双向凝胶电泳技术进展

双向聚丙烯酰胺凝胶电泳按等电点和分子量对蛋白质进行分离,具有很高的分辨率,已经成为蛋白质组研究中的核心技术之一。目前的方法还难以满足真核生物蛋白质组研究的要求。自1975年O'Farrell提出该方法以来,针对应用中常见的一些问题,如样品的增溶及加载,样品的预分级分离,阴极漂移和凝胶上蛋白质的回收等,对这种技术进行了不断的改进。     

板栗疫病菌致病性机理的双向凝胶电泳法研究

双向凝胶电泳技术是蛋白质组学研究的基础性技术平台。如何得到一张高质量的双向凝胶电泳图谱是进行后续研究的关键。为探索适用于板栗疫病菌可溶性总蛋白的最佳提取条件,从蛋白组学角度来探索板栗疫病菌致病性机理,比较了目前在丝状真菌中常用的两种蛋白质提取方法,制备的蛋白质样品经双向凝胶电泳后,在凝胶上呈现的蛋白质斑点的丰度和分布特点。结果表明,两种方法获得的蛋白质主要集中分布在pH4~7的范围内;TCA-丙酮沉淀法得到的图谱分辨率高但是蛋白质总量很少。裂解液-TCA-丙酮沉淀法得到的蛋白质总量较大,通过cleanupkit处理后图谱分辨率可以达到差异蛋白组的要求。随机提取几个银染蛋白点用MALDI-TOFMS/MS进行分析,可以得到高质量的肽质量指纹谱。表明该样品制备方法可以满足蛋白质鉴定的要求。     

双向凝胶电泳的实验操作及进展

双向聚丙烯酰胺凝胶电泳是研究蛋白质组的核心技术,本文重点介绍了双向凝胶电泳的原理、实验操作过程中的具体步骤以及近年来在实验过程中发展的一些新方法和进展。     

一种改进的蛋白质超薄凝胶电泳方法

介绍了一种将聚丙烯酰胺凝胶固定在电泳夹板上的蛋白质电泳方法.通过此方法蛋白质电泳可以在0.4 mm厚的聚丙烯酰胺凝胶上进行.实验证明,经此方法处理的玻板结合凝胶非常牢固,在电泳后的所有处理步骤中都不会发生凝胶脱落现象.     

Smad3基因剔除致骨关节炎小鼠血清蛋白质组双向凝胶电泳分析

Smad3基因剔除导致小鼠骨关节炎,为了进一步深入研究Smad3基因缺失导致骨关节炎形成的分子机制,寻找骨关节炎发生早期的分子变化,用双向电泳技术结合肽质量指纹谱技术对Smad3基因剔除小鼠和野生型小鼠血清蛋白质组进行了初步分析,对其中7个表达差异蛋白质进行了鉴定,并探讨了所鉴定蛋白质与骨关节炎发生的关系,为揭示SMAD3介导的TGF－β信号在骨骼发育中的重要作用提供了线索。     

应用超高分辨双向凝胶电泳技术进行正常人类肝脏蛋白质组研究

肝脏是人体最大的实质器官, 承担着人体许多关键的生理功能, 在生命活动中占有重要地位. 根据人类肝脏蛋白质组计划, 本实验旨在构建人肝脏蛋白质双向凝胶电泳表达谱, 尽可能分离和鉴定更多的蛋白. 在双向凝胶电泳第一向等电聚焦水平上, 从上样方式、水化液配方、聚焦时间等方面优化了碱性蛋白的分离条件, 利用超放大胶分离技术搭建了高分辨的双向凝胶电泳分离平台, 构建了人类肝脏蛋白质2-DE参考谱, 检测到5481个蛋白质点. 这是目前国际上最为全面的人体器官蛋白质组2-DE参考谱, 为其他肝病的研究提供了较好的参照系. 成功鉴定了429个非冗余蛋白, 对pH 4.0~7.0, 5.0~6.0, 5.5~6.7, 6.0~9.0部分蛋白质点在胶上进行了注释, 由此构建了人肝2-DE蛋白质表达谱数据库. 对蛋白质的理化性质、功能及亚细胞定位进行了全面分析. 研究中构建的人类肝脏蛋白质2-DE图谱将为肝脏比较蛋白质组学研究提供参考.     

