人TRAIL基因cDNA的克隆与序列测定

为研究人TRAIL的基因组结构,生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性,利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人急性早幼粒白血病细胞系HL-60细胞总RNA中扩增出人TRAIL基因编码区cDNA序列,将其克隆至pGEM-T载体中,序列测定表明,克隆片段与文献报道的人TRAIL基因编码区cDNA序列完全一致.     

人血小板因子4基因cDNA的克隆与序列测定

为研究人血小板因子4（hPF4)的生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性,运用反转录聚合酶链反应（RT－PCR）从人工白血病细胞系HEL细胞总RNA中扩增出hPF4基因cDNA序列,将其克隆至pUC18载体中。序列分析证实克隆片段与献报道的hPF4基因cDNA序列完全一致,说明已成为克隆到hPF4基因cDNA。     

应用抑制性消减杂交技术筛选流感病毒感染宿主应答基因

从宿主系统寻找病毒感染特异性相关的生物大分子是研究病毒药物靶标和诊断标志物的新方向 .为了筛选宿主细胞中流感病毒感染特异性基因 ,采用抑制性消减杂交技术 (SSH) ,以流感病毒A 鲁防 93 9(H3N2 )感染MDCK细胞及正常MDCK细胞为材料 ,构建病毒感染特异性差减cDNA文库 ,PCR法扩增鉴定其中插入片段大小 .从差减文库中随机挑取 10 0个克隆进行测序 ,用生物信息学方法对其同源性和基因功能进行分析和预测 .结果显示 ,成功构建了流感病毒感染特异性差减cDNA文库 ,文库中cDNA片段长度在 2 5 0～ 10 0 0bp之间 .从文库中随机选取 10 0个克隆测序 ,获得了 95个有效序列 ,经blast同源性分析发现 ,大部分基因为参与宿主细胞能量代谢和蛋白质生物合成过程中的基因 ;其中 19个为无任何功能线索的新基因片段 .流感病毒感染特异性差减cDNA文库的建立和筛选出病毒感染应答候选新基因cDNA片段 ,为发现新型流感病毒药靶和诊断标志物以及病毒感染机制研究打下基础     

苦瓜谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶cDNA的克隆及其特征分析

根据谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶(PHGPX)氨基酸序列中高度保守的区段设计引物,采用RACE-PCR从苦瓜中克隆到一个全长927 bp的cDNA片段.DNA序列的数据库分析比较表明,该cDNA编码167个氨基酸,含有动植物PHGPX的特征结构,是一个新发现的苦瓜PHGPX基因（mocPHGPX）.RNA印迹结果显示,该基因在苦瓜幼苗的根中表达相对较弱,茎的信号较强,叶中最强.这些结果将有助于深入研究植物PHGPX的功能以及全面了解植物抗氧化体系.     

DADS诱导HL-60 G2/M期阻滞消减文库的构建与初步筛选

目的:构建DADS诱导HL60-细胞G2/M期阻滞的差异表达文库,初步筛选相关基因.方法:分别提取无DADS和有DADS处理HL-60细胞的总RNA和mRNA,构建消减cDNA文库.随即挑选正向SSH的阳性克隆,PCR检测插入片段,将含插入片段的克隆测序.Blastn分析差异cDNA片段的同源性.结果:构建了DADS诱导人白血病HL-60细胞G2/M期阻滞差异表达文库,其中包含120个正向SSH的克隆和100个反向SSH的克隆.50个随机正向SSH的克隆测序、比较同源性,发现5个新EST片段,已经在GenBank中登录.结论:所构建的DADS诱导人白血病HL-60细胞G2/M期阻滞消减文库为进一步筛选白血病HL-60细胞G2/M期阻滞相关基因奠定了基础.     

