海洋来源节菱孢菌ZSDS1-F3中PKS-NRPS类天然产物挖掘

【目的】以基因组信息为指导,定向激活海洋来源真菌Arthrinium arundinisZSDS1-F3中沉默的聚酮合成酶-非核糖体肽合成酶(PKS-NRPS)类生物合成基因簇,鉴定次级代谢产物结构。【方法】通过启动子工程和异源表达的策略激活实验室培养条件下沉默或低表达的生物合成基因簇,实现目标化合物的分离,通过HR-ESI-MS和NMR数据分析鉴定产物结构,结合基因重组和生物信息学分析结果推导化合物的生物合成途径。【结果】依据基因组生物信息学分析,从海洋来源真菌A. arundinis ZSDS1-F3中选取一个编码PKS-NRPS类次级代谢产物的生物合成基因簇开展研究,在宿主Aspergillus nidulansA1145中实现了基因簇的异源表达,从中分离到2个新化合物,并推导了其生物合成途径。【结论】基因组信息指导下的天然产物挖掘,可以目标明确地分离产物,加快真菌中新颖天然产物的发现步伐。     

茎瘤芥根际一株产紫色杆菌素杜擀氏菌的分离鉴定及其基因组分析

【目的】对茎瘤芥根际微生物进行分离鉴定,分析微生物菌群构成,选择具有优良特性的菌株,评估其次级代谢产物合成能力,为茎瘤芥根际微生物多样性和菌种资源的挖掘利用奠定基础。【方法】采集重庆市涪陵区二渡村和邓家村的茎瘤芥根,分离培养根际微生物菌株,通过菌株形态观察和看家基因的序列分析,对菌株进行初步鉴定、归类和保存。选择具有优良性状的菌株,利用Pacbio RS II和Illumina HiSeq平台完成全基因组测序,通过antiSMASH分析评估其次级代谢产物合成潜力,克隆目的基因簇并进行异源表达和产物鉴定。【结果】分离得到256株微生物,初步鉴定120株;从中鉴定了一株产紫色杆菌素的杜擀氏菌BjR8,完成了基因组测序及分析,发现该菌基因组为一条环状染色体,全长7 205 593 bp,GC含量为64.67%,含有6 241个编码基因。生物信息学分析发现基因组含有9个次级代谢产物生物合成基因簇,其中7个基因簇与已知化合物编码基因簇同源性较低,说明该菌具有产生多种新型次级代谢产物的潜力;克隆得到紫色杆菌素生物合成基因簇,并在变铅青链霉菌TK23中完成了异源表达。【结论】从茎瘤芥根际分离得到25...     

基于基因组挖掘的农抗120活性成分制霉菌素和丰加霉素的发现和鉴定

【目的】分析刺孢吸水链霉菌北京变种(农抗120产生菌)基因组和次级代谢产物组分,研究并鉴定农抗120产生菌中未被发现的活性组分。【方法】利用antiSMASH在线分析农抗120产生菌Streptomyces hygrospinosusvar.beijingensis基因组信息,锁定可能的制霉菌素和丰加霉素生物合成基因簇。利用HPLC和LC-MS等分析方法对农抗120产生菌发酵产物进行分析,同时利用制霉菌素和丰加霉素标准品作为对照,以鉴定该菌株代谢组分中的次级代谢产物。此外,通过构建目标基因簇大片段缺失突变株,并对所得突变株发酵产物进行检测,以确定生物合成基因簇与目的代谢产物的对应关系。【结果】本研究综合利用基因组序列分析、基因缺失突变株构建以及代谢产物检测方法,鉴定了农抗120产生菌中制霉菌素和丰加霉素两种活性成分,并确定了负责这些化合物合成的基因簇。【结论】本研究所构建的多重基因簇失活突变株为挖掘刺孢吸水链霉菌北京变种更多的天然次级代谢产物奠定了基础。     

