固体发酵饲料糖化酶

糖化酶是目前生产量最大、应用最广泛的工业酶制剂之一。糖化酶是以液体发酵方法生产,经过各种复杂的后处理过程得到精制产品。在饲料工业中使用如此高纯度、高成本的精制酶制剂将增高饲料成本。为降低生产成本,本室研究了固体培养生产糖化酶的生产工艺,并且对酶学性质进行了研究。1　材料和方法11　菌种:ＨＷ717、ＨＷ056、ＨＷ039等,本所微生物研究室保存。12　固体发酵方法:以250ｍｌ三角瓶装固体培养基(湿基)10ｇ,基础培养基组成:麸皮中添加2%的硫酸铵。培养基在1ｋｇｆ/ｃｍ2压力下灭菌30ｍｉｎ后使用。以0.2%接种量接种,在28℃下静止…     

糖化酶生产工艺的改进

在前面研究的基础上,仍采用黑曲霉突变株ＷＭＣ－１５为产酶菌株,对糖化生产和提取工艺进行了较大的改进,提高了菌株的产酶缩短了发酵时间,提高回收率,大幅度降离糖化酶的生产成本,按最佳的培养基配方和发酵工艺条件,采用突变株ＷＭＣ－１５仅发酵９６小时左右,酶活力可达２５,０００ｕ／ｍｌ以上,对提高我国的糖化酶活力及设备利用率都具有现实意义。     

葡萄糖氧化酶法测定糖化酶活力

糖化酶也叫葡萄糖淀粉酶(glucoamylase),是应用于葡萄糖、酒精等生产的一种工业用酶。测定糖化酶活力是以在一定条件下作用于可溶性淀粉后生成的葡萄糖的毫克数来表示的。但在实际测定时,一般都采用斐林法和次亚碘酸盐法等定量测定还原糖总量的方法。我们在糖化酶研究工作中发现,用上述方法能比较准确     

糖化酶及其基因研究进展

论述了糖化酶的产生、酶的性质和分子结构,以及糖化酶对淀粉的作用机制,并且介绍了利用基因工程技术构建糖化酶工程菌的研究进展。     

我国商品糖化酶酶制剂中分解生淀粉糖化酶活力的比较

共收集国内有代表性酶制剂厂生产的糖化酶商品样２１份,测定其分解生淀粉糖化酶活力结果表明,万单位糖化酶含分解生淀粉糖化酶活力最高样品为１０８３８单位,最低为１０３９单位,平均为５４５０单位。取分解生淀粉糖化酶活力高、中、低的样品,进行了生淀粉吸附分离,并经凝胶电泳鉴定,其吸附的酶与测定的酶活力高低相符。     

黑曲霉糖化酶高产株糖化酶cDNA的合成、克隆和序列分析

从黑曲霉糖化酶高产株T21分离总Poly(A)⁺RNA,经反转录合成cDNA,建立cDNA库。以糖化酶基因片段为探针从cDNA库进行筛选,阳性率达1．6％。由限制酶酶切图谱确定30％的阳性克隆携带全长的糖化酶cDNA。序列分析结果表明,菌株T21虽经多次诱变获得,但糖化酶基因编码区序列与文献报道的黑曲霉糖化酶基因编码区序列一致。从菌株T2l构建的cDNA库中含糖化酶cDNA插入片段的克隆的高比率充分证明,菌株T21中稳态糖化酶mRNA含量很高,显然这是突变株T21糖化酶高产的重要原因之一。     

离子型多孔聚苯乙烯固定化糖化酶

 用离子型多孔聚苯乙烯固定化了糖化酶。研究了制孔剂比例对载体孔径的影响。用麦芽糖做底物,三乙醇胺基聚苯乙烯载体使固定化糖化酶的最适pH向左移动约2个pH单位;磺酸基苯胺基聚苯乙烯载体使固定化糖化酶最适pH向右移动2个单位。固定化酶最适pH的移动值随缓冲液浓度的增加而减少。用可溶性淀粉为底物时固定化糖化酶的pH—活力曲线变宽。用dextrin作底物,天然糖化酶的Km为3.47×10~(-3)mol/L,固定化糖化酶的素质K_m为4.17×10~(-3)mol/L,表现K_m(app)为1.11×10~(-2)mol/L。延长重氮化反应时间,得到2000ug~(-1)干胶的高活力固定化糖化酶。     

黑曲霉糖化酶高产菌株的糖化酶结构基因的分离及其序列分析

从糖化酶高产菌株(Aspergills niger)T21中分离出染色体DNA.Southern印跡分析表明糖化酶结构基因位于约2.5kb的EcoRⅠ-EcoRV片段中.该染色体DNA经EcorⅠ、EcoRⅤ完全酶切后,用琼脂糖凝胶电泳分离,回收2.0—3.0kb的片段,与载体pBR322连接后转化宿主菌大肠杆菌DH5,获得转化子.通过原位杂交,从转化子中筛选出4个阳性克隆.阳性克隆的进一步酶切鉴定及序列分析表明,黑曲霉T21糖化酶结构基因大小为2.3kb,含有4个内含子.     