筛选代表小鼠植入前胚胎紧密化相关基因的EST

分别收集181及241枚昆明白小鼠8细胞早期胚胎及8细胞紧密化胚胎,采用SMART PCR方法直接合成胚胎双链cDNA.进而运用抑制消减杂交技术(SSH)对8细胞早期胚胎及8细胞紧密化胚胎的基因表达进行研究,并将所获得的差异表达产物按片段大小分段分离纯化后克隆入pUCm-T载体中,经PCR鉴定后挑选阳性克隆进行测序,筛选出27个代表8细胞早期胚胎和紧密化8细胞胚胎差别表达基因的cDNA片段;经与GenBank中收录的序列进行同源性匹配分析,证实其中17个eDNA片段为新的EST,提交GenBank后被接受并给予了新序列编号.这1 7个片段均可能为与紧密化密切相关的新基因的表达片段,为今后进一步克隆新的紧密化相关基因的全长cDNA及后续新基因的结构和功能研究打下基础.通过采用不同长度大小片段分别克隆的方法,可获得较长片段的EST,避免差异表达大片段的丢失.     

大鼠肝脏脂酶基因的PCR扩增、序列分析和克隆

报导了应用聚合酶链式反应（PCR）技术,扩增大鼠肝脏脂酶基因及其克隆和序列分析的结果．经31个循环的扩增,得到大鼠肝脏脂酶及其N端结构域的cDNA,前者为1508bp的片段,后者为1076bp的片段．克隆后,对此二片段进行了限制性内切酶物理图谱分析,测定了DNA序列,并已将它们克隆到表达载体pGT－d中．     

一个新型的棉花几丁质酶基因

在对外源水杨酸处理的低酚品系棉花(Gossypium hirsutum cv.CRI13)(中棉13)幼苗进行RT—PCR差异分析并分离出一个cDNA片段的基础上,采用电子克隆和分子克隆相结合的方法克隆出该片段的全长序列,并对其cDNA和核DNA序列进行分析,结果显示该基因是一个新型的几丁质酶基因,命名为GhChia7.推测的GhChia7氨基酸序列与Ⅰ和Ⅱ型几丁质酶的相同性仅有30％,其结构特征也与已鉴定的Ⅰ-Ⅳ有差异,是一个新型的几丁质酶(Ⅶ型)。Northern杂交结果显示,该基因在棉花幼苗的根中以及棉花纤维中信号较强,且在棉花子叶中受水杨酸诱导表达,用7．5mmol／L水杨酸处理18h后mRNA水平达到最大值。本研究的结果显示GhChia7可能会在棉花抗病防卫反应中发挥重要作用。     

人TRALL基因cDNA的克隆与序列测定

为研究人 TRALL的基因组结构 ,生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性 ,利用反转录聚合酶链反应 (RT- PCR)从人急性早幼粒白血病细胞系 HL - 6 0细胞总 PNA中扩增出人 TRALL基因编码区 c DNA序列 ,将其克隆至 p GEM- T载体中 ,序列测定表明 ,克隆片段与文献报道的人TRALL基因编码区 c DNA序列完全一致。     

APC11基因真核表达质粒构建及鉴定

目的克隆扩增APC11开放阅读框基因片段,构建其真核表达重组质粒,为后续研究其功能做准备。方法按照GenBank中人APC11序列设计引物,以HeLa细胞cDNA为模板,扩增出基因片段。该片段与真核表达载体pEGFP-C1连接,得到的重组质粒经双酶切和测序鉴定后用Western印迹检验表达。结果扩增片段长度为285bp,重组真核表达质粒经双酶切鉴定后测序鉴定正确。Western印迹证实pEGFP—C1-APC11在真核细胞内表达。结论成功克隆了APC11基因并构建了pEGFP—C1-APC11真核表达重组质粒,Western印迹证实其表达良好,对该基因功能的深入研究打下了坚实基础。     

