环状芽孢杆菌C-2几丁酶基因的克隆

环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)C-2总DNA经PstI部分酶切后分离2～10kb的片段,插入质粒pUC19的PstI位点,转化大肠杆菌(Escherichia coli),利用几丁质平板从约8000个重组子中筛选到一个几丁酶基因阳性克隆(命名为pCHT1)。用12种限制酶对重组质粒进行的酶切分析表明,重组质粒中的插入片段长3.0kb,其中各有一个KpnI,SacI和SspI位点。把该克隆片段反向插入pUC19的PstI位点所得到的重组子同样具有几丁酶基因表达活性,说明此片段含有一个完整的几丁酶基因,其自身的启动子能被大肠杆菌转录系统所识别。Southern杂交证实了该片段来自于B.circulans C-2基因组,且以单拷贝形式存在,它不能与来自于其它7株几丁酶产生菌的总DNA杂交。     

硫霉素生物合成酶基因克隆的研究

利用NTG诱变从硫霉素产生菌中获得了生物合成阻断变株Y₃。通过对Y3变株原生质体形成、再生条件及DNA转化的研究,初步建立了以变株为受体的克隆系统,以pIJ680为载体,从硫霉素产生菌S．Cattleya中鸟枪克隆,获得了能使Y₃变株恢复产生硫霉素的酶基因。根据对Y₃积累的中间产物的分析,认为该酶基因可能与硫霉素生物合成过程中肽的环化作用有关。重组质粒分子大小为9．8kb左右,插入片段大小为4．5kb,分子杂交试验证明插入片段来源于硫霉素产生菌S．Cattleya。     

巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶基因的克隆和表达

我们分离到了一株产生分泌型青霉素G酰化酶的巨大芽孢杆菌(Bacillus megateriumBM1)。用pBR322作载体,将该菌的青霉索G酰化酶基因克隆到大肠杆菌(Escherichia coliMcl061)中,得到含有9．9kb插人片段的重组质粒pBmPA4。分析了该质粒的限制酶酶切图谱,并经体外缺失获得含4．9kb插入片段的质粒pBmPA5。pBmPA4和pBmPA5在E·coliMcl061中均能表达,表达受苯乙酸诱导。     

GL－7－ACA酰化酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达

本文报道了利用BamHⅠ酶解的载体pBR322 DNA与Sau3A部分酶解的假单胞菌Ps．130染色体DNA片段构建重组质粒,并用³²P标记的寡核苷酸探针从3205个含有外源片段的重组质粒中检测得到7株阳性克隆株。进一步经¹²⁵Ⅰ标记的抗体／抗原放射免疫反应、GL－7－ACA酰化酶活力测定以及酶反应产物的纸谱色层分析,由上述7株阳性株中鉴定出3株能在大肠杆菌中表达酰化酶活力的基因克隆株。对该3株菌的重组质粒——pMR 5、pMR 6和pMR-7-DNA的初步凝胶电泳分析表明,pMR 5和pMR 7质粒中插入片段的分子量为6．8kb,质粒pMR 6则带有5．7kb的外源片段。实验还比较了重组质粒pMR 5在8株不同的大肠杆菌宿主菌中,GL－7－ACA酰化酶的表达水平。     

扣囊拟内孢霉α-淀粉酶基因的克隆和在酿酒酵母中表达

以穿梭质粒pCN60为载体,大肠杆菌C600为受体构建了扣囊拟内孢霉(Endomycopsis fibuligera)G45 Sau 3A基因文库。从基因文库中提取重组质粒DNA并转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BJ1991,选出四个具有o-淀粉酶活性的转化子,琼脂糖凝胶电泳结果证实插入的DNA片段为9.0kb。对插入DNA片段亚克隆,确定。-淀粉酶基因位于PstI-Sall 3.9kb片段上,启动子位于PstI-EcoRI 的1.3kb片段上。用亚克隆PGK11.9kb片段置换。-淀粉酶启动子区,其转化子的e-淀粉酶活性有明显提高。     

