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1.
利用PCR方法对单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D(HSV-2gD)基因进行了修饰,在其5'端删去约500bp的非编码区,仅保留ATG上游7个bp。将修饰后的HSV-2gD基因插入到带有痘苗病毒天坛株TK基因区段的痘苗表达质粒pJSA1175,置于痘苗病毒P7.5k早/晚期启动子控制下。将此重组质粒用脂质体Lipofectin方法转染已受野型TK ̄+痘苗病毒天坛株感染的TK ̄-143细胞,通过同源重组机制和标志基因LacZ产物的蓝斑显色作用,以及BudR试剂对TK表型的选择压力,筛选出整合有HSV-2gD基因的重组痘苗病毒。Southem杂交表明,HSV-2gD基因已正确地插入痘苗病毒TK基因区内;间接免疫荧光检测显示,HSV-2gD蛋白已得到有效表达,且主要分布于细胞膜。重组病毒免疫家兔可产生明显的抗HSV-2gD中和抗体。用重组病毒免疫小鼠,3周后可使94%(17/18)的小鼠对抗HSV-2的致死量攻击,表明重组病毒具有明显的免疫保护作用。 相似文献
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以痘苗病毒天坛株为载体的表达单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白D的重组活疫苗的建立 总被引:2,自引:0,他引:2
从我国分离到的一株单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1-168株)病毒基因组中,分离出含有糖蛋白D(gD)基因的1.2kb片段,插入带有痘苗病毒天坛株TK区的质粒pJSB1175P7.5k启动子下游,转染无白血病鸡胚原代细胞,获得带有HSV-1-168gD基因的重组痘苗病毒。此株重组病毒在感染细胞膜上表达HSV-1-168gD糖蛋白抗原,能与特异性单克隆抗体反应。在感染细胞中表达的膜抗原经SDS-PAGE分析,表达分子量为54kD糖蛋白。用Southern杂交分析了重组病毒DNA中特异的gD基因,对作为活疫苗的重组痘苗病毒株进行了一些微生物学活性、免疫原性和毒力等方面的研究。 相似文献
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从我国分离到的一株单纯疱疹病毒I型病毒基因组中,分离出含有糖蛋白D基因的1.2kb片估,插入带有痘苗病毒天坛株TK区的持粒pJSB1175P7.5k启动子下游,转染无白血病鸡胚原供细胞,获得带有HSV-1-168gD基因的重组痘苗病毒。此株重组病毒在感染细胞膜上表达HSV-1-168gD糖蛋白抗原,能与特异性单克隆抗体反应。 相似文献
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用抗单纯疱疹病毒(HSV)型共同性gC和gD单克隆抗体(McAb),包被Eppendorf管,捕捉HSV,同时加入3个引物:一个是HSV-1/HSV-型共同性上游引物,另两个分别是HSV-1和HSV-2型特异性下游引物。借此建立了能直接分型检测HSV的抗原捕获聚合酶链式反应(AC-PCR)。HSV-1的扩增产物为477bp,HSV-2的为399bp,两型病毒经AC-PCR扩增后产生分子量不同的DN 相似文献
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HIV—1 SF2株env基因(120)在大肠杆菌中的表达 总被引:3,自引:0,他引:3
运用基因重组技术,将HIV-1 SF2株编码外膜蛋白gp120的env基因片段与原核载体pBV220进行重组,构建成质粒pBVSF2env,并在大肠杆菌(E.CoilDH10b)中获得表达,经Westemblot反应证实,该重组蛋白与来自HIV-1感染者的血清(含多克隆抗体)发生特异性反应。 相似文献
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单纯疱疹病毒(HSV)Ⅰ型及Ⅱ型之间有很多共同抗原,能引起血清学交叉反应,鉴别诊断比较困难。本实验利用重组DNA技术,将部分HSV-2DNA的PstI片段克隆到载体质粒PSK中,并筛选出两个重组质粒(P和P)只与HSV-2反应,与HSV-1不反应,这两个重组质粒中所含的HSV-2DNA片段大小分别是3.1和4.3kb,另外,还筛选了一个重组质粒(PHSV2-1,含5.8kbHSV-2DNA片段)与HSV-1和HSV-2均反应。将4.3kb的片段用光生物素标记后作为探针检测了159份人阴道拭子,其中23份样品呈阳性反应,其余均为阴性,从23份阳性样品中挑选12价涂片用间接荧光抗体法检测也都呈阳性反应,随机挑选的几份杂交反应阴性样品在间接荧光试验中也是阴性。本实验制备的HSV通用及HSV-2型特异性探针将比常规的血清学方法诊断和鉴别HSV-1和HSV-2感染更为可靠。 相似文献
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人精子膜蛋白片段在沙门氏菌中的表达——一种制备抗生育疫苗的途径 总被引:2,自引:0,他引:2
