β—半乳糖苷酶基因在猕猴桃果实成熟过程的表达

从成熟中华猕猴桃果实中克隆以了一个β－半乳糖苷酶基因ｃＤＮＡ片段,其长度为７４７ｂｐ,有一由２４９个氨基酸组成的开放阅读框架它与苹果、 芦笋、绿药椰菜、番匣中β－半乳糖苷酶基因ｃＤＮＡ相应区段的的核同源性为７６．３％～７０．３％,氨基酸同源性为６９．１％～７２．７％,用该片段为探针进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ分析表明,果实采收时,β－半乳糖苷酶ｍＲＮＡ水平最高,随后呈下降变化,同时β－半乳糖苷酶ｍＲＮＡ水     

碳源对K.fragilis LFS-8611β-D-半乳糖苷酶合成的影响

探讨了碳源对脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)LFS-8611生长、β-D-半乳糖苷酶合成的影响及碳源对该酶合成的诱导作用。脆壁克鲁维酵母(K,fragilis)LFS-8611生长与β-D-半乳糖苷酶合成同步。该菌株生长和产酶的最适碳源为半乳糖,乳糖次之。菌体生物量和酶活力随着培养基中乳糖浓度的增加而增加,乳糖浓度为12mg／mL,菌体生物量和酶活力达到峰值,分别为5．84g／L、19,12U／mL。半乳糖和乳糖对β-D-半乳糖苷酶合成具有诱导作用。诱导物浓度对β-D-半乳糖苷酶的诱导合成有较大影响。半乳糖诱导以山梨醇为碳源预培养的K．fragilis LFS-8611细胞合成β-D-半乳糖苷酶的最适浓度为10mg／mL。     

用于B→O血型改造的不同α-半乳糖苷酶的比较

α 半乳糖苷酶因可水解人B型红细胞表面的α 半乳糖残基 ,使B抗原结构变成O抗原结构 ,而成为B→O血型改造的工具酶 .对可能具有酶解B抗原活性的 3种α 半乳糖苷酶 ,即来源于大豆、咖啡豆和人的α 半乳糖苷酶的结构和功能进行了比较研究 .首先 ,利用序列分析工具对 3种酶蛋白的一级结构和特性进行了比较 ;随后 ,将编码大豆和人的α 半乳糖苷酶的cDNA克隆入毕赤酵母中进行表达 ,对筛选所得表达菌株进行诱导培养 ,并从培养上清中纯化重组的大豆和人α 半乳糖苷酶 ;分别测定大豆、咖啡豆和人α 半乳糖苷酶的生物化学性质以及它们的底物特异性 ;最后 ,以纯化的重组酶对人B型红细胞进行酶解 ,并测定酶解后红细胞的结构与功能 .结果表明 ,人源的α 半乳糖苷酶不适于酶解B抗原 ,而大豆来源的α 半乳糖苷酶不仅可作为B→O血型改造的工具酶 ,而且比咖啡豆来源的α 半乳糖苷酶更具优势     

一种快速检测β－半乳糖苷酶活性的试纸方法

建立了一种检测β－半乳糖酶活性的５－溴－４－氯－３－吲哚－β－半乳糖苷（Ｘ－ｇａｌ）试纸方法。其原理在于酶色原底物Ｘｇａｌ在β半乳糖苷酶作用下产生蓝色５－溴－４－氯－吲哚。此方法Ｘ－ｇａｌ用量少、操作简便、省时,适用于基因克隆的检定。     

家蚕丝蛋白基因启动子调控β－半乳糖苷酶在家蚕细胞系中的瞬时表达

家蚕丝蛋白基因启动子调控β－半乳糖苷酶在家蚕细胞系中的瞬时表达华刚,钱斌,吴祥甫（中国科学院上海生物化学研究所,２０００３１）关键词丝蛋白启动子;β－半乳糖苷酶基因;瞬时表达家蚕丝蛋自基因（Ｗｂ：Ｆｉｂｒｏｉｎｇｅｎｅ）在发育后期幼虫的后部丝腹中主要...     