琥珀酸弧菌L-天门冬酰胺酶基因的初级克隆和表达

本文以表达型噬菌体λgtll为载体,以及¹²⁵I标记的放射免疫抗体为探针,从EcDR I酶切的琥珀酸弧菌(Vyibrto succinogenes)染色体DNA片段中克隆得到携带天门冬酰胺酶基因的目的片段,在宿主菌E．Coil Y 1090 中得到表达。经酶解和凝胶电泳分析表明该插入DNA片段的分子量为5．8kb．重组DNA感染另一宿主菌E．ColiYl089后所产生的酶蛋白具有L-天门冬酰胺酶活力。用重组DNA(λgt11-AS8)为探针进行southern DNA杂交,琥珀酸弧菌染色体DNA的Ec0R I酶切片段中,出现一条位置在5．8kb处的杂交带,证明我们克隆到的携带L-天门冬酰胺酶基因的目的片段来自琥珀酸弧菌。     

链霉菌M1033 D－木糖异构酶的分子克隆

链霉菌M1033染色体DNA经BamH Ⅰ酶解后电泳,Southern转移。根据自测的链霉菌M1033 D－木糖异构酶氨基酸序列设计合成寡聚核苷酸探针x－2、x－3,以x－2、x－3及Am－pullariella sp3876 D-木糖异构酶基因(1．17kb)为探针进行杂交,确定与上述探针杂交最强处在15kb左右。从胶上分离出g-20kb大小的片段,克隆到EMBL 3载体中,经杂交筛选后,得到0．6％的阳性噬斑,其插人大小为13kh。将插入DNA的saIⅠ酶解片段(2．5kb)进一步亚克隆于pucl8,得到重组质粒puB l,经酶解图谱、部分序列分析和互补实验确定puBl含有完整的M1033 D-木糖异构酶基因     

苏云金芽胞杆菌cryⅡ基因的克隆和表达

分离的苏云金芽胞杆菌(Bacillus-thuringiensis)YBT-791对鳞翅目小菜蛾(Plutellaxylostella)有毒力,将其质粒DNA提纯,经HindⅢ酶切后与杀虫晶体蛋白cryⅡ基因探针杂交,显示出分子量分别为5kb和9．4kb两条DNA阳性片段。把5kb的DNA阳性片段克隆到pUCl8的HindⅢ位点上并转化大肠杆菌TGl,经酶切和杂交检测,证明斑点杂交阳性克隆子中含有5kb的cryI片段。把这个含cryⅡ基因的5kbHindⅢ片段进行亚克隆,将4kb的BamHI－Pstl酶切片段插入穿梭载体pXl61中,并用电脉冲法克隆于苏云金杆菌不产伴胞晶体的突变株中,得到产生单一cry Ⅱ基因编码的杀虫晶体蛋白的克隆菌株M一5。经电镜观察,该克隆菌株能形成出发菌YBT－791多种形态伴胞晶体中的一种方形伴胞晶体;经免疫双扩试验,它只能与Cry Ⅱ晶体蛋白抗血清形成沉淀线;经SDS—PAGE电泳,克隆菌的伴胞晶体只含有一种65kDa的晶体蛋白。生物测定结果表明它既对鳞翅目小菜蛾(Piutella xylostella)有毒性,又对双翅目致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)有毒性。     

酵母菌色氨酸合成酶基因的克隆与表达

用RemHI酶切酿酒酵母(Saceharomyces cercuisiae) 1412-4D染色体DNA,通过蔗糖梯度分离2-4kb DNA片段并插入穿棱质粒pCN60,构成1412-4D基因文库。从基因文库中提取重组质粒,转化受体菌C9(a,trp5,adcl,ade6),用直接功能互补法,分离到9株重组质粒,它们都含有3．2kb的TRP5 DNA片段,分别命名为pCN60(trps)1-90转化体中色氨酸合成酶的酶活水平比原始菌株1412-4D高3倍。     

