酿酒酵母渗透敏感新基因的定位及其作用机理的研究

本文通过四分子分析将酿酒酵母中另一控制渗透敏感的基因osm3进行了定位。遗传分析表明,osm3是位于染色体Ⅱ上的1个新基因,与gal1座位相距大约45厘摩。其第二次分裂分离频率为51.01%,它与着丝粒的图距为25.51厘摩,属着丝粒连锁基因。回复突变的研究结果表明,渗透敏感性状很可能是因为osm3座位上发生了错义或无义突变所致。 根据渗透敏感菌株和正常菌株对高渗透压反应试验,证明了高的胞内甘油含量是酵母在高渗条件下生长所必需的。osm3菌株不能耐高渗的主要原因是由于甘油转运失调所致,OSM3基因产物可能与甘油的转运过程有关。本文还就高渗对酿酒酵母发酵力的影响进行了讨论。     

酵母菌麦芽糖发酵等效异位基因系的遗传分析

用球形酵母或薛氏酵母为隐性菌株,对酵母属3个种的麦芽糖发酵基因进行了遗传分析。实验结果证明:(1)啤酒酵母2.982含有2个互不连锁的麦芽糖快发酵基因MALⅠ和MALⅡ。(2)卡尔斯伯酵母2.500仅含MAL6基因。(3)在葡萄汁酵母2.346与薛氏酵母杂种的一个后代中,发现葡萄汁酵母至少含有一个MALI基因。(4)球形酵母2.1161含有malI,malⅡ和mal6基因。本文对单倍体细胞间、单倍体细胞与孢子及孢子间三种杂交方法有所改进,提高了杂交频率。     

树干毕赤酵母NLP31发酵产乙醇的研究

研究了树干毕赤酵母NLP31在木糖质量浓度为45 g/L的3种发酵培养基Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ上发酵3轮的发酵性能以及在45 g/L木糖或混合糖(葡萄糖30 g/L,木糖15 g/L)的发酵培养基Ⅲ上的代谢历程。结果表明:树干毕赤酵母NLP31在发酵培养基Ⅲ上,乙醇浓度和乙醇得率均达到最高,分别为(17.29±0.15)g/L和(84.65±0.58)%。在45 g/L木糖或混合糖(葡萄糖30 g/L,木糖15 g/L)的发酵培养基Ⅲ上的代谢历程表明:混合糖发酵达到最大乙醇得率的时间仅为12 h,要比单一木糖发酵缩短了8 h。树干毕赤酵母NLP31在以廉价的无机N源为发酵培养基上的乙醇发酵性能高,能够降低燃料乙醇的生产成本。     

树干毕赤酵母和酿酒酵母混合糖发酵产乙醇

以树干毕赤酵母和酿酒酵母为发酵菌株,酸性蒸汽爆破玉米秸秆预水解液和纯糖模拟液为C源,采用固定化酵母细胞的方法,研究了酸爆玉米秸秆预水解液初始pH、N源种类及其浓度、3种发酵模式对树干毕赤酵母戊糖发酵的影响。结果表明:玉米秸秆预水解液适合发酵的初始pH范围为6.0～7.0;1.0 g/L的(NH4)2SO4作为N源,在40 g/L葡萄糖和25 g/L木糖培养基中发酵24 h,糖利用率达到99.47%,乙醇质量浓度为24.72 g/L,优于尿素和蛋白胨作为N源;3种模式的发酵体系中,以游离树干毕赤酵母和固定化酿酒酵母发酵性能最好,糖利用率和乙醇得率分别为99.43%和96.39%。     