链霉菌Streptomyces antibioticus NRRL 8167中Naphthgeranine A生物合成基因簇的分析鉴定

【背景】微生物来源的天然产物是小分子药物或药物先导物的重要来源。对链霉菌Streptomyces antibioticus NRRL 8167的基因组分析显示,其包含多个次级代谢产物的生物合成基因簇,具有产生多种新化合物的潜力。【目的】对链霉菌S. antibioticus NRRL 8167中次级代谢产物进行研究,以期发现结构新颖或生物活性独特的化合物,并对相应产物的生物合成基因簇和生物合成途径进行解析。【方法】利用HPLC图谱结合特征性紫外吸收和LC-MS方法,排除S. antibioticus NRRL 8167产生的已知化合物,确定具有特殊紫外吸收的化合物作为挖掘对象,然后利用正、反相硅胶柱色谱、高效液相色谱等技术对次级代谢产物进行分离纯化,分离化合物。利用质谱及核磁共振光谱技术对化合物结构进行解析和鉴定;提取链霉菌S. antibioticus NRRL 8167基因组DNA,利用PacBio测序平台进行基因组测序;利用生物信息学对基因组进行注释,并对合成该化合物的基因簇进行定位分析,推导其生物合成途径。【结果】确定这个化合物是NaphthgeranineA,属于聚酮类化合物。全基因组序列分析发现S.antibioticusNRRL8167基因组含有28个次级代谢产物生物合成基因簇,其中基因簇20可能负责Naphthgeranine A的生物合成,并对其生物合成途径进行了推导。【结论】基于紫外吸收光谱和质谱特征,从S. antibioticus NRRL 8167菌株的发酵提取物中分离鉴定了一个聚酮类化合物Naphthgeranine A。该菌株的全基因组测序为其生物合成基因簇的鉴定提供了前提,对Naphthgeranine A生物合成基因簇和生物合成途径的推测为进一步研究这个化合物的生物合成机制奠定了基础。     

内生真菌X1-2次级代谢产物研究

在从神农架地区特有植物内生真菌中寻找各种活性次级代谢产物的过程中,从濒危植物珙桐叶片中分离得到一株内生真菌X1-2。经过高效液相色谱(HPLC)和薄板色谱(TLC)分析其固体发酵产物多样性,通过正相硅胶柱层析、重结晶、高效液相色谱制备等手段纯化次级代谢产物,从该真菌中分离获得四个次级代谢产物。经核磁共振波谱(NMR),质谱(MS)等波谱学方法鉴定其结构,四个化合物分别为icosalide A1(1),militarinone A(2),(+)-N-deoxymilitarinone A(3),β-hydroxytetradecanoyl-β-hydroxyl tetraecanoyl-Rha-Rha-C_(14)-C_(14)(4),其中icosalide A1(1),militarinone A(2),(+)-N-deoxymilitarinone A(3)为三个复杂的生物碱类化合物,而化合物4是首次从真菌中获得。     

湛江高桥红树林沉积物放线菌多样性及其中一株链霉菌产生的germicidins类化合物的鉴定

【目的】从3种红树林植物根际沉积物中分离和鉴定放线菌,进行抑菌活性初筛获得目标菌株并研究其次级代谢产物。【方法】使用5种培养基对红树林植物根际沉积物放线菌进行分离,采用16S rRNA基因序列比对的方法研究沉积物中的放线菌多样性,结合抑菌活性筛选获得目标菌株后进行放大规模发酵和分离鉴定次级代谢产物,根据生物合成基因簇定位和分析对化合物的生物合成途径进行推导。【结果】从3种红树林植物根际沉积物中分离得到放线菌49株,包括链霉菌属(Streptomyces)31株、小单孢菌属(Micromonospora)14株、小双孢菌属(Microbispora)、链孢子囊菌属(Streptosporangium)、野野村氏菌属(Nonomuraea)和糖单孢菌属(Saccharomonospora)各1株。获得粗浸膏抑菌活性较好的菌株Streptomyces sp. SCSIO 40067,从中分离鉴定了6个α-吡喃酮类化合物：germicidin A–C、germicidin I和isogermicidin A–B,并首次报道了germicidin A的晶体结构。从菌株SCSIO 40067基因组...     