大鼠背根神经节细胞膜蛋白的提取及双向凝胶电泳分离

为了开展大鼠背根神经节(DRG)细胞质膜蛋白质组学研究,取成年大鼠的背根神经节,用胰蛋白酶和胶原酶等消化处理后经密度梯度离心分离DRG细胞质膜;用裂解液裂解提取膜蛋白并通过双向凝胶电泳将膜蛋白分离.扫描凝胶图谱后进行图像分析,结果表明DRG细胞膜蛋白得到了有效的提取和分离.双向凝胶电泳图谱的建立为进一步进行DRG细胞质膜蛋白质组学的研究提供了重要的基础.     

三种花生幼胚蛋白质提取方法比较研究

植物组织(或细胞)的蛋白质提取效率与效果直接影响蛋白质双向凝胶电泳等实验的结果。为探索建立适用于花生幼胚蛋白质(双向凝胶电泳用)提取的最佳条件,尝试了磷酸缓冲液直接提取法、改良的荔枝胚胎蛋白提取法和Trizol(附加)提取法等3种提取方法,根据蛋白提取得率、试剂成本、双向电泳图谱的质量(蛋白质斑点的丰度、分布特点)进行初步评价。结果表明,磷酸缓冲液直接提取法简单但总体效果较差,改良的荔枝胚胎蛋白提取法综合评价最好,与双向凝胶电泳条件更兼容。     

红色红曲菌蛋白质组双向凝胶电泳体系的建立

红曲菌是一种具有较高食用和药用价值的丝状真菌,能够产生红曲色素、莫纳可林K等多种生理活性物质。通过分析比较培养基、蛋白质裂解液组成以及水化上样条件对双向电泳结果的影响,建立了红色红曲菌蛋白质组的双向凝胶电泳体系,为从蛋白质水平研究红曲菌及其次级代谢产物的生物合成提供依据。结果表明：用YES培养基培养红色红曲菌6 d,TCA 丙酮法提取菌体总蛋白质,蛋白质裂解液组分为8mol/L尿素,2mol/L硫脲,4 % CHAPS,1 % DTT和2 % Bio-lyte,可获得蛋白质样点数量多,清晰度高的双向电泳图像,为进一步研究红曲菌蛋白质组奠定了基础。     

双向凝胶电泳分析小鼠子宫内膜胚泡着床点和着床旁组织蛋白质组

目的 :研究小鼠子宫内膜胚泡着床点和着床旁蛋白质表达图谱及其差异。方法 :用固相pH梯度双向凝胶电泳分离 5d .p .c .(dayspostcoitum)小鼠子宫内膜胚泡着床点和着床旁总蛋白 ,同时分离同龄未交配小鼠子宫内膜总蛋白 ,银染显色 ,PDQuest 2DE软件分析。结果 :图像分析测得三块胶的匹配率达 74 5 %以上 ,在等电点pI 3～ 1 0、分子量 1 4 4～ 75 4kDa范围内分离得未交配小鼠子宫内膜蛋白点大约 81 0个 ,受孕小鼠子宫内膜胚泡着床旁和着床点蛋白质点分别大约为 95 0个和 1 0 4 0个 ,其中至少 90个蛋白点在三种不同的生理状态间有 2倍以上的量变。结论 :在“着床窗口期” ,小鼠子宫内膜特别是着床位点内膜合成更多的蛋白质 ,以适宜胚泡成功地植入。     

双向凝胶电泳中三种蛋白质检测方法的比较

高通量双向电泳是蛋白质组学的核心 ,双向电泳凝胶上蛋白质点的检测方法应具有灵敏度高、线性范围宽和兼容质谱鉴定等优点 .采用差异凝胶电泳 (differencegelelectrophoresis ,DIGE)技术以Cy3(1 (5 carboxypentyl) 1′ propylindocarbocyaninehalideN hydroxysuccinimidylester)和Cy5 (1 (5 carboxypentyl) 1′ methylindodicarbocyaninehalideN hydroxysuccinimidylester)荧光分别标记正常和TNF α处理细胞的蛋白质 ,用Cy2 (3 (4 carboxymethyl)phenylmethyl) 3′ ethyloxacarbocyaninehalideN hydroxysuccinimidylester)荧光标记正常和TNF α处理细胞蛋白质的等量混合样品作为内标 ,混合 3种荧光标记的蛋白质后 ,在同一等电聚焦胶条进行聚焦 ,然后在聚丙烯酰胺凝胶上进行第二向电泳 ,用 3种波长的激光激发扫描得到凝胶图象 ,DIGE中多个样品在同一条件下电泳 ,因而匹配率高 ,且引入内标使蛋白质点的检测与定量更为准确 .DIGE技术与质谱相结合 ,实现了高通量和相对准确定量 .与硝酸银和考马斯亮蓝染色结果相比较 ,DIGE技术具有灵敏度高、线性范围宽和不影响后续质谱鉴定等优点     