苏云金芽孢杆菌以色列亚种130kd杀蚊蛋白基因的克隆与鉴定

以人工合成的130kd杀虫蛋白基因的18—base序列为探针,通过SoutherD分子杂交,验证了在Bacillus thuringiensis var.israelensis 4Q5菌株75Md质粒上含有130kd杀蚊蛋白基因,并且证明了提纯的晶体蛋白具有杀蚊幼虫活性。对该质粒进行HindIII完全酶切,以pUCl8为载体,以E．Coli TG1为受体,得到四个与探针有强杂交信号的阳性克隆,其中两个(pFH2,PFH4)含有5．2kb HindIII插入片段,包含第一类130kd杀蚊蛋白基因;另两个(pFHI,pFH3)含有2．3kb HindIII插入片段,包含第二类13 0kd杀蚊蛋白基因的3'部分。pFH2和pFH4中,第一类130kd杀蚊基因的插入方位不同。     

生米卡链霉菌变株丙酰化酶基因的克隆和表达

麦迪霉素产生菌生米卡链霉菌(streptomyces mycarofaciens)变株具有丙酰化酶活性,可以将螺旋霉素转化为丙酰螺旋霉素。为了进行丙酰化酶基因克隆,本实验以质粒pIJ702为载体通过鸟枪克隆法将变株DNA片段克隆至变铅青链霉菌TK54(Streptomyces livdansTK54),经薄层层析和高压液相色谱分析结果表明,在转化子中,N0．9菌株可以将螺旋霉素转化为丙酰螺旋霉素,这证明丙酰化酶基因已在变铅青链霉菌TK54中克隆并得到初步表达,№．9重组质粒插入DNA片段为4．16kb,经southern杂交表明确实来源于变株。此外还构建了N0．9重组质粒的限制酶酶切图谱。     

浑球红细菌谷氨酸合酶基因(glt)的克隆和图谱分析

利用转座子Tn5随机插入诱变筛选得到12株浑球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)氨同化缺陷突变株(Asm~-)。这些突变株胞内均无GOGAT活性,同时它们均无固氮酶活性(Nif~-),并且具有氮代谢多效性缺失表型(Ntr~-)。将含有Azorhizobium sesbaniae ORS571的完整glt基因的质粒pHB10转入突变株中能互补上述表型。通过筛选携带Tn5的R-prime质粒克隆了glt::Tn5片段。Southern杂交证明所克隆glt::Tn5片段与E. coli的gltBD基因有同源性。用此片段与以pLAFR3为载体所构建的R. sphaeroides 601基因文库进行菌落原位杂交筛选到了携带glt基因的cosmid pLT27。pLT27能互补所有12株R.sphaeroides氨同化缺陷突变株。酶切分析表明在该cosmid中插人的染色体DNA片段大小约为26.5kb。以pRK415为载体亚克隆了4.0kb与10.5kh的pLT27的Hindlll酶切片段,分别命名为pLTRK271与pLTRK272。pLTRK272能互补变种GT6、GT10、GT11,pLTRK…     

含质粒复制起始区ori44的苏云金芽胞杆菌解离载体的构建

将苏云金芽胞杆菌转座子Tn4430的解离酶识别位点res分别插入克隆载体pRSET B和pUC19得到质粒pBMB1201和pBMB1202。这两个质粒分别经BamHI/HindⅢ和EcoRI/HindⅢ双酶切回收含res位点的小DNA片段,与穿梭载体pHT3101经EcoRI/HindⅢ双酶切后回收的含大肠杆菌复制起始区、氨苄青霉素抗性基因和红霉素抗性基因的3.3kb片段连接,获得重组质粒pBMB1203。封闭pBMB1203两res位点外的BamHI和EcoRI位点后,得到解离载体pBMB1204。将来源于苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种YBT-1520的质粒复制起始区ori44片段插入pBMB1204的两res位点之间,得到解离穿梭载体pBMB1205。该解离载体插入壮观霉素抗性基因后电转化无晶体突变株,在辅助质粒所提供的解离酶作用下可发生解离消除抗性基因,解离频率为100%,解离后的质粒稳定性为93%。利用解离穿梭载体pBMB1205可在用抗性筛选到转化子后特定消除抗性标记基因和其它非苏云金芽胞杆菌DNA片段。     

