固定化谷氨酸棒杆菌T6—13细胞的酶学性质研究

比较研究了固定化谷氨酸棒杆菌细胞和自然细胞的谷氨酸脱氢酶、异拧檬酸脱氢酶,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的一些性质。最适pH、温度对二者酶促反应速度的影响基本相似;pH、热稳定性固定化细胞高于自然细胞;底物表观米氏常数谷氨酸脱氢酶,异柠檬酸脱氢酶有所增大,而葡萄糖-6-磷酸脱氢酶则有所下降;辅酶表观米氏常数均有所增大。这些是影响固定化细胞应用的主要因素。     

谷氨酸产生菌原生质体的制备及其形成模式

比较了谷氨酸生产菌棒杆菌T原生质体形成的条件,以及对再生率的影响。采用溶菌酶一甘氨酸一青霉素G处理其细胞的原生质体形成率千兀再生率最佳。酶处理10小时,原生质体形成率接近1OO％,再生率可达10％以上。根据显微摄影观察,棒杆菌形成原生质体有类似于“海鸥”形的独特形成模式。     

谷氨酸生产菌S9114中的谷氨酸脱氢酶的研究

谷氨酸脱氢酶 (GDH)是谷氨酸生物合成的关键酶 ,谷氨酸棒杆菌S91 1 4是目前我国味精工业应用最广泛的生产菌种 ,其谷氨酸脱氢酶的研究尚未见报道。分离纯化该菌中的谷氨酸脱氢酶 ,研究其辅酶组成 ,对揭示谷氨酸脱氢酶的分子结构和性质 ,提高谷氨酸产率很有必要。将培养至对数期中期的细胞离心收集并用含适量DTT、ED TA的Tris_HCl缓冲液 (pH 7 5 )洗涤 ,用Frenchpressurecellpress破碎 ,离心去除菌体碎片得无细胞抽提液。然后使用 KTA_10 0快速纯化系统经DEAE_纤维素柱、疏水柱 (HIC)、G_2 0 0凝胶过滤柱层析得到纯化大约 70倍的以NAD PH为辅酶的GDH和部分纯化的以NADH辅酶的GDH。这两个酶分别对NADPH、NADH高度专一 ,不能相互代替。经HPLC和SDS_PAGE测得前一种酶的分子量和亚基分子量分别为 188kD和 32kD ,表明该酶为具有相同亚基的六聚体。酶活性测定使用HITACHIU_30 0 0分光光度计利用NAD(P)H在 340nm氧化的初速度进行。蛋白质含量测定利用Bradford方法进行 ,并以牛血清白蛋白为标准蛋白。纯化结果表明S91 1 4中确实存在两种GDH ,其中以NADH为辅酶的GDH尚未见报道。和某些具有两种GDH的微生物一样 ,S91 1 4可能也是以NADPH为辅酶的GDH参与谷氨酸的合成代谢 ,以NADH为辅酶的GDH参与谷氨酸的分解代谢。     

固定化谷氨酸氧化酶管流动注射测定谷氨酸的研究

多孔玻璃珠固定谷氪酸氧化酶与过氧化氢酶分别制成相应的固定化酶管,结合流动注射分析系统测定谷氨酸的含量。测定线性范围在0．1—2．O mmol／L．精度(c．V)O．7％．测定速率每小时80样以上．使用寿命至少4个月。在各氨酸浓度低于2．5mmol／L时．pH在6．5—8．0．温度20—35℃．磷酸盐浓度在0.05—0.25mol／L范围内对测定几乎无影响．对不同发酵时间的谷氨酸发酵液测定,测定的结果与酶试剂盒及瓦氏法比较,结果一致．说明该方法已具有实际应用价值。     

谷氨酸生产菌S9114中的谷氨酸脱氢酶的研究

谷氨酸脱氢酶(GDH)是谷氨酸生物合成的关键酶,谷氨酸棒杆菌S9114是目前我国味精工业应用最广泛的生产菌种,其谷氨酸脱氢酶的研究尚未见报道。分离纯化该菌中的谷氨酸脱氢酶,研究其辅酶组成,对揭示谷氨酸脱氢酶的分子结构和性质,提高谷氨酸产率很有必要。将培养至对数期中期的细胞离心收集并用含适量DTT、EDTA的Tris-HCl缓冲液 (pH 7.5)洗涤,用French pressure cell press 破碎,离心去除菌体碎片得无细胞抽提液。然后使用?KTA_100快速纯化系统经DEAE_纤维素柱、疏水柱(HIC)、G-200凝胶过滤柱层析得到纯化大约70倍的以NADPH为辅酶的GDH和部分纯化的以NADH辅酶的GDH。这两个酶分别对NADPH、NADH高度专一,不能相互代替。经HPLC和SDS_PAGE测得前一种酶的分子量和亚基分子量分别为188kD和32kD,表明该酶为具有相同亚基的六聚体。酶活性测定使用HITACHI U-3000 分光光度计利用NAD(P)H在340nm氧化的初速度进行。蛋白质含量测定利用Bradford 方法进行,并以牛血清白蛋白为标准蛋白。纯化结果表明S9114中确实存在两种GDH,其中以NADH为辅酶的GDH尚未见报道。和某些具有两种GDH的微生物一样,S9114可能也是以NADPH为辅酶的GDH参与谷氨酸的合成代谢,以NADH为辅酶的GDH参与谷氨酸的分解代谢。同时发现以NADPH为辅酶的GDH在280nm吸收很弱,在215nm吸收很强。说明此酶中酪氨酸、苯丙氨酸含量较低。     

