转反义trxs基因对小麦种子萌发过程中淀粉水解酶的影响

检测转反义trxs基因小麦种子萌发过程中胚乳内α-淀粉酶、β-淀粉酶和支链淀粉酶活性变化的结果表明,在种子萌发4d内,转基因小麦3种酶的活性态酶活性均低于野生型小麦,而3种酶的抑制态酶活性则均高于野生型小麦,转基因小麦淀粉酶的抑制程度高于野生型小麦,这可能是转基因小麦酶活性降低的原因之一。     

反义trxs基因导入对小麦籽粒脱支酶活性的影响

以转反义硫氧还蛋白基因株系01TY34-73-9及其对照品种‘豫麦34’为材料,运用PCR检测和酶活性测定的方法,对转基因株系遗传稳定性以及转基因与对照种子中脱支酶活性进行测定。结果显示:(1)外源基因已经稳定遗传至后代;(2)转基因种子在不同成熟时期和不同萌发过程中的脱支酶活性与对照相比均有不同程度的降低平均降低10.3%,但仅花后25 d到收获后5 d脱支酶活性显著低于对照,其中最低值出现在花后30 d,平均比对照下降了12.0%;(3)在花后30 d和后熟5 d萌发过程中,转基因种子脱支酶活性始终低于对照,平均下降6.2%和22.2%。表明反义trxs基因的导入干扰了小麦trxh基因的表达,使trxh转录量减少,小麦籽粒中脱支酶的活性受抑。     

转反义trxs基因小麦籽粒后熟过程中水解酶活性的变化

以小麦品种'生抗1号'(对照)及其转反义trxs基因纯合株系为材料,测定了它们在种子后熟过程中硫氧还蛋白h(Trxh)、淀粉酶和蛋白酶活性以及呼吸速率等生理指标,以探讨转反义trxs基因小麦籽粒在后熟过程中的生理生化变化规律,为提高小麦耐储性探索有效途径.结果显示,在小麦后熟过程中,转基因小麦籽粒的Trxh活性、淀粉酶活性、蛋白水解酶活性和种子呼吸速率均比对照明显下降;后熟0～30 d,转基因小麦种子的Trxh活性、α-淀粉酶、β-淀粉酶、脱支淀粉酶、蛋白酶活性和种子呼吸速率平均比对照分别降低16.07%、31.64%、6.44%、21.63%、27.67%和52.90%.研究表明,反义trxs基因导入干扰或部分抑制了小麦内源同源基因的表达,致使小麦种子Trxh活性、呼吸速率和水解酶活性降低,从而延缓了籽粒储藏物质的转化速率,提高了小麦种子的耐贮藏性.     

转反义trxs基因小麦株系01TY18遗传分析及抗穗发芽特性

以豫麦18为受体导入反义trxs基因获得的株系01TY18(T0)为材料,运用PCR、实时荧光RT-PCR以及离体整穗发芽的方法,对反义trxs基因在转基因小麦中的遗传稳定性、基因表达和抗穗发芽特性进行了研究.结果表明,8个T1代转基因株系中有6个株系目的基因检测呈阳性,且在以后的世代中能够稳定遗传并呈典型的孟德尔单基因3∶1分离规律;反义trxs基因在6个转基因株系中能够正常表达且表现出显著的抗穗发芽特性.与非转基因对照相比,转基因株系穗粒发芽率和穗发芽度平均分别降低62%(P<0.01)和50.8%(P<0.01).     

用半定量RT—PCR方法分析小麦TaMlo—Alc基因的表达

以小麦稳定表达的肌动蛋白基因(Actin)作为对照,利用半定量反转录聚合酶链式反应(Semi—QRT—PCR)技术,对与抗白粉病有关的小麦(Triticum aestivum L．)TaMlo—Alc基因的表达进行了研究。结果发现：TaMlo—Alc基因在小麦的叶、茎、根中均表达,穗中不表达,在白粉菌(Blumeria graminis(DC．)E．O．Speer f．sp．tritici Em．Marchat,Bgt)诱导不同时间后小麦叶片中的表达稍微有所增强。研究表明,用半定量RT—PCR技术研究小麦基因表达,具有特异性高、操作简便和可靠性强的优点。     

转反义trxs基因小麦株系00T89分子鉴定及抗穗发芽特性研究

以皖麦48为受体导入反义trxs基因已获得00T89第4代(T4)转基因株系,对其进行反义基因的PCR鉴定、相对定量RT-PCR基因表达检测以及抗穗发芽特性研究。结果表明,18个T4代转基因株系中,13个株系目的基因检测呈阳性;成熟期籽粒萌发过程中,8个株系转录水平上mRNA丰度极显著降低(P<0·01),mRNA丰度与穗发芽指标呈显著和极显著的相关性(r=0·7181)。其中6个株系在开花后30d至成熟后10d表现出明显的抗穗发芽特性。与非转基因对照相比,平均穗开始发芽时间推迟2·7d(P<0·01),穗粒发芽率和穗发芽度分别降低35·5%(P<0·01)和47·5%(P<0·01),成熟后25d这些株系又逐渐恢复发芽特性,无显著差异(P>0·05)。     

