spindlin1基因的原核表达及多克隆抗体制备

目的:明确人新基因spindlin1的组织表达谱、相互作用蛋白。方法与结果:应用PCR技术获得spindlin1的开放读框,并将其插入原核表达载体pGEX-2T,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,融合蛋白GST-Spindlin1获得了可溶性表达。用SDS-PAGE胶上的目的条带做抗原制备了多克隆抗体,进行了抗体纯化。结论:spindlin1在OVCar3细胞中可能以二聚体形式存在,这一现象还有待于进一步研究。     

牛樟芝倍半萜合酶基因克隆及在不同培养基中的表达

牛樟芝(Antrodia camphorata)是一种珍稀食药用菌,能产生具有抗癌活性的倍半萜类化合物。对牛樟芝基因组进行分析,获得倍半萜合酶基因序列并设计特异引物,提取在Glu培养基(麦芽浸粉6 g/L,酵母提取物3 g/L,葡萄糖40 g/L)上生长的牛樟芝菌丝体的RNA,利用RT-PCR技术克隆得到倍半萜合酶基因AcTPS1。AcTPS1基因c DNA全长为969 bp,编码323个氨基酸,根据系统进化树可知AcTPS1氨基酸序列与其他9种真菌倍半萜合酶聚为一类。AcTPS1拥有典型倍半萜合酶的结构域(RRSRSATAEAYACFIW),之后检测AcTPS1在不同培养基上的菌丝中的表达结果显示不同碳源中,只有葡萄糖作为碳源时该基因表达,不同氮源中,以番茄浸粉和酪蛋白胨为氮源时该基因表达。说明AcTPS1是一类诱导型表达的基因。为利用发酵培养以及异源表达手段获得牛樟芝活性化合物提供参考。     

虹鳟生长激素cDNA在酵母中的表达

采用聚合酶链式反应（ Ｐ Ｃ Ｒ） 技术对虹鳟生长激素ｃ Ｄ Ｎ Ａ 进行改造。将改造后的基因克隆到含酵母 Ｐ Ｇ Ｋ 启动子的大肠杆菌酵母穿梭质粒ｐ Ｍ Ａ９１ ,转化酿酒酵母 Ｙ３３ ,构建表达鱼生长激素的酵母工程菌 Ｙ３３（ｐ Ｍ Ａｒ Ｇ Ｈ１６） ,并在酵母中获得表达,表达量约占细胞可溶性蛋白总量的３ ％ 。表达产物作为饲料添加剂投喂罗非鱼,具有明显的促进生长作用     

虹鳟mc1r基因的克隆、序列分析及在 不同发育阶段和组织的表达分析

黑素皮质素1受体基因(mc1r)是控制动物色素合成的重要基因,为探讨mc1r基因与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)体色变异的关系,本研究利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得虹鳟mc1r基因的cDNA全长序列,并对其编码的蛋白进行了生物信息学分析,同时利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析该基因在野生型虹鳟(虹鳟)和黄色突变型虹鳟(金鳟)体色发生不同时期(从受精期至12月龄)及成鱼背部皮肤、腹部皮肤、背部肌肉、腹部肌肉、眼、脑、鳃、中肾、头肾、肠、肝、脾和心13种组织中的表达差异。结果显示,mc1r基因序列全长为4 518 bp,开放阅读框1 017 bp,编码338个氨基酸。氨基酸序列分析发现,虹鳟Mc1r蛋白具有7TM_GPCR_Srsx结构域。通过氨基酸序列同源比对与系统进化分析表明,Mc1r蛋白序列在鱼类间具有较高的保守性。qRT-PCR结果表明,mc1r基因在虹鳟与金鳟的受精期就开始表达,且在受精期至桑葚期胚胎的表达量高于胚胎后期;mc1r基因在虹鳟与金鳟相同时期表达比较结果显示,该基因在受精期、4细胞期、16细胞期、囊胚期、原肠期、神经期、体节期、1日龄、3日龄、7日龄胚胎或个体以及1月龄、2月龄、3月龄和6月龄背部皮肤中的表达均差异显著(P 0.05);mc1r基因在12月龄虹鳟和金鳟的13种组织中均有表达,其中,该基因在虹鳟与金鳟的背部皮肤、腹部皮肤和脑中的表达量较高,显著高于其他组织(P 0.05),且虹鳟背部皮肤中该基因的表达量高于金鳟背部皮肤(P 0.05)。以上结果表明,mc1r基因可能与虹鳟体色变异密切相关。本研究可为后期进一步深入阐明虹鳟体色变异的分子机制提供基础资料。     

