间距增大。酶处理、牙本质表面润湿性及两者的交互作用均会显著影响脱矿牙本质的厚度(P0.0001)。结论:牙本质蛋白聚糖和糖胺聚糖侧链在维持牙本质胶原纤维网的空间结构和水合作用方面均发挥着重要作用。蛋白聚糖、胶原纤维-蛋白聚糖以及蛋白聚糖-蛋白聚糖间的的亲水性是影响脱矿牙本质围观形貌和厚度的重要因素。     

STK15的表达对NIH3T3细胞的影响

目的构建pcDNA3.1-STK15表达质粒,探讨STK15基因对小鼠成纤维细胞（NIH3T3）的影响。方法构建pcDNA3.1-STK15质粒,将其转染NIH3T3,应用RT-PCR、免疫细胞化学和Western印迹方法检测STK15的表达;MTT法检测细胞增殖能力;Transwell检测细胞侵袭能力。结果转染pcDNA3.1-STK15质粒的NIH3T3细胞在48 h有STK15的表达,而且该细胞的增殖速度和穿透Matrigel胶的细胞数均明显高于对照组（P〈0.05）。结论STK15基因具有增加细胞增殖和细胞侵袭力的功能,进而形成肿瘤。     

Ceruloplasmin and myeloperoxidase in complex affect the enzymatic properties of each other

Ceruloplasmin (CP), the multicopper oxidase of plasma, interacts with myeloperoxidase (MPO), an enzyme of leukocytes, and inhibits its peroxidase and chlorinating activity. Studies on the enzymatic properties shows that CP behaves as a competitive inhibitor impeding the binding of aromatic substrates to the active centre of MPO. The contact between CP and MPO probably entails conformational changes close to the p-phenylenediamine binding site in CP, which explains the observed activation by MPO of the substrate's oxidation. CP subjected to partial proteolysis was virtually unable to inhibit activity of MPO. The possible protein–protein interface is comprised of the area near active site of MPO and the loop linking domains 5 and 6 in CP. One of the outcomes of this study is the finding of a new link between antioxidant properties of CP and its susceptibility to proteolysis.     

血管再狭窄发生过程中MMP-2基因表达与胶原转换的动态变化

建立主动脉内皮剥脱后血管再狭窄大鼠模型,用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ 印迹分析、含明胶ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、羟脯氨酸含量测定及流式细胞术动态观察血管再狭窄发生过程中ＭＭＰ－２基因表达与胶原转换及血管细胞增殖之间的关系．实验结果表明,血管内皮剥脱后,ＭＭＰ－２基因表达被显著诱导,ＭＭＰ－２活性及胶原转换明显增高,在第７ ｄ,ＭＭＰ－２表达活性及胶原合成与降解均达到峰值;第２１ ｄ,ＭＭＰ－２表达恢复正常,胶原合成和降解仍维持在较高水平．流式细胞分析结果显示,血管内皮剥脱后进入增殖状态及发生凋亡的细胞显著增加,增殖细胞所占比例高于凋亡细胞,且两者均随内皮损伤后的时间延长而增加．     

microRNAs参与韧带成纤维细胞成骨分化相关分子表达的调节

韧带成纤维细胞成骨分化与强直性脊柱炎等多种异位骨化相关性疾病有关,但其机制尚不清楚.本研究目的在于观察韧带成纤维细胞在成骨分化过程中microRNA和mRNA的表达谱变化,以期为揭示成纤维细胞成骨分化机制提供研究基础.原代培养韧带成纤维细胞、地塞米松、抗坏血酸和β 磷酸甘油体外诱导其成骨分化, RT-PCR检测成骨标志物骨钙素和Runx2的表达.采用表达谱基因芯片分析诱导0、7、14 d后韧带成纤维细胞的microRNAs和mRNAs表达,并用实时定量PCR（RT-qPCR）和Western印迹方法验证生物信息学分析结果.结果显示,与未诱导前相比,成骨分化第7 d有66个microRNAs和640个mRNA表达上调,94个microRNAs和744个mRNA表达下调;成骨分化第14 d有58个microRNAs和781个mRNA表达上调,96个microRNAs和603个mRNA表达下调.实时定量PCR和Western印迹验证结果显示,miR-29b在成骨分化过程中表达上调,TGFβ3表达水平降低,与芯片结果一致,miR-29b通过抑制TGFβ3蛋白的翻译来促进Runx2的表达,从而促进韧带成纤维细胞向成骨细胞分化.韧带成纤维细胞成骨分化过程中,microRNA调控基因及mRNA差异表达基因除涉及BMPs、Wnt和Ihh等信号通路外,在成纤维细胞成骨分化过程中可能还存在其它的新机制.     

RNA聚合酶II中的CTD结构在mRNA转录和加工偶联过程中的重要作用

RNA聚合酶II最大亚基末端的羧基端结构域（CTD）是由以七氨基酸（-Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser- Pro-Ser-）为重复单位的高度保守的重复序列组成的。因其结构与功能上的特殊性,它在近年来受到学术界的广泛关注。诸多的实验表明,该结构可通过与mRNA加工因子的相互作用而对其加工过程产生直接或间接的影响,在mRNA的转录和加工的偶联过程中具有重要的作用。本文即是根据近年来的实验结果对其结构和功能做出的综述性介绍。