兔出血症病毒中国株衣壳蛋白基因的克隆和序列分析

应用RT-PCR技术,从兔出血症病毒中国分离株WX84中成功扩增出预期大小为1.7kb的特异性条带,将扩增产物提纯后克隆入pGEMR-T载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,获得了该株病毒衣壳蛋白基因的克隆,序列分析表明扩增的中国株RHDV衣壳蛋白基因片段长度为1 740bp,共编码580个氨基酸.该核酸序列与其它国家报道的多株RHDV序列相互间同源性高达98.2%～99.0%,其推导的氨基酸序列同源性也达98.3%～99.1%,为极度保守片段.     

用半定量RT-PCR方法分析小麦TaMlo-A1c基因的表达

以小麦稳定表达的肌动蛋白基因(Actin)作为对照,利用半定量反转录聚合酶链式反应(Semi-QRT-PCR)技术,对与抗白粉病有关的小麦(TriticumaestivumL.)TaMlo-A1c基因的表达进行了研究。结果发现:TaMlo-A1c基因在小麦的叶、茎、根中均表达,穗中不表达,在白粉菌(Blumeriagraminis(DC.)E.O.Speerf.sp.triticiEm.Marchal,Bgt)诱导不同时间后小麦叶片中的表达稍微有所增强。研究表明,用半定量RT-PCR技术研究小麦基因表达,具有特异性高、操作简便和可靠性强的优点。     

在转基因水稻植株中蜡质基因第1内含子对基因表达影响的分析

为阐明水稻Wx基因第1内含子在整体植株的胚乳发育阶段是否确有增强基因表达的功能,以及弄清高和中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子126个碱基之间有差异的16个碱基中哪几个碱基了该内含子的正常剪接从而降低了基因的表达水平,我们分别用高直链淀粉含量品种的Wx基因翻译起始密码子ATG上游3．1和2．1kb片段与GUS基因编码区融合构建成嵌合质粒,并在此基础上（1）去除嵌合质粒中Wx基因的第1内含子;（2）将嵌合质粒Wx基因的第1内含子中（3．1kb)与中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子有差异的6个碱基以中,低直链淀粉含量的水稻品种的碱基替换。将上述改造过的几种质粒分别转化粳稻品种中花11,测定转化植株未成熟种子胚乳中的GUS活性。结果表明第1内含子的缺失或此内含子的5′端剪接点上的碱基G以T替换均造成GUS活性的急剧下降,说明第1内含子在植株体内的确有增强基因表达的功能,而且在中、低直链淀粉含量的水稻品种中Wx基因第1内含子5′端剪接点上自然存在的G→T突变是造成这些品种中该内含子剪接不正常,从而使Wx基因表达水平和直链淀粉含量下降的主要原因。     

反义磷脂酶Dγ基因转化小麦的研究

目的:获得抗寒、耐盐等能力增强的小麦新种质或新品种。方法:利用穗茎注射法将含有反义磷脂酶Dγ基因(PLDγ)的根癌农杆菌菌液注入到春小麦富硒乌麦旗叶鞘内,T1代经田间表型选择筛选到10株变异株,通过特异PCR扩增和Southern杂交技术对获得的变异株进行分子检测,并对转基因植株进行耐盐性鉴定。结果:变异株均扩增出大小为430bp的目的片段,Southern印迹结果与其一致,证实反义PLDγ基因已经整合到小麦的核基因组中;6株转基因植株的抗寒力比对照显著增强,4株的熟期提早3～4d;在室内耐盐性筛选中,2株变异植株耐NaCl的能力比对照有不同程度的提高。结论:反义PLDγ基因在提高小麦的抗寒、耐盐性上具有很大的应用价值。     

一种快速构建cRNA标准曲线检测基因表达方法的建立

为了建立一种适于实验室乃至常规定量检测mRNA表达的、可快速构建cRNA标准曲线的方法,设计带有T7启动子序列和PolyT序列的引物对目的基因和内参照进行PCR,克隆入载体作为体外合成cRNA的模板,快速构建cRNA标准.结果表明：该曲线的线性范围至少达6个数量级,相关系数为0.99.该法快速、简便,适用于所有靶基因.     