利用人工锌指文库选育高乙醇耐受性工业酵母菌株

选育高乙醇耐性的酿酒酵母菌株对提高燃料乙醇的发酵效率具有重要意义.锌指蛋白广泛存在于多种生物中,对基因的转录和翻译起重要的调节作用.利用人工设计的锌指蛋白可定向设计锌指序列及其排列顺序,实现对细胞内多个基因的全局调控.由于与环境胁迫反应相关的基因很多,因此可利用人工锌指蛋白技术获得耐受性提高的微生物重组菌.文中将人工锌指文库转入到酿酒酵母模式菌株S288c,选育了具有高乙醇耐受性的重组菌株M01,并分离了与乙醇耐受性提高相关的人工锌指蛋白表达载体pRS316ZFP-M01,转入工业酿酒酵母Sc4126,在含有不同浓度乙醇的平板上,工业酵母Sc4126的重组菌株表现出显著的耐受性提高.在高糖培养基(250 g/L)条件下进行乙醇发酵,发现重组菌的乙醇发酵效率明显快于野生型,发酵时间提前24 h,且发酵终点乙醇浓度提高6.3％.结果表明人工锌指文库能够提高酵母的乙醇耐受性,为构建发酵性能优良的酵母菌种奠定了基础.     

不同宿主来源的重组酿酒酵母混合糖代谢比较

【目的】研究不同工业酿酒酵母宿主背景对重组酵母木糖利用效率的影响。【方法】将木糖利用途径的木糖还原酶(XR)、木糖醇脱氢酶(XDH)和木酮糖激酶(XK)编码基因串联后分别转入3株不同的工业酿酒酵母中,得到重组酵母ZQ1、ZQ5和ZQ7。分别对3个木糖途径代谢基因的表达水平、酶活和重组菌株的木糖发酵效率进行比较。【结果】重组菌株在木糖代谢基因转录、酶活性和木糖利用性能方面有很大差异,其中ZQ5木糖代谢能力最强,ZQ7其次,ZQ1木糖利用能力最弱。ZQ7在初始木糖浓度为20 g/L时木糖利用速率快于ZQ5,表明木糖浓度对重组菌发酵性能评价具有影响。【结论】不同菌株的遗传背景和木糖浓度对重组菌木糖利用的影响很大,评价重组酵母的木糖利用需考虑宿主的遗传背景和底物浓度的影响。     

扣囊复膜孢酵母BGL1基因在工业酒精酵母中的整合表达

构建了含有工业酿酒酵母自身GPD2启动子和终止子、扣囊复膜孢酵母b-葡萄糖苷酶基因(BGL1)和潮霉素选择性标记hyg的重组质粒pPIC-gpd-bgl-hyg, 通过酵母染色体同源重组, 将BGL1基因整合进入工业酒精酵母的染色体上。重组酵母可以在以纤维二糖为唯一碳源的培养基上生长, 48 h时b-葡萄糖苷酶酶活达到0.764 U/mL。在玉米浓醪酒精发酵实验中, 与宿主菌株相比, 重组酵母醪液中纤维二糖含量减少约80％, 达到了消耗醪液中纤维二糖含量的目的。     

扣囊复膜孢酵母BGL1基因在工业酒精酵母中的整合表达

构建了含有工业酿酒酵母自身GPD2启动子和终止子、扣囊复膜孢酵母b-葡萄糖苷酶基因(BGL1)和潮霉素选择性标记hyg的重组质粒pPIC-gpd-bgl-hyg, 通过酵母染色体同源重组, 将BGL1基因整合进入工业酒精酵母的染色体上。重组酵母可以在以纤维二糖为唯一碳源的培养基上生长, 48 h时b-葡萄糖苷酶酶活达到0.764 U/mL。在玉米浓醪酒精发酵实验中, 与宿主菌株相比, 重组酵母醪液中纤维二糖含量减少约80％, 达到了消耗醪液中纤维二糖含量的目的。     