人白细胞介素18的基因克隆与表达

人白细胞介素是新近发现的细胞因子之一。研究表明它参与Ｔ１辅助细胞介导的细胞免疫,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术从人外周血细胞扩增得到了ＩＬ－１８的ｃＤＮＡ并测定其核酸序列。利用基因生组技术构建ＩＬ－１８的表达载体,并在大肠杆菌中进行了表达。     

马铃薯多酚氧化酶基因克隆及反义表达载体构建

从甘农薯1号马铃薯试管苗叶片中提取总DNA,根据Genebank报道的马铃薯多酚氧化酶基因(PPT32)序列,设计合成了带有BamHⅠ、SacⅠ特定酶切位点的2对特异引物,通过PCR获得l840bP和476bP的扩增产物。测序结果表明,l840bp的扩增产物与Oenebank中发表的序列一致,476bp的扩增产物正是欲扩增的马铃薯多酚氧化酶基因的同源片段。将2个扩增产物反向连接到表达载体PC3中,通过双酶切鉴定后,按直接导入法实现反义基因表达载体质粒向农杆菌EHA105的导人;并经PCR鉴定证明,此质粒已整合到农杆菌Ti上。     

向日葵E3泛素连接酶基因克隆及表达分析

该研究从向日葵中克隆了E3泛素连接酶基因HERC2,并进行了生物信息学分析和不同胁迫条件的表达分析。序列分析表明,HERC2(登录号为KT832066)序列的CDS为1 608bp,编码535个氨基酸,预测其分子量131kD,等电点为5.03。HERC2编码的蛋白质为疏水性蛋白质,且为细胞质蛋白;亚细胞定位预测分析表明,向日葵HERC2可能定位在高尔基体中;该蛋白质有5个RCC1保守结构域。向日葵HERC2与已报道的其他植物同源蛋白有相似的保守区域,与醉蝶花亲缘关系最近,而与大豆和野生大豆的亲缘关系最远。与HERC2cDNA对应的gDNA(登录号为KT832067)的ORF长度为3 409bp,与cDNA编码序列比对结果表明,该gDNA由5个外显子和4个内含子组成。实时荧光定量PCR分析表明,向日葵HERC2基因表达受非生物胁迫调节,在不同器官及不同非生物胁迫下存在特异性表达差异。研究认为,HERC2基因应答逆境胁迫具有其特定的表达模式,研究结果为加强对HERC2的利用奠定了基础。     

三角帆蚌短型肽聚糖识别蛋白S3基因克隆及表达分析

肽聚糖识别蛋白（PGRPs）是机体先天免疫系统中的重要模式识别受体,研究对三角帆蚌的一种短型肽聚糖识别蛋白进行了克隆与表达分析。研究采用5、3 RACE技术,对高通量转录组测序所得三角帆蚌PGRPS3基因（hcPGRPS3）片段分别进行了5,3末端克隆,经拼接得到hcPGRPS3 cDNA全长序列。采用多种分子生物学软件对hcPGRPS3 cDNA全长序列进行了特征分析,实时荧光定量（qRT-PCR）检测了其组织分布,及经肽聚糖（Peptidoglycan,PGN）和脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）刺激后其在肝胰腺中的基因表达变化。hcPGRPS3 cDNA全长1438 bp,开放阅读框为858 bp,编码285个氨基酸,预测分子量大小为32.3 ku,pH 7.0时的理论等点为7.98。序列中不存在信号肽与跨膜结构。氨基酸序列保守性分析表明,其他物种短型PGRP中,以夏威夷短尾鱿PGRP4与hcPGRPS3同源性最高（51%）。qRT-PCR检测结果显示,hcPGRPS3在性腺及肝胰腺中表达水平较高。经PGN或LPS刺激后,肝胰腺中hcPGRPS3表达水平显著上调,表明hcPGRPS3可能在机体抗菌免疫反应中发挥重要作用。     

