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T7启动子控制下的多功能大肠杆菌表达系统 总被引:6,自引:2,他引:6
构建了T7启动子控制下的多功能大肠杆菌表达载体系统,这些表达载含有强的T7启动子,翻译起始及终止元件,多克隆位点,线状噬菌体复制起始区等元件,使得该载体就仅可以有效地表达外源基因、还可能利用helper phage诱导包装单链噬菌体,从而不需亚克隆就可以进行突变及DNA序列测定。 相似文献
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用鸡β- globin的MAR序列和人看家基因延伸因子1α(hEF-1α)的调控序列以及旱獭RNA稳定与输出序列,构建了重组人尿激酶原(recombinant human pro-urokinase,rhPro - UK)的高效表达载体,在CHO细胞中获得了rhPro - UK的高效稳定表达,rhPro - UK的表达水平达到1299 IU(以百万细胞1d的表达量计).采用阳离子交换层析、疏水层析和凝胶排阻层析的三步工艺纯化表达rhPro - UK的CHO细胞培养上清液,rhPro - UK的纯度达到98%、回收率为60% ~70%. 相似文献
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合成人干细胞cDNA在大肠杆菌中的高效表达与纯化 总被引:1,自引:0,他引:1
以pBV220为载体,进行了合成可溶型人干细胞因子(SCF)cDNA在大肠杆菌中的温控型的高效表达。SDS-PAGE检测表明,在实验室摇瓶培养中,目的蛋白可占菌体可溶蛋白的40%左右。表达产物复性后,经过凝胶过滤、离子交换层析,得到了电泳纯的重组rhSCF,经测定,纯化的rhSCF相对分子质量为19000,氨基端15个氨基酸的序列与天然可溶形式的hSCF成熟分子的序列完全一致。 相似文献
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不含信号肽序列人尿激酶原全长cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达 总被引:2,自引:1,他引:2
从pro—uK全长cDNA中切下包括信号肽序列的N端371bp片段,经Fnu4HI不完全酶切将信号肽序列去掉,回收304bp片段,该片段再与人工合成的含HindⅢ、EcoRV内切酶位点和起始密码ATG的寡核苷酸片段连接,转化得一重组质粒,该中间质粒经酶切和序列分析证明构建正确后再与pro—UK cDNA其余片段相连按,得到全长pro一UK cDNA。我们将所得不含信号肽序列的pro—UK cDNA重组到带有PRPL启动子的原核表达载体pHv220中,转化大肠杆菌JM101,42℃诱导6h,菌体超声破碎后其上清及不溶性成份均可测出尿激酶活性。用ELISA法检测尿激酶抗原性表现为强阳性;纤维蛋白溶解平板法(FAPA)测定活性可达500-1000IU/L,经复性活性可达60000lU/L,虽表达产物可被抗尿激酶血清特异中和,经相差显微镜及电镜观察均证明表达蛋白绝大部分以包涵体形式存在。Western blot分析证明表达产物为单链pro-UK,分子量约为47kDa,与国外文献报导一致。 相似文献
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重组人尿激酶原的分离纯化及性质研究 总被引:1,自引:0,他引:1
本文报道从人尿激酶原(pro-urokinase,pro-UK)基因重组工程菌E.coliJA221表达产物的复性液中纯化尿激酶原的方法。复性产物经Zn^2+选择性沉淀,尿激酶抗体亲和柱层析,benzamidine-Sepharose CL 4B亲和吸附,即得比活达110000IU/mg的纯化产品。样品经SDS-PAGE鉴定,在还原及非还原条件下,均表现为分子量为43kd的单一条带。动力学研究测得 相似文献
