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尿激酶原测定方法的改进及对GL—11G工程细胞表达尿激酶原水平稳定性观察 总被引:1,自引:0,他引:1
该文对原来的纤溶板法进行了改进,使测定结果更可靠,精确,并节省成本。用该法对CL-11G工程细胞表达尿激酶原水平的稳定性观察表明,经104代连续传代,其表达量终始保持在559.6±96.31IU/106细胞/天左右,符合生产细胞的要求。 相似文献
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人尿激酶原cDNA在昆虫杆状病毒真核表达系统中的高效表达 总被引:1,自引:0,他引:1
人尿激酶原是一种新型溶栓剂,优于尿激酶,具有血纤维蛋白特异性,为了在昆虫杆状病毒表达系统中高效表达pro-UK,我们在pAc373基础上,插入野生型AcMNPV polyhedrin启动子区-7~-1碱基序列,构建了一个高表达转移载体pAcYT.分别经三次克隆将pro-UK cDNA正向插入到转移载体pAc373或pAcYT的BamHI-KpnI位点上。用Lipofectin将pAcYT-UKDN 相似文献
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重组人尿激酶原的分离纯化及性质研究 总被引:1,自引:0,他引:1
本文报道从人尿激酶原(pro-urokinase,pro-UK)基因重组工程菌E.coliJA221表达产物的复性液中纯化尿激酶原的方法。复性产物经Zn^2+选择性沉淀,尿激酶抗体亲和柱层析,benzamidine-Sepharose CL 4B亲和吸附,即得比活达110000IU/mg的纯化产品。样品经SDS-PAGE鉴定,在还原及非还原条件下,均表现为分子量为43kd的单一条带。动力学研究测得 相似文献
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目前,尿激酶原(Pro-UK)作为~种新型溶栓剂,越来越多的受到重视。北京大学承担国家“863”课题“利用昆虫一杆状病毒系统表达Pro一UK”获得成功[川。表达P]-UK酶活为8O0~1600IU/rnl,本研究将Sfg细胞用4L转瓶和SL生物反应器培养,并用重组Pro-UK的病毒感染,以进行尿激酶原的表达。1材料与方法工.且材料1.1.ISfg细胞和表达Pro-UK的重组病毒北京大学胡美浩教授提供。1.1.24L转瓶机美国BellcoGlass公司。1.1.3SL生物反应器美国NBS公司。1.1.4尿激酶检测试剂中国药品生物制品检定所。1.2方法1.2.1细胞在4… 相似文献
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根据尿激酶原与尿激酶一级结构的区别并结合计算机分子模拟,设计合成了包括尿激酶原Thr152-Glu163肽段的13肽,然后与载体蛋白KLH偶联作为免疫原,用BI林巴细胞融合技术获得了3种尿激酶原特异性单克隆抗体,这3种抗体仅与尿激酶原和合成多肽反应 ,而不与尿激酶及其结构类似物组织型纤溶酶原激活剂,凝血酶,纤维蛋白原反应,琼脂双向免疫扩散实验及酶活性抑制实验表明,3种抗体均为IgG类的IgG1亚类,所有3种抗体均不抑制酶活力,探讨了这组抗体用于尿激酶原结构与功能及其定量,定性分析研究方面的可能性。 相似文献
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150~156位氨基酸缺失的变体尿激酶原scu-PA(dscu-PA)和未突变的尿激酶原(rscu-PA)均在E.coli中获得表达.经体外变复性,抗体亲和层析,2种表达产物均被纯化至银染1条带.经plasmin活化,从dscu-PA得到的变体双链尿激酶dtcu-PA,从rscu-PA得到的重组双链尿激酶rtcu-PA和天然双链尿激酶ntcu-PA对合成底物S2444具有相似的酶学性质,说明缺失突变未影响尿激酶的催化活性中心.对纤维蛋白 fibrin-clot和~(125)I-fibrin-sepharose诱导的纤溶, dtcu-PA明显优于 rtcu-PA,甚至还优于rscu-PA.dtcu-PA对血浆中纤维蛋白原的含量几乎无影响.结果表明dtcu-PA具有较高的fibrin选择性,同时也证明双链尿激酶能够通过改造而获得较高的fibrin选择性. 相似文献
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纤维素多孔微载体的制备及其用于动物细胞培养 总被引:7,自引:0,他引:7