鼻咽癌上皮细胞株HNE1差异表达基因的分离与鉴定

为了分离鼻咽癌差异表达基因 ,应用抑制性扣除杂交技术 ,在正向抑制性扣除杂交中 ,以鼻咽癌上皮细胞株HNE1cDNA作为检测子 ,以人胚鼻咽上皮细胞cDNA作为驱赶子 ;在反向抑制性扣除杂交中 ,以人胚鼻咽上皮细胞cDNA作为检测子 ,以鼻咽癌上皮细胞株HNE1cDNA作为驱赶子 ,分别通过抑制性扣除杂交 ,构建了鼻咽癌上皮细胞株HNE1表达下调和表达上调的两个扣除cDNA文库 .从鼻咽癌相关的扣除cDNA文库中随机挑取 1 2 0 0个克隆 ,采用菌落PCR扩增其插入cDNA片段 ,自动点膜制备成cDNA微阵列膜 ,分别用鼻咽癌上皮细胞株HNE1、人胚鼻咽上皮mRNA经逆转录标记cDNA探针 ,分别与cDNA微阵列膜杂交 ,通过杂交信号的自动扫描分析 ,对杂交信号存在 5倍差异的克隆进行测序 ,获得了 1 0个鼻咽癌差异表达基因的cDNA片段 ,其中 3个为新基因序列 ,其GenBank登录号为 :AF5 1 0 1 88、AF5 1 0 1 89和AF5 1 0 1 90 ,7个代表已知基因序列 .采用RT PCR证实S1 0 0A8,CK1 9和RBP1基因在人胚鼻咽上皮中高表达而在鼻咽癌细胞株HNE1中低表达 .这些结果显示上述基因可能是鼻咽癌发生的重要因素     

昆虫细胞色素P450基因的克隆及其策略

本记述了目前已克隆的105个昆虫细胞色素P450基因cDNA和片段,它们分属CYP4、CYP6、CYP9、CYP12、CYP18和CYP28等6个家族：同时,综述和分析了克隆这些基因、cDNA和片段所采用的策略及其优缺点。     

改良Pereira髓过氧化物酶快速染色法及应用

目的　为了使髓过氧化物酶 (MPO)染色快速准确、安全可靠 ,对Pereira碘化钾MPO染色方法做了进一步改进。方法　采用将碘化钾溶于Wright Giemsa染色液中的新配方 ,使试剂更稳定、保存时间长 ,并简化了操作、缩短了染色时间。结果　此法与Washburn联苯胺法比较 ,两者阳性率十分相近 ,差异无显著性意义 (P >0 0 5 )。结论　改良Pereira髓过氧化物酶法阳性反应标本存放多年不褪色 ,是目前众多碘化钾法中较理想的MPO染色方法之一。     

性逆转石斑鱼性腺差异表达基因的克隆和筛选

以 17α 甲基睾丸酮 (17α MT)饲喂 2～ 4龄赤点石斑鱼 (Epinephelusakaara) ,成功地促使其性转变为具有生殖功能的雄鱼 .应用抑制性差减杂交 (SSH)技术构建了石斑鱼性反转前后性腺组织的SMARTcDNA文库及其cDNA差减文库 ,从中随机挑取 12 0 0个克隆进行了PCR和斑点杂交筛选 ,得到 12 0个差异表达cDNA片段 .挑选 71个cDNA克隆测序 ,将所测序列经GenBank检索和生物信息学比较 ,发现有 5 1个cDNA片段序列无明显的同源性 ,2 0个片段与报道的基因有较高同源性 .在这 2 0个具同源性的片段中有 3个片段可能是与性别分化密切相关的重要功能基因 ,它们是钙调蛋白基因、活性蛋白激酶C受体基因和一氧化氮合酶蛋白抑制剂基因 .这 3个基因被分别命名为鱼钙调蛋白基因 (GenBankaccession :AY2 8136 3)、鱼活性蛋白激酶C受体基因 (GenBankaccession :AY2 8136 4)和鱼一氧化氮合酶蛋白抑制剂基因 (GenBankaccession :AY2 8136 5 ) .     

一个人类凋亡相关新基因TFAR15的cDNA克隆化与表达

运用cDNA RDA(cDNA Representationaldifferencesanalysis)的方法 ,已获得了在细胞因子依赖性红白血病细胞系TF 1中撤除GM CSF(Granulocytemacrophage colonystimulatingfactor)后表达增高的多个基因片段 ,其中一个经GenBank检索为新基因 .利用RACE (rapidamplificationofcDNAends)和EST (expressedsequencetags)重叠片段拼接的方法克隆了该基因的cDNA全长序列 ,命名该基因为TFAR1 5 (TF 1cellapoptosisrelatedgene 1 5 ) .TFAR1 5全长cDNA由 1 2 1 8个碱基组成 ,其分布十分广泛 .随着GM CSF的去除 ,TF 1细胞中TFAR1 5的mRNA和蛋白表达水平均有不同程度的增高 .体外活性研究发现 ,重组TFAR1 5蛋白片段可抑制人胚肾细胞 2 93的自然凋亡 .     