黑曲霉糖化酶热稳定性的研究

本文报导了黑曲霉糖化酶三种同工酶的相似的热稳定性。活力测定表明,糖化酶在60℃时易失活,三个同工酶的半衰期分别是GⅠ30’,GⅡ48.,GⅢ80’;而对40℃和50℃则有较强的抗性,但其活力曲线呈现复杂的变化,显示出在一定时间内,温热可以诱导酶活提高。紫外吸收及紫外差示光谱表明,在热处理过程中引起了酶分子的构象变化。本文还对酶分子的构象及活力变化的关系进行了探讨。 糖化酶(glucoamylase EC.3.2.1.3)水解淀粉为葡萄糖,是食品酿造工业的重要用酶之一。我们已经从黑曲霉AS.3.4.309变异株B-11发酵液中分离提纯了三种糖化酶的同工酶(1),并对其基本性质进行了研究。本文主要对黑曲霉糖化酶的热稳定性作了进一步的探讨。     

铜金属螯合载体固定糖化酶

[目的]制备出含Cu2+的琼脂糖-IDA螯合载体及对其固定糖化酶工艺条件进行优化.[方法]利用金属螯合配体(IDA-Cu2+)与蛋白质表面供电子氨基酸相互作用的原理制备载体,采用紫外分光光度法测定不同影响因素下固定化糖化酶的酶活.[结果]Cu2+的加入量和固定化过程的酸度比给酶量对固定化糖化酶的活性影响还要大,在给酶量80 mg/g载体、1.0× 10-2 mol Cu2+/g载体、pH 4.6和固定化4h的固定化条件下,固定化酶活为252.1 U/g,重复使用5次后酶活为首次固定化酶活的65.1％.[结论]该Cu2+-IDA-金属螯合琼脂糖可用于淀粉水解糖化酶的优良固定化载体材料.     

黑曲霉糖化酶高产和低产菌株糖化酶基因调控区的克隆及其分析比较

以PCR合成的糖化酶高产菌株黑曲霉(Asp. Niger)T21糖化酶基因5’近端非编码区588bp(EcoRI-BamHI)的序列为探针,从T21染色体DNA中克隆到近2.0kb的糖化酶基因5’端非编码区序列,并以此序列为探针从糖化酶低产菌株黑曲霉3.795(T21的诱变出发株)的染色体DNA中克隆到1.5kb的糖化酶基因5’端非编码区序列。该二序列的分析测定结果表明,其结构特征与文献报道的黑曲霉糖化酶基因5’端非编码区的基本一致,被称为“核心启动子”(Core promoter)的TATAAAT框及GCAAT框,分别在翻译起始点的-109bp及-178bp处。此外,在曲霉amdS,amyB基因中已发现有调控功能的CCAAT序列存在于-449bp和-799bp处。高产和低产菌株糖化酶基因5’端非编码区序列的分析比较结果表明,有9个部位的碱基发生了变化。此实验结果为进一步研究黑曲霉糖化酶基因在转录水平上的调控规律打下了基础。     

产糖化酶黑曲霉的固定化研究

采用多孔聚酯材料作为固定化载体,考察并比较了载体吸附固定化黑曲霉菌丝细胞的条件,当菌丝体细胞与载体预培养的条件为pH值5.0、孢子浓度为105个/ml、固液比为1/75时,有利于菌丝体的生长、吸附固定及发酵产酶.在产糖化酶的发酵过程中,与游离菌丝体细胞相比,发酵过程持续产酶时间有一定程度的延长,产糖化酶活力始终高于游离菌丝体.     

黑曲霉糖化酶基因启动子功能鉴定

从糖化酶工业生产菌株Aspergillus nigerCICIM F0410基因组DNA中扩增糖化酶基因启动子(PglaA),并将该启动子替换质粒pRS303K上KmR基因启动子,构建成糖化酶基因启动子功能检测质粒pRS-PglaA-KmR。将pRS-PglaA-KmR转入E.coliJM109中,得到重组菌E.coli(pRS-PglaA-KmR)。通过对重组菌的氨基糖苷磷酸转移酶基因活性检测,表明PglaA在E.coli中具有驱动KmR基因表达的活性。采用不同诱导物进行培养发现,葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖或玉米淀粉,可以不同程度增强PglaA的强度。     

黑曲霉糖化酶基因表达调控的研究：I.高产及低产菌株糖化酶表达…

对黑曲霉高产菌株Ｔ２１和原始菌株３．７９５糖化酶的基因表达从菌体生长、酶形成动力学、ｇｌａＡ基因拷贝数、糖化酶ｍＲＮＡ含量及其稳定性等多个方面进行了分析和比较。Ｔ２１和３．７９５糖化酶的大量产生均自菌体生长的静止期开始。培养７２ｈ捂得的菌体浓度相同,但Ｔ２１产生的糖化酶量为３．７９５的１０￣１７倍,说明糖化酶产量的差异不是因生物量或酶起始合成期不同引起的,而是由于细胞内酶表达量不同引起的。Ｎｏｒｔ