将纤维素铜氨溶液喷洒至-40℃的硅油:正己烷=1:4的冷冻液中形成含冰晶的微球,用-30℃、40%的H2SO4再生纤维素,并用EDAE盐酸盐修饰其表面,制成适合动物细胞培养的纤维素多孔微载体。利用该微载体培养能分泌尿激酶原(Pro-UK)的重组CHO细胞,在100mL搅拌瓶中换液培养25d,细胞最高密度为6.3×106/mL,尿激酶原最高活性为2325IU/mL,共获28.7mg产品。之后转入1000mL搅拌瓶中培养,可观察到细胞可从种子微载体中自动转移到新微载体中生长繁殖直至所有微载体中都长有细胞。在25d二级培养中,细胞最高密度为7.3×106/mL,尿激酶原最高活性为3108IU/mL,共获含353mg尿激酶原的上清13.7L。在培养后期换用无血清培养基培养,细胞生长及蛋白表达水平正常。 相似文献
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以尿激酶的为材料,探索一种从SDS-PAGE胶上回收蛋白 做MALDI-TOF质谱的方法,所用的回收方法包括电洗脱、脱盐、除SDS等过程,电洗脱用的是高盐阻断法,脱盐用的超滤技术,去除SDS用的是冷丙沉淀法,结果证明,此方法至少对一些蛋白质是可行的。 相似文献
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人尿激酶原全长cDNA在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达 总被引:8,自引:1,他引:7
通过磷酸钙共沉淀技术,将含有尿激酶原cDNA的表达载体(pSV2-PrUK)与含有二氢叶酸还原酶基因的表达质粒pSV2-dhfr-或MMTV—dhfr共转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株(CHO-dhfr-)。利用选择培养基选择出二氧叶酸还原酶基因表达阳性(dhfr+)的转化细胞灶。用溶解圈法测定尿激酶型纤溶酶原激活剂(u—PA)的生物活性,其中两株显著高于其他株细胞,命名为CLF-14和CLF-8,表达水平依次为24Iu/106细胞/48h,16Iu/106细胞/48h。用ELLSA测定CLF一14和cLF-8细胞上清,表现为强阳性,阳性值比阴性对照值(P/N)大于10,CLF-14和CLF-8细胞表达量分别为0.14-o.22μg/106细胞/48h和0.08-O.14μg/106细胞/48h。分泌产物能被抗尿激酶(UK)血清抑制,而不被抗组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的抗血清和正常兔血清抑制。 相似文献
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利用寡核苷酸介导的定点突变方法 ,将重组人尿激酶原 ( recombinant single chain uroki-nase- type plasminogen activator,rscu- PA)中 1 51位赖氨酸 ( Lys1 51 )突变为谷氨酸 ( Glu1 51 ) ,1 54位精氨酸 ( Arg1 54)突变为谷氨酸 ( Glu1 54) ,得到尿激酶原变体基因 ( mscu- PA) .尿激酶原变体和未突变的重组尿激酶原均在 E.coli中获得表达 ,超声后所得包涵体经体外变复性并得到纯化 .结果表明 ,尿激酶原变体对纤溶酶 ( plasmin)的敏感性比未突变的重组尿激酶原低约 40 % ,转变纤溶酶原 ( Glu- plasminogen)为纤溶酶的活性基本相同 .两种产物经纤溶酶活化后 ,分别得到了双链尿激酶 ( rtcu- PA)和双链尿激酶变体 ( mtcu- PA) .它们对人工合成的发色底物 S2 4 4 4反应的动力学基本一致 ,对 Glu- plasminogen的催化反应的米氏动力学常数 Km 基本一致 ,但 mtcu- PA的 Kcat仅为rtcu- PA的 80 % .酪蛋白降解系统 ( caseinolytic system)实验表明 ,在纤维蛋白和纤溶酶原存在的情况下 ,尿激酶原变体较未突变尿激酶原能加快酪蛋白的降解 ,说明 mtcu- PA对纤维蛋白有一定的亲和性 相似文献