一种基因工程改造的NADH高亲和力木糖还原酶突变基因可促进酿酒酵母发酵木糖生成乙醇

在导入表达毕赤酵母(Pichia stipitis)木糖还原酶(xylose reductase,XR)和木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase,XDH)基因的重组酿酒酵母中,木糖还原酶活性主要依赖辅酶NADPH,木糖醇脱氢酶活性依赖辅酶 NAD+,两者的辅助因子不同导致细胞内电子氧化还原的不平衡,是造成木糖醇积累,影响木糖代谢和乙醇产量的主要原因之一.将经过基因工程改造获得的NADH高亲和力的木糖还原酶突变基因m1,与毕赤酵母木糖醇脱氢酶(PsXDH)基因xyl2共转染酿酒酵母AH109,以转染毕赤酵母木糖还原酶(PsXR)基因xyl1和xyl2重组质粒的酵母细胞为对照菌株,在SC/-Leu/-Trp营养缺陷型培养基中进行筛选,获得的阳性转化子分别命名为AH-M-XDH和AH-XR-XDH.重组酵母在限制氧通气条件下对木糖和葡萄糖进行共发酵摇瓶培养,HPLC检测发酵底物的消耗和代谢产物的产出情况.结果显示,与对照菌株AH-XR-XDH相比,AH-M-XDH的木糖利用率明显提高,乙醇得率增加了16%,木糖醇产生下降了41.4%.结果证实,通过基因工程改造的木糖代谢关键酶,可用于酿酒酵母发酵木糖生产乙醇,其能通过改善酿酒酵母细胞内氧化还原失衡的问题,提高木糖利用率和乙醇产率.     

酵母菌杂交育种——Ⅲ.酵母菌麦芽糖发酵等效异位基因系的遗传分析

用啤酒酵母及卡尔斯伯酵母研究麦芽糖发酵等效异位基因,对啤酒酵母与薛氏酵母的杂种后代进行一系列杂交,结果证明啤酒酵母含有3个等效异位基因MALA、MALB及MALC基因(暂定名,因未与标准MAL基因鉴定),而薛氏酵母不含任一MAL基因,故为隐性菌株。 在卡尔斯伯酵母与球形酵母杂交试验中,发现卡尔斯伯酵母只含有1个MAL6基因,证实了Winge等人的工作。 所有这4个麦芽糖发酵基因都是互相独立的不连锁的基因。     

黄酒酵母一个新基因的鉴定及其对酵母抗逆性能的影响

该文鉴定了一个来自黄酒酵母菌株D2的新基因g5170,并研究了其对黄酒酵母环境胁迫耐受性与发酵性能的影响。生物信息学分析发现,此基因编码的蛋白质含有酰胺酶(amidase)保守功能域,并在YPD培养条件下有较高的基因表达量。利用Cre/lox P系统构建了基因g5170的敲除菌株,通过扩增带有g5170基因上下游同源序列和kanr筛选标记的基因敲除组件,并通过醋酸锂法转化到黄酒酵母菌株D2获得阳性克隆子,然后将质粒p SH65转到阳性克隆子中,半乳糖诱导p SH65表达Cre酶切除kanr筛选标记。重复此实验过程,最终获得两个g5170基因拷贝完全缺失菌株D2?g5170。梯度生长实验显示,与原始菌株相比,敲除菌株对高糖浓度、高温耐受性无明显变化,但对乙醇胁迫的耐受性显著降低,而过表达g5170的重组酵母菌株对乙醇的耐受性明显比对照菌株强。模拟黄酒发酵实验结果表明,敲除菌株D2?g5170的生长速率、乙醇产量及理化指标与原始菌株相似。因此,g5170基因可能与黄酒酵母适应乙醇胁迫有关,并有助于提高酵母的黄酒发酵性能。     

赤藓糖醇高产菌株的筛选、鉴定及发酵特性的初步研究

目的：筛选出发酵性能优良的赤藓糖醇高产菌株。方法：利用含50%葡萄糖的高渗培养基筛选出耐高渗酵母,采用薄层层析和高效液相色谱分析发酵液中多元醇的组成和含量,并通过形态和生理生化试验对菌株进行初步鉴定。结果：由泰山养蜂场上采集的蜂蜜、花粉、蜂巢里筛选出13株单产赤藓糖醇的野生菌,其中7株赤藓糖醇产量高于20g/L。菌株K-23经初步鉴定为球拟酵母属,在含20%葡萄糖、1%酵母膏、0.1%尿素的发酵培养基中培养144h后赤藓糖醇的浓度达46.8g/L,转化率达23.4%。结论：所获得的菌株K-23具有一定的赤藓糖醇生产能力,且具有产物单一的优良发酵性能,为该菌株的菌种改良奠定了基础。     