β-半乳糖苷酶的筛选、克隆表达、酶学性质及其酶法合成低聚半乳糖

采用人工底物邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(o NPG)为筛选标记,从耐有机溶剂微生物菌库中,筛选出具有较高水解活性的β-半乳糖苷酶产生菌,再以乳糖为底物考察菌株低聚半乳糖的合成性能,筛选得到1株产β-半乳糖苷酶的Erwinia billingiae WX1。根据Gen Bank中相同属种的基因组序列推测β-半乳糖苷酶基因,克隆得到β-半乳糖苷酶基因gal,并在大肠杆菌中实现了来源于Erwinia billingiae菌β-半乳糖苷酶的克隆表达。该基因的开放阅读框(ORF)为1 428 bp,编码475个氨基酸,理论相对分子质量为5.2×104。镍柱法分离纯化得到电泳纯的β-半乳糖苷酶GAL,其酶学性质研究表明最适催化温度55℃,最适p H 7.0;Mg~(2+)、Mn~(2+)对该酶起较强促进作用,EDTA对该酶抑制作用较强。利用β-半乳糖苷酶GAL的转糖基作用,以乳糖为底物合成低聚半乳糖,初步优化的反应条件:底物乳糖质量浓度400 g/L,每克乳糖添加酶量1.0 U,在40℃反应16 h后,低聚半乳糖合成率达到34%(质量分数),显示了较好的开发前景。     

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）半乳糖可诱导表达系统特性的研究

把大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因克隆到带有酵母半乳糖可诱导启动子ＧＡＬ１的穿梭表达质粒ｐＹＥＳ２中,并把得以的重组质粒分别转化到两种不同遗传性状的宿主菌中,其中一株菌为蛋白酶活性缺失９０％以上的ｐｅｐ４－３突变菌株。通过比较两株重组菌产生的β－半乳糖苷酶活性水平发现在所述实验条件下,蛋白酶缺失突变菌株中产生的β－半乳糖苷酶少水平不仅均要高于另一对照菌株,并且ｐｅｐ４－３突变菌株表现受葡萄糖阻遏的严紧程     

微生物糖苷酶的新型突变酶——硫代糖苷酶的产生及应用

微生物糖苷酶的酸碱功能氨基酸突变酶能催化硫代糖苷的合成,这类酶被称为硫代糖苷酶。目前发展的硫代糖苷酶有β-硫代葡糖苷酶、β-硫代甘露糖苷酶、β-硫代半乳糖苷酶、α-硫代木糖苷酶和α-硫代葡糖苷酶,来源于细菌和古细菌,能合成多种硫代糖苷。最近,硫代糖苷酶被应用于糖蛋白的糖基化修饰,首次人工合成硫代糖蛋白。微生物糖苷酶合成功能的新延伸,对糖生物学、生物技术和制药业的发展将有着重要意义。     

微生物糖苷酶的新型突变酶——硫代糖苷酶的产生及应用

微生物糖苷酶的酸碱功能氨基酸突变酶能催化硫代糖苷的合成,这类酶被称为硫代糖苷酶。目前发展的硫代糖苷酶有β-硫代葡糖苷酶、β-硫代甘露糖苷酶、β-硫代半乳糖苷酶、α-硫代木糖苷酶和α-硫代葡糖苷酶,来源于细菌和古细菌,能合成多种硫代糖苷。最近,硫代糖苷酶被应用于糖蛋白的糖基化修饰,首次人工合成硫代糖蛋白。微生物糖苷酶合成功能的新延伸,对糖生物学、生物技术和制药业的发展将有着重要意义。     

耐热重组β-半乳糖苷酶的制备及酶稳定性研究

编码嗜热脂肪芽孢杆菌β—半乳糖苷酶基因的重组枯草芽孢杆菌WB600／pMA5—bgαB,经5L发酵罐发酵收集菌体超声波破壁,冷冻离心后再经过热处理和盐析纯化,比活力达80．3U／mgpr,回收率73．6％,纯化倍数12．4倍。β—半乳糖苷酶在细胞内及破壁后都具有较好的稳定性,60℃热处理对酶构象的影响不大。     