无芒隐子草CsPEAMT基因克隆及表达特性分析

以无芒隐子草(Cleistogenes songorica)干旱胁迫下的cDNA文库中磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferase,PEAMT)基因的EST序列为基础,采用RACE方法克隆该基因编码区序列,该序列全长为2 104bp,开放读码框1 506bp,编码501个氨基酸。无芒隐子草PEAMT蛋白编码的氨基酸序列与多种植物的PEAMT氨基酸序列有较高相似性,其中与高粱SbPEAMT、玉米ZmPEAMT的蛋白序列相似性最高(93%),说明PEAMT基因在植物进化中非常保守。采用实时定量RT-PCR分析无芒隐子草幼苗在干旱过程中CsPEAMT基因的表达结果显示,干旱胁迫诱导CsPEAMT基因在根和叶中大量表达,且在干旱第8天时CsPEAMT基因在叶和根中表达量分别是未干旱对照的43.35倍和13.25倍,复水后CsPEAMT基因的表达量开始下调。研究表明CsPEAMT基因可能是无芒隐子草抗旱性相关的基因。     

马氏珠母贝Sox11基因的克隆及时序表达模式分析

为探究Sox(SRY-related HMG-box genes)基因家族在马氏珠母贝个体发育及性别分化中的作用, 研究首先利用兼并引物从马氏珠母贝基因组中克隆到一个HMG框(high mobility group box), 利用RACE-PCR技术从SMART cDNA文库中克隆到一个Sox基因的cDNA全长, 通过Clustal X和MEGA 4软件对该序列进行比对分析并构建系统进化树; 通过荧光定量PCR技术对该基因在不同组织及发育不同时期性腺中的表达情况进行分析。结果显示, 马氏珠母贝该Sox基因的cDNA全长为1579 bp, 其中开放阅读框(ORF)为1008 bp, 编码336个氨基酸, 5'非编码区为126 bp, 3'非编码区为445 bp。同源性分析表明, 马氏珠母贝Sox基因与太平洋牡蛎Sox11基因的同源性(Identity)最高, 为80%, 故命名为pmSox11; 系统进化树分析也显示pmSox11与太平洋牡蛎Sox11基因的亲缘关系最近。荧光定量PCR分析组织表达特异性显示, pmSox11在马氏珠母贝神经节分布较多的组织如外套膜、鳃、足、消化盲囊等大量表达, 在神经节相对较少的闭壳肌和卵巢中表达量较少; 时序表达图谱显示, pmSox11在3月龄幼贝性腺和1年龄发育早期精巢中表达量最高, 在2年龄成熟精巢和2年龄性转换性腺中表达量降低, 而在2年龄卵巢中表达量最低。研究表明, pmSox11基因可能在马氏珠母贝早期神经系统发育和性别发育的调控方面起到重要作用。     

斧文蛤金属硫蛋白基因的克隆与表达分析

金属硫蛋白（Metallothionein,MT）是一类富含半胱氨酸的小分子蛋白质,参与机体重金属解毒、维持金属元素代谢平衡以及清除自由基等生理功能。为了解斧文蛤金属硫蛋白（Ml-MT）的分子生物学特征及其在重金属Cd2+胁迫下的响应机制,本文采用RACE技术从斧文蛤（Meretrix lamarckii）总RNA反转录产物中获得了636 bp的Ml-MT cDNA基因序列。该序列包含65 bp的5非编码区（UTR）和340 bp的3非编码区（UTR）以及231 bp的开放阅读框（ORF）,可编码76个氨基酸;其中半胱氨酸占27%,不含芳香族氨基酸,含16个MT所特有的Cys-Xn-Cys结构,预测的分子量约为7.704 kD,理论等电点7.138。MT氨基酸序列比对分析表明:斧文蛤金属硫蛋白（Ml-MT）与丽文蛤（Meretrix lusoria）的相似性高达88%,与文蛤（Meretrix meretrix）的同源性为87%。实时荧光定量（qRT-PCR）检测MT在斧文蛤5种组织中均有表达,但存在组织特异性,其中内脏团表达量最高,其次依次为鳃丝、闭壳肌、外套膜、斧足。在Cd2+（0.13 mg/L）胁迫0、6h、12h、24h、48h、72h和96h下,斧文蛤内脏团MT呈现出不同程度的上调表达,具体表现为高-低-高-低的波浪式变化,除6h以外,其他时间点均与对照组存在极显著差异（P0.01）。本研究表明:MT基因在维护机体正常生理功能及斧文蛤抵御重金属Cd2+胁迫过程中发挥着重要的分子调控作用。     