酵母菌株对芒果酒理化特性及抗氧化特性的影响

采用5株广为使用的酵母菌株(EC1118, D254, Red fruit, Aroma white, SY)分别作为芒果酒的发酵菌株。通过对比它们的发酵力,起发时间以及对芒果酒的酒精度、干浸出物、挥发酸、总糖、可滴定酸含量、pH值以及抗坏血酸、总酚、抗氧化活性(DPPH, FRAP)、感官得分的影响,选取得到芒果酒发酵的最适酵母菌株。结果表明,5株酵母所发酵的芒果酒酒精度相差不大,且干浸出物与总糖含量之间没有显著性差异(p0.05)。Aroma white具有较强的发酵力,所发酵的芒果酒挥发酸含量较低,抗氧化能力较强,感官得分最高。因此确定在这5株菌株中,它最适宜作为芒果酒的发酵菌株。此外,运用主成分分析(principal component analysis,PCA)对5株发酵菌株生产的芒果酒进行了区分,结果表明此法可将5种芒果酒进行明显区分。     

基因重组构建甘蔗糖蜜酒精高产酿酒酵母菌株

[目的]增强工业用酿酒酵母菌株对甘蔗糖蜜中非还原糖的利用,提高糖蜜发酵乙醇产率。[方法]构建载体p YX212-agl3,分别在载体的TPI启动子和终止子5’端加上10 bp的酵母转座子重复序列,PCR扩增获得TPIP-agl3-TPIT片段,将该片段电转化至工业用野生型酿酒酵母MF1001的单倍体细胞中,复倍后经过YPR培养基初筛和YPSR培养基复筛。[结果]获得的MFA1001-3菌株分别在10锤、20锤、30锤和40锤的甘蔗糖蜜培养基中细胞的生长速率、酒精发酵浓度、对糖分的利用能力均有所增强,在40锤糖蜜中的差异最为明显,最大细胞数增加了58.7%,最大产酒率提高了4.5%,发酵结束后醪液中的总糖浓度减少了23.6%,还原糖浓度增加了15.05%。[结论]与出发菌株相比重组菌株发酵醪液中最终还原糖浓度增加而总糖浓度却减少,说明用该方法整合表达α-半乳糖苷酶的重组菌株确实有效地水解了糖蜜中的部分非还原糖同时提高了对总糖的利用率。     

响应面法优化嗜热厌氧杆菌X514产乙醇合成培养基

嗜热厌氧杆菌X514(Thermoanaerobactersp.X514)能同时发酵五碳糖、六碳糖并产出乙醇,是纤维素乙醇生产中最具潜力的菌株之一。单因子试验证明,酵母提取物中对X514乙醇发酵起决定性影响的组分为B族维生素,并进一步确定了B族维生素中对乙醇发酵有影响作用的6种维生素。结合培养基中的其他影响因子,应用Plackett-Burman试验设计方法,筛选出X514乙醇发酵的极大影响因子为NH4Cl、烟酸及硫胺素。随后用最陡爬坡试验确定了影响因子最佳取值区域,并利用响应面方法优化合成培养基。优化结果显示,当以5 g/L葡萄糖为底物时,在NH4Cl、烟酸及硫胺素的浓度分别为1.05 g/L、6.4 mg/L及7.0 mg/L的条件下,X514的乙醇产出浓度达到最优理论值34.46 mmol/L。试验验证该条件下乙醇产出浓度为33.78 mmol/L。试验值与理论值接近,原始矿物质培养基中乙醇产出浓度的5.1倍,并与添加5 g/L的酵母提取物培养基的乙醇产出浓度(34.67 mmol/L)相当。     

商陆抗病毒蛋白重组子筛选及发酵条件初探

目的：筛选体外高表达商陆抗病毒蛋白的毕赤酵母重组菌株,并摸索其适合的发酵条件。方法：通过电击转化将含有商陆抗病毒蛋白（pokeweed antiviral proteins,PAP）基因的分泌型表达载体PIC9K-P导入到毕赤酵母（Pachia pastoris）GS115菌株中。利用免疫印迹法筛选表达量较高的转化子。在摇瓶发酵水平对重组菌株产PAP条件进行初步研究。结果：高表达PAP的重组菌株在发酵时间为96h,10g/L的甲醇浓度,培养基pH值为6.0～6.4时PAP的表达量较高。结论：免疫印迹法适合用于毕赤酵母高表达重组菌株的筛选,重组毕赤酵母的PAP表达量可高达30mg/L。     