合成编码一种人精子膜蛋白YWK-Ⅱ胞外区的一段多肽片段的双链寡核苷酸链,HSD-2a。用平端连接的方法将其插入到沙门氏菌鞭毛基因fliC(d)的抗原表位IV高变区EcoRV位点,构建了重组质粒pLS408-H1。重组基因在鞭毛负性aroA基因缺失的无致病性沙门氏菌S.dublin SL5928疫苗菌株中表达。经ELISA、电镜免疫胶体金法检测,表明HSD-2a编码的多肽片段成功地在沙门氏菌鞭毛表面 相似文献
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用人工合成的丁型肝炎病毒抗原(HDV-Ag)肽建立了检测抗HDV-IgM抗体的ELISA方法,本法操作简便、快速,重复性好,特异性强,与抗HAV-IgM、抗Hk-IgM、抗HBs-IgM、抗HCV-IgI、抗CMV-IgM、抗RV-IgM、类风湿因子(RF)及抗核抗体(ANA)阳性血清均不起反应,且可被2-巯基乙醇阻断而不起反应。经初步临床应用,31例正常人血清抗HDV-IgM全部阴性,28例慢活肝患者检出率为32.1%(9/28),17例慢迁肝患者血清阳性率为11.8%(2/17)18例肝癌和肝硬化病人血清阳性率为22.2%(4/18)这三组病人与正常对照者相比较均有显著性差异(P<0.001)。此外,抗HDV-IgM阳性血清的ALT值均明显高于正常参考范围,提示在HDV感染过程中,患者肝细胞进一步受损。实验结果证明,抗HDV-IgM是诊断HDV感染的重要指标,对HDV感染早期诊断具有重要价值。 相似文献
10.
采用免疫组织化学S-P法检测52例手术切除乳腺癌组织c-erbB-2蛋白和HSV-1、HSV-2表达情况。结果发现癌组织中c-erbB-2阳性34例(65.4%);HSV-1阳性38例(73.1%);HSV-2阳性15例(28.8%)。癌旁组织32例,阳性分别为3例(9.4%);12例(37.5%);2例(6.3%)。乳腺癌中c-erbB-2阳性率明显高于癌旁组织。乳腺癌及癌旁的HSV-1阳性率明显高于HSV-2,乳腺癌c-erbB-2阳性组中HSV-1和HSV-2的表达有显著差异,而在阴性组二者无差异,提示乳腺癌的发生可能和HSV-1感染密切相关,c-erbB-2表达也可能和HSV-1感染有关。 相似文献
11.
应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从HCV感染者血清中扩增编码HCV病毒蛋白酶的NS2-NS3cDNA片段,在其5′和3′端分别引入EcoRⅠ和XbaⅠ限制性内切酶位点,定向克隆至真核表达载体pcDNA3,构建重组载体pcDNA-NS23,重组表达载体经限制性内切酶消化鉴定.用SP6和T7通用引物对目的基因片断进行序列分析.序列同源性分析结果表明,与HCV-J、HC-C2有高度的同源性,与HCV-1、HCV-J6、HCV-J8同源性差,提示所克隆的基因属HCVⅡ型.该区内重要的功能位点如Zn2+依赖性金属蛋白酶催化中心、丝氨酸蛋白酶催化中心等均高度保守 相似文献
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对379例良、恶性肝组织进行的免疫组织化学研究显示,33%的慢性迁延性肝炎(6/18)、76%的慢性活动性肝炎(26/34)、92%的肝硬变(57/62)和97%的肝细胞性肝癌(HCC)(58/60)中有HBxAg表达,阳性率高于HBsAg或HBcAg。癌周肝中的HBxAg阳性率显著高于非癌周肝。与其它2种HBV抗原不同,HBxAg表达在细胞类型上有较明显的选择性,在肝小多角细胞(SPLC)、小细胞性不典型增生(SCD)及HCC中较强。与IGFⅡ、c-erbB-2、c-myc和EGF-R表达进行的对照研究表明HBxAg与IGFⅡ和c-erbB-2这2种HCC发生相关基因的表达关系密切。PCNA染色结果显示HBxAg阳性组织的细胞增殖活性显著高于HBxAg阴性组织。我们的结果还表明HBxAg表达与肝细胞不典型增生的发生和进展有关、提出HBVX基因可能通过其表达产物(HBxAg)首先激活IGFⅡ、c-erbB-2基因,继而引起显著的SPLC增生和SCD而参与HCC发生的. 相似文献
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本文利用PCR技术建立一种对HSV直接基因分型的方法。在HSV-Ⅰ、Ⅱ两型的DNA多聚酶基因上设计了一条两型共同的上游引物(HDP-B)和两条型特异的下游引物(HDP-1、HDP-2)。三条引物共同组成一个扩增反应体系,在HSV-Ⅰ产生543bp条带,HSV-Ⅱ产生372bp条带,据此在基因水平上对HSV进行分型。5株不同来源的HSV(2株Ⅰ型,3株Ⅱ型)分型结果与病毒分离及血清学方法完全一致。该 相似文献
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用人工合成的丁型肝炎病毒抗原(HDV-Ag)肽建立了检测抗HDV-IgM抗体的ELISA方法。本法操作简便、快速、重复性好、特异性强,与抗HAV-IgM'抗HBc-IgM、抗HBs-IgM、抗HCV-IgM、抗CMV-IgM、抗RV-IgM、类风湿因子(RF)及抗核抗体(ANA)阳性血清均不起反应,且可被2-巯基乙醇阻断而不起反应。经初步临床应用,31例正常人血清抗HDV-IgM全部阴性,28例慢 相似文献
16.