L-鸟氨酸高产菌的原生质体融合育种

以谷氨酸高产菌S9114和谷氨酸棒杆菌GS538为出发菌株,应用原生质体融合技术,定向选育出一株L-鸟氨酸高产菌株RH169,该菌株能在发酵液中积累L-鸟氨酸,质量浓度可达19.3 g.L-1。     

产谷氨酸棒杆菌B9和T6—13的原生质体融合

棒杆菌Ｂ９和Ｔ６—１３两菌株经ＵＶ变处理得到Ｂ９—２（ＳｍＲ）和Ｔ６—１３—３（ＲｉｆＲ）两菌株,以此两菌株做为出发菌株。将对数前期的培养细胞经青霉素予处理及酶解制备原生质体,用４０％ＰＥＧ６０００为助融剂,进行原生质体融合。用间接法检出具有Ｓｍ、Ｒｉｆ抗性的融合子。融合频率为６．５５×１０－６－１．６４×１０－５,融合子双抗性稳定,产谷氨酸,经摇瓶实验筛选出一株产谷氨酸明显高于亲本的融合子ｆｕ３６。     

谷氨酸分泌机制研究的新进展

近年对谷氨酸棒杆菌谷氨酸分泌机制有一些研究,并取得重要突破。已被广泛接受的“渗漏模型”面临新的挑战,Ｃｌｅｍｅｎｔ,Ｙ．等的研究提出“载体逆转模型”,Ｈｏｉｓｃｈｅｎ,Ｃ。等否定了上述两种模型,提出“分泌载体模型”。本文综述这些模型的要点和论据,以期对谷氨酸跨膜分泌机制与控制有较深入的了解。     

谷氨酰胺合成酶产生菌的固定化研究

谷氨酰胺合成酶产生菌的固定化在酶法合成谷氨酰胺中的应用具有重要意义。实验首先从味精废水中筛选出谷氨酰胺合成酶高产菌株LNU018,然后分别用海藻酸钠、聚乙烯醇(PVA)为载体对谷氨酰胺合成酶高产菌棒杆菌进行固定化。探讨了固定化条件对固定化小球结构、机械强度、弹性、稳定性和培养后菌体的谷氨酰胺合成酶的活性情况的影响,分析确定最佳的固定化条件。研究结果表明,5%的海藻酸钠、11%的聚乙烯醇形成的固定化菌球大小合适,有弹性,但5%的海藻酸钠能更好的保持酶活性,比11%聚乙烯醇高16%,其为最佳的固定化条件。     

用原生质体融合技术选育谷氨酸高产菌

利用原生质体融合技术,在不对亲株做任何诱变的前提下,成功地使天津短杆菌TG-866与钝齿棒杆菌B9的原生质体进行融合,获得兼有两亲株遗传性状——细胞个体大、产酸高的融合子F263及F288。确定了两亲株原生质体制备、再生及融合的最佳条件。在该条件下,其原生质体形成率均在99．9％以上,再生率分别为z 3％及28％,原生质体融合率为3．2×1 0-5在最佳摇瓶发酵条件下,F263及F2 88的谷氨酸产率分别为8．4g／dl及8．03g／dl.通过连续10次摇瓶传代,发现该融合子较稳定,因而具有较高的应用价值。     

谷氨酸棒杆菌高丝氨酸脱氢酶编码基因hom的敲除

本研究以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）标准菌株ATCC 13032染色体为模板,设计引物PCR扩增高丝氨酸脱氢酶编码基因（hom）,在hom基因内部插入一段来源于质粒pET28a的卡那霉素抗性基因（Km）,得到基因元件hom::Km;通过电击转化法将hom::Km转入出发菌株替换原菌株的hom,在含卡那霉素的平板上挑取阳性转化子,通过PCR验证得到高丝氨酸脱氢酶缺陷的重组菌。发酵结果表明重组菌C.g- hom::Km -8发酵60小时赖氨酸产量达到4.7 g／L,是出发菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 13032（0.7 g／L）的6.7倍。     

谷氨酸棒杆菌的乙醛酸循环与谷氨酸合成

为阐明谷氨酸棒杆菌的乙醛酸循环与菌体的生长以及谷氨酸合成之间的关系 ,以谷氨酸棒杆菌基因组测序用典型菌株Corynebacteriumglutamicum ATCC 130 32为出发菌株 ,构建了乙醛酸循环途径缺失的谷氨酸棒杆菌突变株Corynebacteriumglutamicum WTΔA。该菌株没有异柠檬酸裂解酶活性 ,不能在以乙酸盐为唯一碳源的基本培养基上生长。与出发菌株ATCC13032相比 ,WTΔA在以葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长时不受影响 ,说明谷氨酸棒杆菌并不需要乙醛酸循环途径提供菌体生长所需的能量和生物合成反应所需的中间产物。但是 ,与出发菌株ATCC13032相比 ,WTΔA的谷氨酸合成能力大幅下降。     

谷氨酸生产菌原生质体形成及再生最佳条件的研究

本文通过不同前处理、不同高渗缓冲液、不同酶量、温度及酶解时间对原生质体形成和再生的影响试验,确定了最佳酶解工艺条件,并采用简便的蔗糖美兰染色液进行原生质体释放及形态学的观察。