青霉素G酰化酶调节基因的定位

为了定位青霉素G酰化酶的调节基因,从质粒Ppa6克隆了一系列青霉索G酰化酶基因(pac)的片段,将这些重组质粒转化E.coli D816,测定克隆片段对pac表达的影响。如果克隆片段含有完整的调节基因(pacR)。诱导剂不能使由高拷贝pacR表达的阻抑物失活,部分阻抑物结合pac操纵基困,阻碍RNA聚合酶对加pac的转录,因此pac的表达量降低。发酵结果表明,阻抑物可能是由pac结构基因内部的ORFⅡ编码的蛋白因子。     

麦迪霉素聚酮缩合酶基因的亚克隆及表达

利用与麦迪霉素生物合成有类似途径的放线紫红素聚酮缩台酶基因ActⅠ作为探针,将来源于麦迪霉素产生菌基因文库的与ActⅠ有同源性的阳性初级克隆pcN8812进一步缩小,亚克隆获得了2．4kb的麦迪霉素聚酮缩台酶基因,将其插入pwHM3载体中构建了重组质粒pcG2 DNA。pcG2 DNA在放线紫红素聚酮缩合酶基因缺陷型变株天蓝色链霉菌TKl7及螺旋霉素产生菌S．Ambofaciens中均获得表达。前者所得产物不同于麦迪霉素和放线紫红素,可能为新的杂合抗生素,后者能使螺旋霉素产量得到提高。另外pcG2 DNA在道诺红霉素产生菌调节变株S.peucetiusH6101中的表达产物经TLC及HPLC分析表明为紫红霉酮。pcG2 DNA在Tetracenomycin C产生菌S．Glaucescens中亦有一定的功能表达,而在红霉素产生菌红霉内酯阻断变株Saccharapolyspara erythraea WMH 15,26l中未观察到活性表达。推测pCG2 DNA具有一定调节或在某些聚酮类抗生素产生菌变株中超互补的功能。     

苏云金芽孢杆菌蜡螟变种伴孢晶体蛋白基因的克隆及表达

用改进的碱解法分析基因供体菌苏云金芽孢杆菌蜡螟变种81-6(Bacillus thuringiensis var.galleriae 81-6)株有两种小质粒和一种大质粒。 将碱解法抽提到的质粒用Pstl完全酶解,与同样用PstI完全酶解的载体质粒pcAMPUC连接,以此重组质粒转化苏云金杆菌无晶体蛋白突变株 Bacillus thuringiensis var,kurstaki HD-1 Cry—B株的原生质体。用ELlSA法筛选到一株阳性转化菌落,分析了其质粒组成和插入片段的大小。毒性试验显示阳性转化子对昆虫幼虫有毒杀作用。     