乳清酸蛋白(WAP)基因调控序列的鉴定及在小鼠乳腺细胞表达LacZ基因的研究

乳清酸蛋白（ＷＡＰ）是小鼠乳中的主要蛋白质．在亚克隆该基因的基础上,对其进行了酶切鉴定,并对该基因５′区进行克隆和序列分析,在核实序列正确后,构建了以其为调控序列,指导β－半乳糖苷酶基因的真核表达质粒,采用直接注射质粒的方法在小鼠乳腺中表达出β－半乳糖苷酶活性,从而证实基因调控序列的功能正确性,可以用于转基因动物乳腺表达研究,同时证实该方法可以作为一种暂时性表达载体的验证方法．     

β-半乳糖苷酶基因在猕猴桃果实成熟过程的表达

从成熟中华猕猴桃果实中克隆到了一个 β 半乳糖苷酶基因cDNA片段 ,其长度为 747bp ,有一由 2 49个氨基酸组成的开放阅读框架 ,它与苹果、芦笋、绿花椰菜、番茄中 β 半乳糖苷酶基因cDNA相应区段的核苷酸同源性为 6 7.3 %～ 70 .3 %,氨基酸同源性为6 9.1%～ 72 .7%。用该片段为探针进行Northern分析表明 ,果实采收时 ,β 半乳糖苷酶mRNA水平最高 ,随后呈下降变化 ,同时 β 半乳糖苷酶基因的表达可为外源乙烯所诱导 ,但在果实乙烯跃变期间 β 半乳糖苷酶基因的表达信号无显著变化。文中对 β 半乳糖苷酶在猕猴桃果实成熟衰老过程的作用进行了讨论     

蚕豆β－半乳糖苷酶活性必需氨基酸残基分析

 蚕豆β－半乳糖苷酶活性必需氨基酸残基分析龚笑海,孙册（中国科学院上海生物化学研究所,上海２０００３１）化学修饰作为一种研究酶活性基团的方法,对研究糖苷酶的催化机理有其独到的优点,并已有这方面的报道．从蚕豆纯化的β－半乳糖苷酶,分子量为７０ｋＤ,由两个...     

应用CTB基因启动子及信号肽序列构建分泌性表达系统

利用霍乱毒素B亚基基因的启动子、信号肽序列及ctx操纵子的转录终止信号构建了分泌性表达的质粒载体pMCOSS。Β－半乳糖苷酶基因克隆至霍乱毒素B亚基基因的信号肽序列下游后能得到高效分泌性表达。不同的宿主菌和培养基成分中对β-半乳糖苷酶的表达产量有较大的影响,以MM2为宿主菌、在玉米浆培养基中β－半乳糖苷酶的表达产量达4 lOOu／ml,产物的大部分分泌至细胞的周质,活力测定的结果与SDS—PAGE电泳测定结果基本一致,说明表达的β－半乳糖苷酶绝大部分都具有酶活性。构建的蛋白质分泌性表达的载体－宿主系统及合适的培养条件为易形成包含体的蛋白质的高效表达提供了一条新的途径。     

Kl LAC4用作白色念珠菌的报告基因

由于ｌａｃＺ基因在白色念珠菌中不能工作。将克氏酵母的β－半乳糖苷酶基因Ｋｌ ＬＡＣ４构建了能在白色念珠菌中工作的报告基因。Ｋｌ ＬＡＣ４基因融合到白色念珠菌乙醇脱氢酶基因（ＡＤＨ１）的启动子后面,在ＡＤＨ１终止子的共同控制下构建Ｋｌ ＬＡＣ４的表达质粒ｐＹＰＢ１－ＬＡＣ４。ＰＹＯＢ１－ＬＡＣ４转化白色念珠菌并测定了在固体培养基中的β－半乳糖苷酶活性以及在液体增减基的β－半乳糖苷酶活力。结果表明Ｋｌ     

乳糖操纵子介导的半乳糖苷酶在转基因动物中的应用前景

细菌的乳糖操纵子可以在哺乳动物中调控基因的表达,修饰阻抑物基因和操纵基因可调控阻抑物诱导能力及其对操纵基因的亲和力,更好的适应高等动物的内环境。半乳糖苷酶对乳糖操纵子系统有正向调控作用,利用乳糖操纵子在转基因动物中可诱导性调控半乳糖苷酶基因的表达,能有效的提高转基因动物利用半乳糖苷、吸收营养物质的能力。以下从乳糖操纵子的结构功能、乳糖阻抑物功能活性的基因调控、操纵基因的功能以及其在哺乳动物的应用现状四个方面,结合半乳糖苷酶的生理功能和其在转基因动物中应用两个方面进行综述,对乳糖操纵子介导的半乳糖苷酶在转基因动物中的应用效果和前景进行了分析探讨。     