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人尿激酶原(pro-urokinase,pro-UK)是一种新型溶栓剂,优于尿激酶,具有血纤维蛋白特异性。为了在昆虫杆状病毒表达系统中高效表达pro-UK,我们在pAc373基础上,插入野生型AcMNPV polyhedrin启动子区-7~1碱基序列,构建了一个高表达转移载体pAcYT。分别经三次克隆将pro-UK cDNA正向插入到转移载体pAc373或PAcYT的BarnHI-KpnI位点上。用LiPofectin将pAcyT-UKDNA或pAc373-UK DNA与AcMNPV DNA共转染到昆虫Sf9细胞中,空斑法筛出重组病毒阳性克隆株。高效表达结果是:1.ELISA法确定重组病毒Sf9细胞分泌表达产物pro-UK为96mg/L培养基上清,平板法测定溶圈活性为1600IU/mL培养基上清;2.亲和层析一步法纯化表达产物,回收率选70%,以上,比活约为60000IU/mg;3.纯化的pro-UK,无论是否经还原处理,其SDS-PAGE图谱均为相同的单一条带,MR 50000;4.Western blot与SDS-PAGE图谱吻合。 相似文献
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人尿激酶原cDNA在昆虫杆状病毒真核表达系统中的高效表达 总被引:1,自引:0,他引:1
人尿激酶原是一种新型溶栓剂,优于尿激酶,具有血纤维蛋白特异性,为了在昆虫杆状病毒表达系统中高效表达pro-UK,我们在pAc373基础上,插入野生型AcMNPV polyhedrin启动子区-7~-1碱基序列,构建了一个高表达转移载体pAcYT.分别经三次克隆将pro-UK cDNA正向插入到转移载体pAc373或pAcYT的BamHI-KpnI位点上。用Lipofectin将pAcYT-UKDN 相似文献
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人甲状旁腺激素的基因克隆及在大肠杆菌中的表达 总被引:5,自引:0,他引:5
人甲状旁腺激素(Hon,an parathyroid hormone hPTH)是84个氨基酸组成的多肽激素。从人甲状旁腺肿瘤组织分离纯化总RNA.其mRNA逆转录得cDNA,以cDNA为模板,PCR扩增得hPTH基因。将该基因克隆到表达载体pBV220上,转化大肠杆菌DH5n细胞,获得了表达。细胞抽提液1000倍稀释后hPTH的放免活性265,77ng/dl,为对照的480倍。表达产物粗分离后经Resource-s阳离子柱进行了分离.对活性峰进行了MALDI质谱分析及HPLCC18反相柱分析。 相似文献
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中国人γ-干扰素cDNA在大肠杆菌中的高效表达 总被引:5,自引:0,他引:5
应用RT-PCR技术从中国人淋巴细胞mRNA反转录产物中克隆了IFN-γcDNA,序列分析证实了分子进化规律对IFN-γcDNA序列存在多态性的推论.在此基础上应用DNA重组技术,将去信号肽中国人IFN-γcDNA克隆到原核表达质粒pBV220 PRPL启动子下游,转化大肠杆菌DH5α,通过温度诱导表达,成功地在大肠杆菌中稳定、高效地表达了中国人IFN-γcDNA,其表达水平占全菌可溶性总蛋白的44.4%,初步复性后生物学活性测定结果表明γ-IFN表达量为0.45×107~2.34×107单位/L. 相似文献
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人白细胞介素18在大肠杆菌中的表达,纯化和复性 总被引:7,自引:0,他引:7
用RT-PCR从PHA刺激的人外周血单个核细胞(PBMC)中扩增出人白细胞介素18(IL-18)的cDNA,克隆到表达载体pJW2中,经热诱导后在大脾性杆菌中得到高效表达。表达的重组IL-18占菌体总局旧白质的20%,表达的蛋白南分子量约为18KD,与预期分子量相符。产物主要以包涵体的形式存在。包涵体经超声破碎、洗涤后以8mol/L尿素溶解,经Sephadex G-100柱纯化后,纯度可达90%以 相似文献
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小鼠白细胞介素18在大肠杆菌中的表达、纯化及抗肿瘤作用研究 总被引:3,自引:0,他引:3