弱氧化醋杆菌阿拉伯糖醇脱氢酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

The partial genomic library of Acetobacter suboxydans was constructed using Yeast\| E.coli shuttle plasmid YEp352 as vector.Two positive transformants,designated as DH5α(pAD91) and DH5α(pAD98),were obtained by screening the growth of transformants on the agar plate in which D\|arabitol was used as the sole carbon source.The results of Southern blot and restriction endonuclease analysis showed that the two recombinants are identical.The insert is about 2.3kb.Arabitol dehydrogenase activity assay indic…     

鲫Kaiso基因cDNA的克隆和表达分析

在爪蟾和斑马鱼中, Kaiso是一种在整个基因组范围内与甲基化CpG序列特异性结合的转录抑制因子, 在调控被甲基化基因表达的时间模式中起重要的作用。为深入研究DNA甲基化对我国重要养殖鱼类生殖和发育的影响, 我们克隆了鲫Kaiso基因的cDNA序列, 并对其时空表达模式进行了分析。该cDNA全长3145 bp, 5′-非翻译区132 bp, 3′-非翻译区1117 bp, 开放阅读框1896 bp, 编码631个氨基酸。鲫Kaiso蛋白与其他物种Kaiso蛋白的同源性分析表明, 与其他物种一样, 其 N端和C端分别有高保守性的BTB/POZ结构域和锌指结构域。整胚原位杂交结果显示, Kaiso mRNA在早期胚胎发育的各个时期均广泛表达, 信号均一, 但从尾芽期开始出现组织特异性表达差异。对不同发育阶段胚胎的实时定量PCR检测结果表明: 卵子中有高丰度的母源Kaiso mRNA存在; 在卵裂期至囊胚中期胚胎中Kaiso mRNA的丰度逐渐降低; 从囊胚中期至原肠早期都维持在最低水平状态; 原肠后期其表达水平又逐渐升高, 至尾芽期达到与未受精卵中相当的高水平后在器官发生期的整体水平又稍有下降。Kaiso mRNA丰度在胚胎发育早期的这种变化过程提示在卵裂期检测到的mRNA可能都是母源mRNA, 合子核Kaiso基因可能是在囊胚晚期后才开始转录。对成体不同组织的实时定量PCR检测结果表明Kaiso的表达存在明显的组织特异性差异, 在鲫肌肉、视网膜、心脏和脑中表达水平较高, 而在肾、胰、肝等器官中表达水平很低。Kaiso表达的时间和组织特异性提示其作为甲基化基因的转录抑制因子参与了胚胎和成体基因表达时空模式的调控。这些结果为进一步研究Kaiso和DNA甲基化修饰在鲫发育调控和遗传育种中的作用提供了基础资料。     

CLONING AND EXPRESSION OF SPODOPTERA LITURA UBIQUITIN GENE

Abstract Ubiquitin (UBI) plays a very important role in regulated non-lysosomal ATP dependent protein degradation. In the present work, the coding sequence of Spodoptera litura UBI gene was isolated (GenBank Accession No. AF436066). The length of this ORF is 228bp, encoding a protein with Mr of 8.56 kD and isoelectric point of 6.56. Multiple sequence alignment indicated that S. litura UBI is very similar to the homologous proteins of other eukaryotic species and it has 84% identity with S. litura nucleopolyhedrovirus (SpltMNPV) UBI at amino acid level. RT-PCR analysis showed that S. litura UBI gene is ubiquitously expressed in larva tissues which are susceptible to SpltMNPV infection. By constructing E. coli expression vector, S. litura UBI was highly expressed and the recombinant protein was purified using Ni-NTA resin column, and currently further study on the function of S. litura UBI in SpltMNPV infection is underway.     