卡伍尔氏链霉菌NA4的Ⅱ型聚酮基因簇的靶向激活及其产物鉴定

【目的】以基因组信息为导向,定向激活海洋来源卡伍尔氏链霉菌（Streptomyces cavourensis） NA4中沉默的Ⅱ型聚酮类次级代谢产物生物合成基因簇,鉴定新产生的次级代谢产物的结构和抑菌活性。【方法】通过添加启动子和敲除负调控基因的方法激活实验室培养条件下沉默或低表达的生物合成基因簇,并完成目标化合物的分离与纯化,通过电喷雾质谱（electrospray ionization-mass spectrometry,ESI-MS）和核磁共振（nuclear magnetic resonance,NMR）数据分析鉴定目标化合物结构,对目标化合物进行抑菌活性鉴定,基于生物信息学信息推导化合物的生物合成途径。【结果】根据基因组生物信息学分析,从海洋来源链霉菌Streptomyces cavourensis NA4中选取一个编码PKSⅡ型次级代谢产物的生物合成基因簇开展研究,成功激活目标基因簇,从中分离到1个PKSⅡ型化合物,推导了其生物合成途径并进行了抑菌活性鉴定。【结论】基因组导向下的天然产物挖掘,可以目标明确地分离产物,充分挖掘链霉菌编码次级代谢产物的潜力。     

北桑寄生内生真菌的分离及其次级代谢产物分析

首次对药用植物北桑寄生叶片中的内生真菌进行分离纯化,从中筛选出具有较高生物活性的菌株,鉴定此菌株并对其次级代谢产物进行初步分离。采用组织块法分离内生真菌,对其进行抗氧化活性和抑菌活性筛选;通过形态学和分子生物学方法鉴定其种属;运用柱色谱、重结晶等方法分离次级代谢产物,波谱学鉴定其结构。从北桑寄生叶片中分离纯化得到29株内生真菌,检测得到一株具有较高抗氧化和抑菌活性的菌株,鉴定为Alternaria alternata,从该菌次级代谢产物中首次分离得到3个单体化合物,分别为alternariol-5-O-methyl ether(1)、alternariol(2)、cis,cis-9,12-octadecadienoic acid(3)。化合物1和2具有较弱的抗氧化活性,化合物1和3表现出一定的抑菌活性。     

洛伐他汀工业菌株土曲霉HZ01的次级代谢产物合成分析

【目的】分析洛伐他汀工业生产菌株土曲霉HZ01的次级代谢产物合成能力,为后期的遗传改造、次级代谢产物及其基因簇挖掘提供指导。【方法】对洛伐他汀发酵条件下的样品进行了转录组分析,同时运用色谱分离技术及波谱学方法对主要次级代谢产物进行了分离和结构鉴定。【结果】洛伐他汀合成相关基因转录水平非常高,还有4个聚酮合酶(PKS)、6个非核糖体多肽合成酶(NRPS)和1个PKS-NRPS杂合酶基因进行了转录,其他PKS和NRPS基因都处于沉默状态。此外,从该菌的发酵产物中分离鉴定了10个主要副产物并确定了其结构。【结论】土曲霉HZ01是一株优良的洛伐他汀生产菌株,在构建次级代谢产物异源合成细胞工厂和鉴定次级代谢产物生物合成途径方面具有很好的应用潜力。     

链霉菌次级代谢产物高产菌株的构建策略

随着基因测序技术的发展,人类获得了大量有关链霉菌次级代谢产物合成基因簇的信息,通过合理的构建策略可以激活其中的隐性基因簇或提高基因簇的表达水平,从而获得新的链霉菌次级代谢产物,或显著提高已知次级代谢产物的发酵水平。从基因表达调控、转座子突变、合成生物学方法、组学方法等四个方面,综述了提高链霉菌次级代谢产物产量的构建策略及其研究进展。     

罗伯茨绿僵菌中嘧啶前体合成酶基因MrThi12的功能研究

通过同源基因比对,在罗伯茨绿僵菌中找到了单拷贝的嘧啶前体合成酶基因MAA_02402,命名为MrThi12。该基因MrThi12全长1 234bp,cDNA序列全长1 029bp,编码342个氨基酸。构建同源重组载体,利用农杆菌介导的方法进行基因敲除。突变菌株在维生素B1缺乏的培养基上,生长很慢,菌丝形态异常,多分叉,完全不能产生气生菌丝和分生孢子。但是一旦有外源维生素B1时,生长状态能完全恢复,对家蚕的致死能力没有变化。     