用于双向凝胶电泳分析的奶牛乳清蛋白样品制备方法的比较

为建立适用于双向凝胶电泳分析的奶牛乳清蛋白的制备方法,分别比较了直接裂解法、三氯乙酸-丙酮法,Trizol法和2-D clean up kit法对奶牛乳清蛋白提取效率和双向凝胶电泳图谱的影响.用2-D Quant Kit试剂盒测定蛋白浓度,分别用十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳和双向凝胶电泳进行奶牛乳清蛋白的分离.蛋白定量结果表明,2-D clean up kit法产率最高,直接裂解法、三氯乙酸-丙酮法次之,trizol法产率最低;十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,2- D clean up kit法提取的蛋白质量最高;双向电泳图谱分析表明,2-D clean up kit法得到的蛋白图谱与另外3种方法相比,检测到的蛋白点最多,图谱背景清晰,分辨率最高.结果提示,2-D clean-up法相对最适合于双向凝胶电泳分析奶牛乳清蛋白样品的制备,尤其对一些低丰度高分子量蛋白的分离效果较为明显.     

3种不同油桐种仁蛋白质提取方法比较研究

一种有效的蛋白质提取方法是蛋白质双向电泳成功分离的关键。油桐种仁可以用来制取工业用桐油,但其中富含大量的能干扰蛋白质提取的物质,并能影响双向电泳图谱的分辨率。本文中对油桐种仁蛋白质采用丙酮提取（方法A）、苯酚抽提（方法B）以及丙酮—苯酚结合提取（方法C）,并通过蛋白质双向电泳技术对这3种方法的提取效果进行比较研究。结果显示：采用方法C所提取的蛋白质样品,其蛋白浓度高达到8.1 μg·μL^-1;并且该方法对油桐种仁中的高分子量、低分子量蛋白均有较强的提取能力;此外,其蛋白样品经过双向电泳所得到的蛋白质点和图谱分辨率也较其余两种方法好。     

双水相电泳分离蛋白质的研究

近几年来,随着生物技术的迅速发展,制备型电泳技术的研究得到了重视。然而由于技术上的原因,大规模的制备型电泳技术的研究还未能取得突破。阻碍电泳放大的一个主要问题是由于电加热作用而导致的热对流对电泳分离的破坏。为解决这一问题,人们提出了许多方法。例如,在太空的微重力环境下进行电泳,应力稳定自由流动电泳,循环等电聚焦和区带电泳,色谱电泳和等电膜等电聚焦等。这些方法在电泳放大上都取得了一定的进展,但各有其局限性。最近,Clark提出利用双水相的液液界面阻止热对流的设想,为开发大规模的制备型电泳技术开辟了一条新途径、Raghava Rao等在两种双水相体系上施加电场后成倍地缩短了分相时间。Levine和Bier采用U型管电泳装置研究了双水相体系中血红蛋白的电泳迁移率,观测到界面有阻滞作用。Clark在柱型电泳装置中进行了一组双水相萃取肌红蛋白的简单实验。在10mA的恒电流下电泳40min之后,肌红蛋白的分配系数为7.5,而当电场反向后,分配系数变为0.04,界面阻力并不显著,两者结论并不一致。     

家蚕雌性附腺及其Ng突变体蛋白质组双向电泳图谱分析

分别对家蚕(Bombyx mori．L)正常及Ng突变体雌蛾件附腺分泌部组织的蛋白质进行提取,并采用双向凝胶电泳和计算机辅助分析方法,对提取的蛋白质混合物进行分离和比较分析。用银染的方法,平均每张电泳图谱可以分离约700个蛋白质点,其中大部分的蛋白质点分布在pH4～8范围内,在分子量上主要集中在30～70kD区域：比较分析发现,有4种蛋白只在正常性附腺组织中特异表达,而有2种蛋白只在Ng突变体的组织中特异表达。另外约有29种蛋白在正常性附腺分泌部组织中的表达水平明显高于Ng突变,而约有15种蛋白在Ng突变体的分泌部组织中表达水平较高。这些差异蛋白质可能与Ng突变的形成和导致这种突变体的性附腺不能正常分泌粘性蛋白的性状有关。     