β-半乳糖苷酶酶学性质及其在低聚半乳糖合成中的应用

研究乳酸克鲁维酵母所产β-半乳糖苷酶的酶学性质及低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)的酶法合成条件。利用高效液相色谱法进行检测,以GOS(聚合度n3)生成量为指标,考察温度、pH、金属离子种类和浓度对酶活性的影响,以及K+存在时,底物浓度、反应时间、加酶量对乳糖转化率及GOS生成浓度的影响。结果表明:一价离子对β-半乳糖苷酶转糖苷活性具有促进作用,其中K+、NH+4对水解活性同样起促进作用,而Na+起抑制作用;制备低聚半乳糖的最佳工艺条件为37℃、pH8.0、K+0.08mol/L、初始乳糖质量浓度500g/L、反应时间5h、加酶量10μL/g乳糖,此条件下低聚半乳糖的生成质量浓度达到94.74g/L。     

慈菇（Sagittaria safittifolia）α－半乳糖苷酶的纯化与性质

以对硝基苯糖苷基为底物,测定了慈菇的１２种糖苷酶,其中α－甘露糖苷酶、α－和β－半乳糖苷酶活力较高;经硫酸铵分级沉淀,ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１５０分子筛层析,ＣｏｎＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析,ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ离子交换层析,从慈菇抽提液纯化了α－半乳糖苷酶。纯化酶的比活提高１０７２倍,活力回收１５．６％,在圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上均显示１条蛋白质带,在α－半乳糖苷酶浓度为１５０ｍＵ／ｍｌ的溶液中测不到其他糖苷酶的活力。慈菇α－半乳糖苷酶的分子量用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００凝胶过滤柱测定或在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上测定均为６０ｋＤ,酶反应的最适ｐＨ在５．８附近,最适温度为６０℃。该酶分解对硝基苯基－α－半乳糖苷的Ｋ＿ｍ值为３．７×１０￣（－４）ｍｏｌ／Ｌ,Ｖ＿ｍ值为２．１×１０￣（－４）ｍｏｌ／Ｌ。银离子、汞离子显著抑制酶活力,Ｄ－半乳糖和密二糖均竞争性地抑制该酶水解对硝基苯基α－Ｄ－半乳糖苷的活力,根据Ｄｉｘｏｎ作图求得其Ｋ＿ｉ值分别为０．９２×１０￣（－３）ｍｏｌ／Ｌ和１．９８×１０￣（－３）ｍｏｌ／Ｌ。２－脱氧－Ｄ－半乳糖和Ｌ－岩藻糖为酶活力的非竞争性抑制剂。化学修饰     

分枝犁头霉a-半乳糖苷酶的底物特异性

测定了43种碳水化合物对酶活力的影啊。其中半乳糖、甘油醛及纤维二糖使酶活力下降50％以上,D-阿拉伯糖、塔格糖、半乳糖醛酸、D-枝糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖酸内酯．乳糖及蔗糖使酶活下降到70％左右;而二羟丙酮、2-脱氧-D-半乳糖及异丙基β-D-硫代半乳糖苷使酶话提高50％左右;其余的碳水化合物对酶活无明显影响。测定了Hg2+、甘油醛及半乳糖对酶的抑制类型。结果表明,Hg2+是a-半乳糖苷酶的非竞争性抑制剂,半乳糖及甘油醛是酶的竞争性抑制剂,后两者的K,值分别为8．3及12．5 mmol／L。     

酿酒酵母（Saccharomyces cereuisiae）基因启动子的分离和鉴定

肜动子探针载体ｐＦＲ１０９从酿酒酵母总ＤＮＡ中克隆到多个启动子片段,它们在大肠杆菌中均能启动β－半乳糖苷酶基因因的表达。对其中Ｙ８片段的进一步分析结果表明：该片段不仅来自酿酒酵母基因组,而且是以多拷贝的形式存在。当Ｙ８片段再次转入供体酵母时它仍能动β－半乳糖苷酶基因表达,但经次克隆去牛Ｙ片段５端部分顺序后,它就失去了启动子的功能。