天花粉蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

天花粉蛋白 (Trichosanthin ,TCS)全长基因通过PCR从 pCDNA3 1中获得 ,克隆至表达载体中。双向测序表明获得的天花粉蛋白全长基因序列正确。建立大肠杆菌原核表达系统 ,表达并纯化His TCS活性融合蛋白 ,鉴定出其具有RNAN 糖苷酶活性和与TCS特异性单克隆抗体TE1 (IgE)结合的抗原活性     

鲫Dmrt3基因的克隆和表达分析

DMRT家族是一个与性别决定相关的转录因子家族。为了研究家族成员之一的Dmrt3在我国重要养殖鱼类鲫胚胎发育、性别分化中的功能以及在育种中的作用,我们克隆了鲫Dmrt3基因的cDNA全长,并对Dmrt3基因在发育早期和不同组织中的表达进行了分析。结果显示:鲫Dmrt3基因cDNA全长为2182 bp,其中5￠端非编码区408 bp,3'端非编码区427 bp,开放阅读框1347 bp,编码448个氨基酸。蛋白结构预测显示DMRT3除了正常的DM结构域外,还有DMA结构域,在进化上与DMRT4和DMRT5的亲缘关系更近。巢式RT-PCR分析结果表明Dmrt3直到尾芽期才开始有微量表达,表达量在15体节期有明显增加但仍然处在一个较低的水平;在成体组织中只在精巢中检测到表达。这种表达时空模式提示Dmrt3可能在早期器官发生和雄性性腺发育调控中起作用。对Dmrt3启动子CpG岛的甲基化分析表明所检测的组织和配子中并不发生甲基化,说明这种雌雄特异性和组织特异性差异表达并不是通过对该基因启动子的差异甲基化修饰来调控的。此外,我们还发现了鲫Dmrt3的一个由逆转录产物形成的假基因pDmrt3。这些结果为进一步研究鲫Dmrt3在性别分化中的作用和评估其在鲫性别控制育种中的价值,以及分析DMRT家族的进化关系提供了基础资料。       

雨生红球藻质体球滴结构蛋白基因的克隆与原核表达

叶绿体或者有色体中的质体球滴结构(Plastoglobules)是多数植物的类胡萝卜素等次生代谢产物积累的场所,但在能大量积累虾青素的雨生红球藻中,这个结构一直没有得到确认。通过透射电子显微镜观察发现雨生红球藻的质体内确切存在plastoglobules结构;并通过RT-PCR结合RACE技术,从雨生红球藻cDNA文库中克隆到了与编码plastoglobules的结构蛋白(Plastoglobulin)具有高度同源性的基因序列全长,称做Hpgp基因;该基因的表达产物称之为雨生红球藻质体球滴蛋白(HPGP;Haematococcus plastoglobules pro-tein);并进一步利用原核表达系统将该编码基因进行原核诱导表达,用His-Tag蛋白分离纯化系统纯化到了目标蛋白,并用该His-Tag融合蛋白为抗原免疫实验兔,制备到了相应的一抗抗体,为下一步对该蛋白的功能阐明以及雨生红球藻的虾青素积累机制研究提供重要的基础。     

硬头鳟巨噬细胞的体外长期培养(简报)

鱼类的巨噬细胞和高等脊椎动物的一样,在吞灭入侵的病原体方面起着极其重要的作用。探索在体外长期培养巨噬细胞的方法,有助于研究巨噬细胞的机能。Braun-Nesje等虽已从硬头鳟(Salmo gairdneri)等鲑科鱼类的头肾中分离出大量的巨噬细胞,并在体外培养了3个月之久,但因细胞不分裂,无法传代。本研究改用组织块培养法和饲养层技术探索长期培养巨噬细胞的方法,并获得成功。迄今巨噬细胞已在体外培养22个月,传代48次。细胞的原代培养分为三组。前两组是单独的脾或头肾的组织培养;第三组是脾与头肾的混合组织培养。培养液是Leibovitz’s L-15,外加20%胎牛血清,100 IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素。巨噬细胞的吞噬活力用酵母菌Candida     

抗性库蚊酯酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用抗性库蚊酯酶基因,引入原核表达载体pRL439,转化大肠杆菌HB101细胞,获得表达。通过酶切、Southern杂交鉴定重组质粒。研究了重组菌酯酶的活性,重组质粒pRLB1表达的酯酶具有高酶活并能高效降解酯酶的特异性底物α乙酸萘酯(αNA)和β乙酸萘酯(βNA);经对重组菌进行细胞固定化后降解农药三氯杀虫酯(7504),反应时间短,降解效率高