棉花纤维蛋白质3种提取及二维电泳方法的比较

高质量的蛋白样品制备是进行二维电泳的先决条件.棉花纤维中含有纤维素、多酚、多糖等严重干扰二维电泳的物质, 增加了蛋白提取和二维电泳的难度.分别采用3种提取植物组织蛋白的方法(水法、酚法和尿素法), 提取棉纤维总蛋白, 进而进行了二维电泳分析.在蛋白产量、蛋白纯度和电泳图谱等方面对3种方法进行了比较, 结果采用酚法提取的样品取得了较好的电泳图谱, 有望成为从棉纤维样品中提取总蛋白的可选方法.     

线虫surface coat proteins提取方法的建立与双向电泳分析

目的:建立一套适用于蛋白质双向电泳体系的线虫surface coat proteins(SCPs)样品制备技术,为今后研究线虫surfacecoat蛋白质组学及线虫病理生理学奠定基础.方法:以秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)为研究材料,对比和分析不同的蛋白提取沉淀方法,进而采用SDS-PAGE电泳技术和双向电泳技术对所提蛋白进行评价.结果:通过35%乙醇结合TCA-丙酮沉淀法获得的质量较好的线虫SCPs,在12%的SDS-PAGE分析中该法提取的蛋白背景浅,蛋白条带多且清晰尖锐,含有丰富的蛋白信息量.通过双向电泳分析,可从提取的蛋白中鉴定出清晰蛋白点400多个.随机选择5个蛋白斑点,进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定,鉴定得到高度匹配的已知线虫蛋白质2个.结论:所建立的方法可为今后研究线虫surface coat蛋白质组学及线虫病理生理学提供重要工具.     

植物叶片蛋白质双向电泳技术的改进与优化

通过对传统的双向电泳方法进行改进与优化,得到了一种适合于分析植物叶片蛋白质的双向电泳新方法。用改进后的方法对水稻不同时期成熟叶片蛋白质进行双向电泳分离,结果显示其稳定性和重复性好,分辨率较高,经考马斯亮蓝染色后可分辨出３００多个蛋白质（肽）点。它们的等电点和分子量主要分布于ｐ＊４．１－８．２和１０－１００ｋＤａ之间,本还就实验过程中出现的一些技术问题进行了讨论。     

Isolation of PGP 9.5, a New Human Neurone-Specific Protein Detected by High-Resolution Two-Dimensional Electrophoresis

Protein gene product (PGP) 9.5 is a new brain-specific protein originally detected by high-resolution two-dimensional electrophoresis of the soluble proteins of human brain and other organs. We have purified this protein from human brain and raised a rabbit antihuman PGP 9.5 antiserum. The protein has a monomer molecular weight of approximately 27,000 and is present in brain at concentrations at least 50 times greater than in other organs. Immunoperoxidase labelling has localised PGP 9.5 to neurones in the human cerebral cortex with no evidence of staining of glial elements. PGP 9.5 is estimated to be present in brain at concentrations of 200-500 micrograms/g wet weight and represents a major protein component of neuronal cytoplasm. This new neurone-specific cytoplasmic marker may prove useful in studies of neuronal development and in the detection of neuronal damage in disease of the nervous system.     

适用于双向电泳分析的水稻悬浮细胞外分泌蛋白提取方法

目的:建立适用于双向电泳分析的水稻悬浮细胞外分泌蛋白提取方法。方法:采用酚抽提结合甲醇醋酸铵沉淀法、三氯乙酸-丙酮沉淀法和硫酸铵沉淀等3种方法制备水稻悬浮细胞外分泌蛋白,并进行双向电泳分析;利用Western印迹对候选方法提取的外分泌蛋白进行纯度检测。另外,还利用质谱技术对从双向电泳胶上随机挑选的9个蛋白点进行测定,并用SignalP 3.0 Server对测定的蛋白点进行信号肽预测。结果:酚抽提结合甲醇醋酸铵沉淀法提取的外分泌蛋白得率最高,且双向电泳图谱清晰,并能检测到最多的蛋白点;Western印迹表明利用该法所提取的外分泌蛋白未被细胞内蛋白质污染。利用质谱技术鉴定了随机挑选的9个蛋白点,SignalP 3.0 Server分析表明其中6个蛋白含有信号肽。结论:酚抽提结合甲醇醋酸铵沉淀法是一种适用于双向电泳分析的水稻悬浮细胞外分泌蛋白提取方法。