组蛋白甲基化与去乙酰化对蛇足石杉内生真菌盘长孢状刺盘孢合成石杉碱甲的影响

以蛇足石杉Huperzia serrata内生真菌盘长孢状刺盘孢Cg01菌株为研究对象,利用PEG介导的同源重组转化体系,对Cg01组蛋白甲基化酶基因（histone methyltransferases,HMT）CgClr4和组蛋白去乙酰化酶基因（histone deacetylase,HDAC）CgClr3、CgSir2进行基因敲除与回补,并通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测了回补株中对应基因表达量以及高效液相色谱HPLC检测突变体菌株中石杉碱甲huperzine A（HupA）产量。结果显示3个基因敲除突变体菌株ΔCgClr4、ΔCgClr3、ΔCgSir2的HupA产量分别为255μg/L、270μg/L、244μg/L,与野生型菌株相比分别下降了21.3%、16.6%、24.7%。在基因回补突变体菌株ΔCgClr4/CgClr4、ΔCgClr3/CgClr3、ΔCgSir2/CgSir2中,相应回补基因表达均与野生型无显著性差异,其HupA产量分别为351.9μg/L、334.7μg/L、331μg/L,回补菌株的HupA产量回复到野生型水平。结果表明这3个基因均具有调控内生真菌盘长孢状刺盘孢Cg01合成HupA的作用,为研究蛇足石杉内生真菌中石杉碱甲的合成调控机制提供了理论基础和新的思路。     

中国西南高黎贡山绿僵菌物种多样性及其垂直分布特征

云南高黎贡山具有多样化的生态系统和生物资源。为探清该地区绿僵菌属(Metarhizium)真菌的物种多样性及其不同海拔的垂直分布特征, 沿海拔梯度(600-3,800 m)在7种典型植被类型(I: 干热河谷; II: 季风常绿阔叶林; III: 暖性针叶林; IV: 中山暖性常绿阔叶林; V: 山地苔藓矮林; VI: 寒温性灌丛或草甸; VII: 流石滩稀疏植被)中调查绿僵菌资源。从生境土壤中分离菌株, 通过多基因(nrSSU、nrLSU、EF-1α、RPB1和RPB2)系统发育分析进行物种鉴定。结果表明, 高黎贡山绿僵菌物种资源丰富, 获得的161株菌株分属于12个物种(Metarhizium rileyi, M. viridulum, M. lepidiotae, M. brunneum, M. pingshaense, M. anisopliae, M. robertsii, M. guizhouense, M. indigoticum, M. pemphigi, M. campsosterni和Metacordyceps neogunnii), 其中M. indigoticum为中国新记录种, M. anisopliae complex中的物种(8种)较集中; 同时还采集到了绿僵菌的近缘属Nigelia属物种N. martiale。高黎贡山绿僵菌广泛分布于除类型VII (海拔3,600-3,800 m)外的6种植被类型(海拔600-3,400 m)中。中低海拔植被类型(I-IV)中菌株数量较多(≥23株)、物种多样性较高(4-9种), 而高海拔植被类型(V-VI)中菌株数量较少(2-8株)、物种较单一(1-2种)。中海拔的常绿阔叶林中绿僵菌资源最丰富, 其中季风常绿阔叶林(植被类型II)中的菌株数量(52株, 占总数的32.3%)和物种数(9种)最多; 中山湿性常绿阔叶林(植被类型IV)为其次(47株, 占总数的29.2%; 7种)。高黎贡山绿僵菌优势种现象明显, M. brunneum为最优势物种, 其菌株数占总数的46.6%, 在生境条件差异很大的6种植被类型(I-VI)中都存在, 说明该物种生态适应能力最强。     

海绵共生真菌产黄青霉LS16抗菌活性物质的分离及结构鉴定

海洋真菌能够产生大量活性独特的次级代谢产物。为了探明海绵共生真菌产黄青霉LS16发酵液中抗副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus的活性物质,本实验对副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus的抑菌活性进行跟踪,采用VLC（vacuum liquid chromatography）、Sephadex LH-20柱层析、薄层层析和高效液相色谱等技术,从海绵共生真菌LS16乙酸乙酯发酵液中分离纯化得到5个化合物。进一步实验证明,化合物2具有抗副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus活性。根据该化合物的波谱数据（¹H NMR、¹³C NMR）对其化学结构进行鉴定,确定其分子式为C₁₅H₁₅NO₃,为生物碱类化合物。     