在变铅青链霉菌基因组中定域克隆外源DNA的置换性载体及通过反选择获得重组体的模式方法

ΦHAU3^R是变铅青链霉菌66中对噬菌体ΦHAU3显示抗性的基因,已从基因组中获得分离。将基因组中邻近于该基因两侧的一个3.5kb和另一个3.8kb的DNA片段分别以其在染色体上的天然取向插入到一个由pIJ101衍生的质粒pIJ653上,构建成pHZ806。然后在pHZ806上对应于pIJ101复制子的区域中插入一个spc/str抗性基因,同时在3.5kb和3.8kb片段之间插入一个潮霉素抗性基因(hyg),衍生出一个新质粒pHZ808。由于pHZ808中不具有完整的pIJ101复制功能区,所以它不能在链霉菌中复制。然而,在该质粒3.5kb和3.8kb片段之间插入的任何DNA片段,在导入到变铅青链霉菌中后都可借助于3.5kb和3.8kb两个片段与内源染色体的同源区域所发生的双交换而稳定地整入到内源染色体的特定区域(3.5kb和3.8kb片段之间),同时置换出染色体上的ΦHAU3-R基因。发生了这种基因置换的重组子菌株会对噬菌体ΦHAU3变得敏感,这种反选择方法可用来浓缩和初选携带定域插入片段的重组子。已利用潮霉素抗性基因(hyg)作为一个模式基因片段阐明了这种载体和这种在染色体上定域克隆外源基因片段的方法学和适用性。同时,用pHZ808作载体克隆另外的基因片段时还有另一个优越性：hyg可作为报告基因一同参与外源基因片段的定域整合,携带插入片段的重组子除了对噬菌体ΦHAU3显示敏感性以外,还对潮霉素显示抗性。     

青霉素G酰化酶操纵子的负调控因子的研究

青霉素G酰化酶(PA)操纵子的调节基因(pacR)存在于青霉素G酰化酶结构基因(pac)内部Dral-Taql一段约500bp的DNA片段内,此片段内含有2个ORF。2个ORF及其突变体分别克隆到pUC18得到一系列重组质粒,用这些重组质粒转化青霉素G酰化酶产生菌E.coliD816,测定克隆片段对PA表达的影响。如果克隆片段含有具功能的pacR,诱导剂苯乙酸(PAA)不能使由高拷贝却pacR表达的阻抑物全部失活,部分阻抑物结合pac操纵基因,阻碍RNA聚合酶对pac的转录,因此PA的表达量降低。结果表明,阻抑物是由pac结构基因内部的ORF2编码的蛋白因子,pacR即ORF2。RNA—DNA杂交实验证实了pacR在转录水平阻抑pac的表达。     

黑曲霉pepD基因阻断突变菌株的构建及功能分析

运用同源重组技术破坏了黑曲霉基因组中的pepD基因,该基因编码一种类subtilisin的胞外蛋白酶PEPD。实验以黑曲霉GICC2773基因组DNA为模板,PCR扩增pepD基因,并在此基因中间插入潮霉素抗性基因(hph)表达单元,由此产生了3.7kb的pepD阻断基因片段。将此阻断基因片段与载体pBS连接,构建成pepD基因阻断质粒pBSDH。采用原生质体-CaCl₂/PEG法将酶切阻断质粒得到的含pepD基因和hph表达单元的3.7kb线性片段转化AspergillusnigerGICC2773菌株,在含潮霉素的平板上筛选潮霉素抗性转化子,从这些抗性转化子中经PCR检测分离到到1个pepD基因阻断突变菌株?pepD66。外源漆酶分泌活性分析显示,黑曲霉pepD基因的破坏使其外源漆酶的分泌表达有所提高。     

利用强启动功能片段提高麦迪霉素4”，-羟基丙酰化酶基因的表达

用PCR技术将本室克隆到的强启动功能片段取代麦迪霉素丙酰化酶基因(mpt)的启动子或与mpt基因自身启动子串连,获得含mpt重组质粒pCHFPE3和pCHFPE2。用含有这两个质粒的Streptomyces lividans TK24对螺旋霉素进行微生物转化,结果表明,与含有原启动子的mpt．S．Lividans TK24(p．WFPE)相比,丙酰螺旋霉素的组分比例分别提高了89．02％和58．53％。含重组质粒pCHFPE2的螺旋霉素产生菌S．Spiramyceticus发酵产物中丙酰螺旋霉素的组分也有较大辐度的提高。说明利用该强启动功能片段可以提高麦迪霉素丙酰化酶基因的表达。