用RT PCR从小鼠肝脏细胞中扩增出小鼠白细胞介素 18(mIL 18)的cDNA ,克隆到表达载体pJW2中 ,经热诱导后在大肠杆菌JM109中表达。表达的重组mIL-18(rmIL-18)主要以包涵体形式存在 ,占菌体总蛋白质的 18%。包涵体用 5mol L尿素溶解后 ,经SephadexG-100柱纯化。纯化的蛋白质经透析复性 ,在 0.5mg LConA存在的条件下 ,能够对小鼠脾细胞具有剂量依赖的IFN γ诱生作用。以 1× 105 H22 肝癌细胞腹腔注射昆明小鼠 ,构建小鼠H2 2 肝癌腹水瘤模型。分别在肿瘤细胞接种后 1、4和 8d ,用 10 μg纯化产物对荷瘤小鼠进行腹腔注射。结果显示rmIL 18注射组小鼠死亡速率延缓 ,生存率显著提高 (P <0 .0 1) ,达到 62.5 %。首次证明mIL-18对小鼠H2 2 肝癌具有显著的抑制作用 ,经rmIL 18作用后存活小鼠具有对H22 肝癌细胞的免疫记忆性 相似文献
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重组人GM—CSF/MCAF融合蛋白的变性,复性及纯化研究 总被引:2,自引:0,他引:2
人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和单核细胞趋化激活因子(MCAF)融合蛋白在大肠杆菌中高效表达后,表达产物以包涵体形式存在。包涵体经分离和洗涤后,探索了rhGM-CSF/MCAF变性和复性的合适条件。复性后的样品经Sephadex G-75凝胶过滤和CM-Sepharose FF离子交换两步层析,得到了具有生物学活性的SDS-PAGE纯的rhGM-CSF/MCAF。Western blot检测表明,纯化的rhGM-CSF/MCAF能分别与GM-CSF和MCAF抗体发生特异反应。 相似文献
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金黄色葡萄球菌核酸酶A基因在大肠杆菌中的高效表达 总被引:3,自引:0,他引:3
这篇文章报道了金黄色葡萄球菌核酸酶A的克隆和在温控启动子PRPL调控下在E.Coli中的高效表达。SDS—PAGE分析表明,核酸酶A的含量可占E.Coli细胞总蛋白含量的60%。经有效的增溶和复性处理后,重组酶具有与天然酶相同的活力;N-末端氨基酸分析的结果指出,fMet在转译后被加工去除;对重组SNaseA在构象上的同一性也通过Phenyl—Su—perose疏水柱层析进行了分析。 相似文献
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人鼻咽癌相关基因NGX6在大肠杆菌中的诱导表达及纯化 总被引:1,自引:0,他引:1
NGX6是一个新克隆的鼻咽癌抑瘤基因候选者,为了进一步制备抗NGX6编码蛋白质的抗体和研究它的功能,本研究拟在原核表达系统中表达并纯化出NGX6蛋白.采用多聚酶链式反应(PCR)方法扩增出NGX6基因蛋白编码序列,构建该基因的融合表达质粒pGEX3X/NGX6,导入大肠杆菌中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳.Western hlot鉴定.用GST融合蛋白纯化试剂盒纯化融合蛋白.结果显示构建的融合表达质粒酶切和测序鉴定阅读框架正确,导入大肠杆菌中诱导后出现一条42kDa的新蛋白带,主要存在于细菌沉淀中,占总蛋白的26%,Western blot鉴定其为GST/NGX6融合蛋白,并进一步纯化出融合蛋白.研究表明NGX6基因编码蛋白质能够在原核细胞中表达,并能纯化出该种蛋白,为进一步深入研究该蛋白质的结构与功能打下了基础. 相似文献
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水稻巯基蛋白酶抑制剂cDNA在大肠杆菌中的表达 总被引:2,自引:0,他引:2
根据从水稻未成熟种子cDNA文库中筛选出的水稻巯基蛋白酶抑制剂(Oryzacys-tatin)cDNA序列,利用聚合酶链反应(PCR)技术扩增出Oryzacystatin编码区,插入到温度敏感型大肠杆菌表达载体的PtPL启动子下游.该质粒带有温度敏感型阻遏子的编码基因cIts857。转化大肠杆菌DH5a后。通过升温诱导,Oryzacystatin在大肠杆菌中获得高教表达,SDS—PAGE表明分子量约为12kDa。与预期结果一致,表达量占细菌可溶性蛋白总量的10%以上,对巯基蛋白酶的抑制活性检测表明,可溶性蛋白组分对木瓜蛋白酶有明显的抑制活力。 相似文献