新古尼异虫草内菌核的多菌定殖现象

基于高通量测序技术,对采自中国江西省宜丰县杨柳镇、贵州省石阡县白沙镇、贵州省湄潭县、贵州省凤岗县和贵州省施秉县5个不同地区的新古尼异虫草Metacordyceps neogunnii的真菌生态位进行研究。结果显示,新古尼异虫草生境土壤、菌表及其内菌核的真菌类群共涉及子囊菌门Ascomycota、担子菌门Basidiomycota、接合菌门Zygomycota、类原生动物门Rozellomycota 4个门及一些未定门的真菌;共17纲、43目、77科、129个属的177种真菌。在属的水平上,新古尼异虫草生境土壤（Cg1）的优势属为被孢霉Mortierella,相对丰度为84.86%,其次是分类地位未定的真菌（4.58%）,毛壳菌科Chaetomiaceae 1属（1.22%）;虫草菌表（Cg2）的优势属或种为新古尼异虫草M. neogunnii（83.66%）,其次是粉红螺旋聚孢霉Clonostachys rosea（9.48%）,帚枝霉属Sarocladium（2.07%）和被孢霉属（1.12%）。而来自江西（JX）、石阡（SX）、凤岗（FG）、施秉（Cg3）4个不同地区的新古尼异虫草样本的内菌核优势属真菌均为新古尼异虫草,其相对丰度分别为：99.74%、99.50%、99.73%和98.82%,其余属相对丰度均小于1%。来自湄潭的干标本内菌核优势属为麦角菌科Clavicipitaceae的一个未定属,相对丰度则高达99.97%。综上结果表明,来自5个不同地区的新古尼异虫草种群的内菌核中不仅是新古尼异虫草M. neogunnii,同时有其他真菌存在。施秉样本周围的土壤真菌群落较虫草样本内菌核具明显的多样性。但有趣的是,采集虫草的土壤中不含新古尼异虫草,而具有相对丰度较大的被孢霉Mortierella spp.和木霉Trichoderma spp.。来自湄潭的干标本,不含新古尼异虫草而是相对丰度较高的麦角菌科Clavicipitaceae一未知成员,其分类地位值得进一步研究。     

梯棱羊肚菌镉胁迫响应基因ATX1功能分析

梯棱羊肚菌Morchella importuna是一种可以大田覆土栽培的珍稀食用菌,而土壤重金属污染状况日益严重,对梯棱羊肚菌菌丝生长和子实体产品质量安全构成了潜在的威胁。本研究先采用镉离子胁迫处理梯棱羊肚菌菌丝体,RT-PCR检测发现候选基因ATX1的表达量显著下调。克隆梯棱羊肚菌ATX1基因,对ATX1p蛋白结构进行功能预测,发现ATX1p可能与铜离子转运及重金属胁迫相关。然后分别构建ATX1的超表达和RNAi基因沉默载体,采用农杆菌介导的转化方法,将其转入梯棱羊肚菌同核体菌株A50中,分别筛选到4个ATX1表达显著上调的超表达转化子和4个ATX1表达显著下调的RNAi基因沉默转化子,镉敏感性检测发现ATX1的RNAi基因沉默转化子表现为镉抗性增强,而ATX1超表达转化子则表现为镉抗性减弱。结果表明,梯棱羊肚菌ATX1基因表达与镉抗性呈负相关,ATX1p可能在梯棱羊肚菌镉胁迫响应过程中发挥着某种重要作用。     