A Microarray-Based Comparative Analysis of Gene Expression Profiles During Grain Development in Transgenic and Wild Type Wheat

Global, comparative gene expression analysis is potentially a very powerful tool in the safety assessment of transgenic plants since it allows for the detection of differences in gene expression patterns between a transgenic line and the mother variety. In the present study, we compared the gene expression profile in developing seeds of wild type wheat and wheat transformed for endosperm-specific expression of an Aspergillus fumigatus phytase. High-level expression of the phytase gene was ensured by codon modification towards the prevalent codon usage of wheat genes and by using the wheat 1DX5HMW glutenin promoter for driving transgene expression. A 9K wheat unigene cDNA microarray was produced from cDNA libraries prepared mainly from developing wheat seed. The arrays were hybridised to flourescently labelled cDNA prepared from developing seeds of the transgenic wheat line and the mother variety, Bobwhite, at three developmental stages. Comparisons and statistical analyses of the gene expression profiles of the transgenic line vs. that of the mother line revealed only slight differences at the three developmental stages. In the few cases where differential expression was indicated by the statistical analysis it was primarily genes that were strongly expressed over a shorter interval of seed development such as genes encoding storage proteins. Accordingly, we interpret these differences in gene expression levels to result from minor asynchrony in seed development between the transgenic line and the mother line. In support of this, real time PCR validation of results from selected genes at the late developmental stage could not confirm differential expression of these genes. We conclude that the expression of the codon-modified A.␣fumigatus phytase gene in the wheat seed had no significant effects on the overall gene expression patterns in the developing seed.     

Simple Identification of Transgenic Arabidopsis Plants Carrying a Single Copy of the Integrated Gene

Transgenic Arabidopsis thaliana plants carrying a single copy of integrated DNA can be identified by single-step genomic polymerase chain reaction. The reaction employs two sets of primer pairs with the same melting temperature that amplify the amplicons derived from the integrated T-DNA together with those from an endogenous single-copy gene as a reference. When the band intensity ratio is one, this means that the transgenic plants are carrying a single copy of the integrated gene per haploid.     

内含子对提高转基因动物基因表达效率的影响

综述了内含子在转基因动物基因表达中的作用,对内源性内含子和异源内含子对转基因表达的影响进行分析,讨论了内含子提高转基因动物基因表达效率的三种可能机制,并指出在表达载体构建中应考虑到内含子的重要性．     

c—Ha-ras在转基因小鼠模型C57-ras各组织中的表达谱分析

目的：分析转基因c-Ha-ras在C57-ras癌症小鼠模型中的组织表达谱及时空表达差异。方法：利用半定量及荧光定量RT-PCR法,分析不同首建鼠系、不同周龄小鼠各脏器中转基因c-Ha-ras的表达。结果：转基因c-Ha-ras在心、肝等13种组织器官中均有表达,在肺脏中表达最高,在肝脏中表达最低,No.2、No.3和No.5等3个首建鼠均呈现相似的变化规律;转基因在No.5首建鼠中表达水平最高,而在同一个首建鼠系中,12周龄时表达高于8周龄和24周龄。结论：转基因c-Ha-ras在各脏器中能高效表达,并间接表明该转基因能稳定遗传,为C57-ras癌症小鼠模型用于新药临床前致癌性评价提了供理论支持。     

外源NO对转基因白桦外源基因表达及DNA甲基化的影响

为探讨外源NO诱导转基因白桦外源基因表达与基因组DNA甲基化之间的关系,本研究分析了NO供体硝普钠（sodium nitroprusside,SNP）对转基因白桦愈伤组织中外源基因BGT转录的影响,并对此过程中基因组DNA甲基化水平、甲基转移酶基因DRM、MET表达量及生理生化指标进行研究。结果表明：2 mmol·L^-1SNP处理后,转基因白桦防御酶活性、丙二醛（MDA）含量显著升高,表明高浓度NO对白桦细胞正常生命活动产生了伤害;甲基转移酶DRM和MET基因上调表达,基因组DNA甲基化水平由10.6%增加到16.5%,外源基因BGT表达量在6 h时显著增加,3 d时仅为对照的0.46倍,说明转基因白桦外源BGT基因的表达对高浓度NO响应明显且受基因组甲基化水平的影响。本研究揭示了转基因白桦外源BGT基因和甲基转移酶MET、DRM基因对高浓度NO的响应模式,分析了基因组甲基化水平及生理生化特征的变化,为转基因植物生长发育的表观遗传调控和外源基因表达影响机制的研究奠定基础。     

基质结合区与转基因动物的基因表达

基质结合区(MAR)在稳定转染的细胞系中的研究结果显示,能缓冲在其侧翼的染色质某些拮抗作用.这为外源基因在染色体中随机整合的转基因动物研究提供了新的方向.文章对其在转基因动物中的探索性研究及可能的机理进行综述.指出在转基因动物中,MAR的应用能导致建立独立的基因活性结构域.它对基因高效表达无疑具有重要作用.MAR可能是一种新的顺式作用元件,与增强子、启动子协同作用调节基因的表达.     

转基因动物的乳腺表达

转基因动物乳腺组织特异性表达异源基因是近年来基因工程中引人注目的途径.文章介绍了这一途径有关的乳汁蛋白基因、乳汁蛋白基因与异源基因的融合方式、重组基因的必要构成以及可能影响高效表达的因素.