猪垂体中猪生长激素基因的克隆和部分序列分析

从猪垂体中提取出DNA,以EMBL3噬菌体作裁体,构建了染色体基因文库。用全长的猪生长激素(pGH)cDNA作探针,经原位杂交,筛选出5个阳性克隆。提取其中一个阳性克隆的DNA,通过斑点杂交,酶解和Southern印迹,表明它含有全长猪生长激素基园,将sma Ⅰ酶解后soufhem印迹为阳性的两个片段进行了亚克隆,对其中含有猪生长激素基因sma Ⅰ位点上游序列的片段进行了部分序列分析,并和已发表的相应序列进行了比较。     

传染性支气管炎病毒核衣壳蛋白基因克隆及在E.coli中的表达

核衣壳蛋白基因 (N基因 )是传染性支气管炎病毒的重要结构基因 .根据已报道的序列设计引物 ,利用RT PCR技术从病毒RNA中扩增和克隆到了N基因的cDNA ,并测定了核苷酸序列 .克隆的N基因片段ORF全长 12 30bp ,编码 4 0 9个氨基酸 .将该片段序列与其他IBV病毒株比较 ,核苷酸的同一性为 87 0 %～ 98 6 %,氨基酸的同一性为 91 0 %～ 98 1%.将该cDNA亚克隆到pBV2 2 0表达载体 ,转化大肠杆菌DH5α菌株 ,Western印迹检测 ,获得了分子量约 4 5kD表达蛋白     

燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ基因3′端cDNA的克隆及分析

实验利用3′-RACE技术进行燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ(Oglc13Ⅱ)3′末端cDNA的快速扩增并进行序列分析。将0.01%的HgCl2诱导处理24h之后的燕麦(Avena Sativa)幼叶作为材料,利用RT-PCR技术得到Oglc13Ⅱ的部分cDNA片段,根据此片段设计一条特异性上游引物,反转录引物中的部分序列即3′sites Adaptor Primer作为下游引物,按3′RACE试剂盒(Takara)操作流程进行Oglc13Ⅱ3′末端cDNA的快速扩增,成功获取837bp的3′-RACE反应产物,通过BLAST技术,发现该片段与许多植物β-1,3-葡聚糖酶基因具有较高的相似性(50.0%~72.0%)。因此认为成功克隆了Oglc13ⅡcDNA的3′末端序列。     

燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ基因 3'端cDNA的克隆及分析

实验利用3'-RACE技术进行燕麦β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ(Oglc13Ⅱ)3'末端cDNA的快速扩增并进行序列分析.将0.01%的HgCl2诱导处理24h之后的燕麦(Avena Sativa)幼叶作为材料,利用RT-PCR技术得到Oglc13Ⅱ的部分cDNA片段,根据此片段设计一条特异性上游引物,反转录引物中的部分序列即3'sites Adaptor Primer作为下游引物,按3'RACE试剂盒(Takara)操作流程进行Oglc13Ⅱ3'末端cDNA的快速扩增,成功获取837bp的3'-RACE反应产物,通过BLAST技术,发现该片段与许多植物β-1,3-葡聚糖酶基因具有较高的相似性(50.0%～72.0%).因此认为成功克隆了Oglc13ⅡcDNA的3'末端序列.     

RAI——一候选的人肺腺癌分化相关基因

通过进一步分析采用全反式维甲酸(all trans retinoic acid,ATRA)诱导人肺腺癌GLC-82细胞,经cDNA文库消减杂交构建的cDNA消减文库,得到一在ATRA诱导GLC-82细胞分化过程中激活表达(retinoic acid induced,RAI)的基因的cDNA片段,应用菌落原位杂交技术在胎脑cDNA文库中进行筛选,克隆RAI的全长cDNA序列并测序.RT-PCR分析表明,RAI在多种胎儿组织中表达.结果表明,RAI可能与细胞分化有关,并在细胞基本生命活动中发挥重要作用.