抗盐胡杨Na+/H+逆向转运蛋白基因PeNhaD1的功能

将胡杨Na /H 逆向转运蛋白基因PeNhaD1,分别转入对盐敏感的缺失质膜和缺失液泡膜Na /H 逆向转运蛋白基因的酵母突变菌株ANT3和GX1中。结果表明,在pH6.0、Na 浓度为80mmol/L(固体培养基)或400mmol/L(液体培养基)的条件下,转化具有目的基因的酵母ANT3具有更高的耐盐性,而将目的基因转化到突变株GX1时,却不能提高其耐盐性。实验结果说明PeNhaD1可能是通过编码质膜Na /H 逆向转运蛋白而提高酵母的耐盐性的,推测其在胡杨耐盐机制中的作用可能是提高拒盐性。     

扣囊复膜孢酵母BGLl基因在工业酒精酵母中的整合表达

构建了含有工业酿酒酵母自身GPD2启动子和终止子、扣囊复膜孢酵母β-葡萄糖苷酶基因（BGL1）和潮霉素选择性标记hyg的重组质粒pPIC-gpd-bgl-hyg,通过酵母染色体同源重组,将BGLl基因整合进入工业酒精酵母的染色体上。重组酵母可以在以纤维二糖为唯一碳源的培养基上生长,48h时β-葡萄糖苷酶酶活达到0.764U／mL。在玉米浓醪酒精发酵实验中,与宿主菌株相比,重组酵母醪液中纤维二糖含量减少约80％,达到了消耗醪液中纤维二糖含量的目的。     

产胞外多糖酵母菌株的筛选鉴定及发酵产糖

【目的】微生物胞外多糖大多具有良好的功能和特性,但对酵母胞外多糖的研究甚少。本研究从自然界中筛选出产胞外多糖的酵母菌株,并对其发酵产糖条件进行初步研究。【方法】利用平板涂布法从自然界中分离得到酵母菌株,苯酚硫酸法测定菌株胞外多糖的产量,筛选出胞外多糖高产菌株,并对其进行5.8SrDNA分类鉴定,最后优化其产糖培养基组成。【结果】对从葡萄、蜜枣、土壤样品中分离得到的132株酵母进行筛选,最终得到3株高产胞外多糖的酵母菌株Z14、Z20和L25。经5.8S rDNA序列测定及系统发育分析,从左优红葡萄中分离得到的Z14和Z20与东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)处于同一分支,相似性达到99%以上;从落叶松近表层土壤分离得到的L25与土生隐球酵母(Cryptococcus humicolus)处于同一分支,相似性为98.8%。经优化,利于Z20胞外多糖合成的最优发酵培养基配方为:葡萄糖8%,(NH4)SO40.2%,KH2PO40.1%,酵母浸粉0.1%,CaCl20.01%。在初始pH6.0,发酵温度28℃,摇床转数160 r/min条件下,在此培养基中发酵4 d后胞外多糖产量可达2.046 g/L,比复筛时的产量1.137 g/L提高了79.9%。【结论】文献已报道某些属的酵母可以生产胞外多糖,经本文研究发现Issatchenkia属的酵母也可以合成胞外多糖,并且改变基础产糖培养基的成分可以显着提高Z20胞外多糖的产量。     

Optimization of fermentation medium for Cordyceps militaris high producing strain

在单因素试验初步确定高产蛹虫草菌株发酵培养基的基础上,以蛹虫草菌丝体中腺苷含量为指标,进行11因素2水平Plackett - Burman试验设计试验,结合多元一次回归模型和F检验方法,筛选出发酵培养基中影响显著的组分酵母浸粉、蔗糖和维生素B1,采用旋转中心组合设计方法对这三个组分进行进一步优化,结合多元二次回归模型和响应面分析,获得高产蛹虫草菌株的最佳培养基(g/L):蔗糖18.85、蛋白胨10、酵母浸粉18.97、KH2 PO4 3、MgSO4 3、维生素B10.235、ZnCl2 0.011、(NH4)2SO4 10.验证试验结果表明蛹虫草腺苷得率较单因素优化获得的发酵培养基提高了26.91％.