精胺合成酶MrSPS参与调控罗伯茨绿僵菌的生长发育、抗逆和致病力

本研究以罗伯茨绿僵菌Metarhizium robertsii为研究对象,针对鉴定出的精胺合成酶基因(MAA_02088, Mrsps),利用农杆菌介导的同源重组方法获得Mrsps敲除株ΔMrsps。与野生型相比,ΔMrsps营养生长和产孢能力下降,对氯化钠和紫外照射耐受性增强。大蜡螟幼虫毒力分析表明,浸渍和注射两种情况下ΔMrsps致病力降低,半致死时间(LT₅₀：6.71和4.75 d)比野生型(LT₅₀：5.17和4.19 d)显著增加。Mrsps敲除后不影响附着胞形成率和蝉翅穿透能力,但会显著下调昆虫血腔定殖相关基因的表达量。这些结果说明精胺合成酶MrSPS参与调控罗伯茨绿僵菌的生长发育、外界胁迫应答和致病力。     

过表达GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶（GMP）基因提高灵芝多糖的生产

灵芝多糖是灵芝的主要生物活性成分之一,具有多种药理活性,但灵芝多糖的低产量限制了其广泛应用。相关研究表明,灵芝中过表达多糖生物合成相关基因能够提高多糖产量,但过表达GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶（GMP）基因提高灵芝多糖产量未有报道。本研究克隆获得了灵芝gmp基因,并成功构建出了过表达gmp基因的工程菌株（GMP菌株）,同时对野生型菌株（WT）和GMP菌株的胞内多糖（IPS）、胞外多糖（EPS）产量以及GDP-甘露糖合成相关基因甘露糖磷酸变位酶1（PMM1）基因及甘露糖磷酸变位酶2（PMM2）基因的表达水平进行了检测。研究结果表明,在悬浮发酵培养条件下,灵芝中gmp基因的过表达增加了灵芝多糖的积累。与WT菌株相比,GMP菌株的EPS以及IPS的含量最高达到了0.991g/L和21.59mg/100mg干重,比WT菌株分别提高了21.1%和19.5%。gmp基因的过表达也提高了基因pmm1和pmm2的表达。与WT菌株相比,GMP菌株中pmm1以及pmm2基因的表达水平分别上调了2.87倍和2.55倍。研究结果表明,过表达gmp基因是一种提高灵芝多糖产量的有效方法,并且过表达gmp基因提高了灵芝多糖的合成及pmm1和pmm2基因的表达。     

Cycloaspeptide A and pseurotin A from the endophytic fungus Penicillium janczewskii

Penicillium janczewskii K. M. Zalessky was isolated as an endophytic fungus from the phloem of the Chilean gymnosperm Prumnopitys andina. When grown in liquid yeast extract-malt extract-glucose broth, the fungus produced two main secondary metabolites. The compounds were for the first time isolated from this species and identified by spectroscopic methods as pseurotin A and cycloaspeptide A. This is the first report on the production of cyclic peptides by endophytic fungi from Chilean gymnosperms. Pseurotin A and cycloaspeptide A presented low cytotoxicity towards human lung fibroblasts with IC50 > or = 1000 microM. Pseurotin A showed a moderate effect against the phytopathogenic bacteria Erwinia carotovora and Pseudomonas syringae, with IC50 values of 220 and 112 microg ml(-1), respectively.     

Tangeretin inhibits fungal ferroptosis to suppress rice blast

Flavonoids are polyphenolic secondary metabolites that function as signaling molecules, allopathic compounds, phytoalexins, detoxifying agents and antimicrobial defensive compounds in plants. Blast caused by the fungus Magnaporthe oryzae is a serious disease affecting rice cultivation. In this study, we revealed that a natural flavonoid, tangeretin, substantially delays the formation of M. oryzae appressoria and blocks the development of blast lesions on rice plants. Our data suggest that tangeretin has antioxidant activity that interferes with conidial cell death/ferroptosis, which is critical for M. oryzae pathogenicity. Tangeretin showed a ferroptosis inhibition efficacy comparable to the well-established liproxstatin-1. Furthermore, overexpression of the NADPH oxidases NOX1 or NOX2 significantly decreased sensitivity toward tangeretin treatment, suggesting Nox-mediated lipid peroxidation as a possible target for tangeretin in regulating redox signaling and ferroptosis in M. oryzae. Our nursery and field tests showed that application of tangeretin can effectively mitigate overall disease symptoms and prevent leaf blast. Our study reveals the plant-derived fungal ferroptosis inhibitor tangeretin as a potential and novel antifungal agrochemical for the sustainable prevention of the devastating blast disease in important cereal crops.