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对干燥前尿激酶原半成品的稳定性进行了观察。将半成品分装为数管 (1 40 μl/管 ) ,分别放在 4℃ ,- 2 0℃和 - 70℃ ,用纤维蛋白平板溶解圈法和 SDS- PAGE扫描法观察其 3个月内的活性及纯度变化。结果表明在 4℃条件下 ,处于溶液中的尿激酶原稳定性最差 ,一周后活性由 5× 1 0 4IU/ml降至 2 .3 8× 1 0 4IU/ml,单链比例由 97.7%降至 88.3 %,二周后单链比例进一步下降至 43 .8%。贮存在 - 2 0℃和 - 70℃条件下活性稳定 ,但单链也要缓慢裂解 ,一周后单链比例由 97.7%分别下降到 93 .9%和 93 .5 %,3个月后分别为 83 .7%和 86 .2 %,两者无明显差别 相似文献
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人尿激酶原基因在大肠杆菌中的高效表达 总被引:2,自引:1,他引:2
本文用PCR方法对人工合成的尿激酶原cDNA基因5'端进行改造,将之克隆到表达载体pKK233-2中,转化大肠杆菌JA221,经IPTG诱导,获得了占总菌体蛋白15%的高表达。SDS-PAGE和Western blot结果显示表达产物主要为单链尿激酶,并且在菌体内基本上以无活性的包含体形式存在,经体外变复性,从1升培养基中可获得300000单位的活性尿激酶原。 相似文献
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产尿激酶原CHO工程细胞无血清培基的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
在分析产尿激酶原CHO工程细胞对培基中氨基酸和糖利用的基础上,对DMEM:F12(1:1)进行初步优化。采用正交实验设计建立了无血清培基11G—SG—SFM和11G—SF—SFM。用11G—SG—SFM悬浮培养11G细胞,细胞增殖速率与含5%小牛血清DMEM: F12或CHO-s-SFM相当。用11G—SE—SFM培养11G细胞,细胞增殖缓慢,但有利于提高11G细胞表达pro—uK的水平,pm—UK的表达水平比含5%小牛血清的DMEM:F12培养提高80%左右。 相似文献
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人尿激酶原(pro-urokinase)基因在大肠杆菌中的高效表达 总被引:1,自引:0,他引:1
本文用PCR方法对人工合成的尿激酶原。DNA基因5’端进行改造,将之克隆到表达载体pKK233-2中,转化大肠杆菌JA221,经IPTG诱导,获得了占总菌体蛋白15%的高表达。SDS-PAGE和Westernblot结果显示表达产物主要为单链尿激酶,并且在菌体内基本上以无活性的包含体形式存在。经体外交复性,从1升培养基中可获得300000单位的活性尿激酶原。 相似文献
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采用PCR重叠延伸法和基因重组技术构建了人尿激酶原cDNA序列中缺失150~156位氮基酸的突变体,以COS-7细胞中获得暂时性表达以及在CHO细胞中稳定高效表达,其表达水平为450~500IU/106cell/24h,表达产物经SDS-PAGE电转溶实验和westemblot分析证明,细胞分泌的Pro-UK突变体与天然Pro-UK以及完整全长DNA序列表达Pro-UK的分子量相同,为54kDa.绝大多数为单链,比完整cDNA序列表达产物的单链比例明显增高,与纤维蛋白的亲和性有所提高。 相似文献
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将人工合成的寡核苷酸片段进行定向连接后, 得到编码纤维蛋白β链N端(β 15~42)多肽的基因片段及连接区片段(linker), 再与低分子量尿激酶原(scuPA-32k) cDNA分子进一步连接后, 得到了Fβ(15~42)/scuPA-32k的融合基因.在大肠杆菌中经过IPTG诱导表达, 经过变性及复性, Zn2+螯合层析及Sephacryl S200凝胶层析后, 目的蛋白被纯化.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)显示为一条蛋白质纯化条带, 分子质量为35 ku. 经纤维蛋白平板法测定比活为87 000 U/mg.经纤溶酶活化后的融合蛋白与低分子量尿激酶相比,对显色底物S2444酶促动力学性质相似.同时Fβ(15~42)/scuPA-32k具有较高的纤维蛋白的亲和性并能抑制纤维蛋白凝块的形成. 相似文献