将编码丙型肝炎病毒(HCV)E2蛋白417~750位氨基酸的DNA片段 克隆到真核表达载体pcDNA 3.1(-)中的CMV IE启动子下游,构建成HCV E2重组真核表达质粒 pcE2。ELISA法检测pcE2 DNA免疫兔血清中的E2抗体变化和维持规律,结果显示免疫20d已有 抗体产生,30d后开始进入高峰,40d时达到最高值,至第90d抗体水平保持平稳,抗体滴度 达到1∶1600左右。流式细胞计数仪(FACS)检测pcE2 DNA免疫鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞变 化情况,与注射空载体pCDNA3.1(-)的阴性鼠相比,CD4+淋巴细胞水平略有上升,CD8+ 细胞水平有较大升高,增幅达35.46%。免疫组化检测结果显示注射pcE2的小鼠组织中有明显 的阳性着色,而注射pcDNA3.1(-)的对照组小鼠免疫组化结果为阴性。以上结果表明:pcE2 在实验动物内表达出的HCV E2蛋白可以引起免疫动物的体液免疫应答和细胞免疫应答,尤其 是MHC-1限制性杀伤性CD8+T淋巴细胞水平的提高对清除 病毒是十分有利的,因此HCV E2 DNA免疫有可能成为预防和治疗HCV感染的一条新途径。 相似文献
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庚型肝炎病毒包膜糖蛋白E2基因在昆虫细胞中的表达 总被引:2,自引:0,他引:2
用PCR扩增出HGVE2全基因,克隆进杆状病毒表达载体pFASTBACHTa中,构建成重组转座载体pFASTBACE2,转化DH10BAC大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性菌落,抽提大分子质粒DNA,获得含HGVE2基因的重组杆状病毒穿梭载体,转染昆虫草地夜蛾Sf9细胞,出现细胞病变后,收集含有重组病毒颗粒的培养上清,重新感染草地夜蛾Sf9单层细胞及甜菜夜蛾幼虫,分别收集Sf9细胞和甜菜夜蛾幼虫体内的血淋巴细胞,进行12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,可见表达的融合蛋白带,经亲和层析进行蛋白纯化,用ELISA方法检测各类血清标本,初步研究HGVE2糖蛋白的抗原性 相似文献
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乙肝前S2(HBVPreS2)肽段由55个氨基酸组成,其N端肽段含Th和B细胞抗原决定簇。我们将化学合成的PreS2epitope(120-145)基因与HBcAg基因不同位点进行融合,融合基因在大肠杆菌中获得表达,并对融合蛋白进行了纯化。经ELISA和Western-blot实验表明,融合蛋白具有PreS2和HBcAg两者的抗原性。此外,研究还表明,强启动子能使表达水平有一定提高。 相似文献
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本文利用PCR技术建立一种对HSV直接基因分型的方法。在HSV-Ⅰ、Ⅱ两型的DNA多聚酶基因上设计了一条两型共同的上游引物(HDP-B)和两条型特异的下游引物(HDP-1、HDP-2)。三条引物共同组成一个扩增反应体系,在HSV-Ⅰ产生543bp条带,HSV-Ⅱ产生372bp条带,据此在基因水平上对HSV进行分型。5株不同来源的HSV(2株Ⅰ型,3株Ⅱ型)分型结果与病毒分离及血清学方法完全一致。该反应体系与其它来源的DNA不产生特异反应,敏感性可达1fg。应用该法对151份临床可疑HSV感染的标本进行检测并分型,结果与免疫学方法完全一致。 相似文献