DNA序列中限制酶切割位点的分布

本文以人类、小鼠、大鼠和病毒基因组中的DNA序列为材料,分析了其中40种II型限制性核酸内切酶识认位点的数量和分布情况。发现人鼠序列中绝大多数酶的切点数量可以通过序列中单核苷酸或双核苷酸的频率来预测,而切点在序列上的分布也是随机的。例外的情况是人鼠序列中酶EcoRII(识认CCWGG)和MnlI(CCTC)的切点显著偏多,而DpnI*(GATC)的切点显著偏少;MnlI的切点倾向于聚集一处。病毒基因组中酶切位点也基本上是随机分布,但基因组间差异很大,跟人鼠序列差别也大,特别是噬菌体T7中有多达17种酶的切点显著偏少。文中讨论了所得结果对构建限制酶切图谱的理论计算以及对限制酶显带机理的意义,特别指出显带过程在酶的切点达到所要求的浓度时,跟酶的识认片段的专一性、酶切位点的数量都没有关系,而取决于染色体不同区段抵抗酶切破坏的能力。     

萘质粒ND1.860HindⅢ片段的分子克隆和限制酶图谱

萘质粒ND1.860经限制性核酸内切酶HindⅢ完全消化和部分消化所产生的限制片段,分别在大肠杆菌质粒pBR322中克隆。通过对含有ND1.860HindⅢ片段的17个重组质粒进行限制酶分析,建立了ND1.860质粒的HindⅢ、EcoRⅠ和XbaⅠ种内切酶26个切点的酶切图谱。     

一组DNA序列分析的微机程序

本文介绍了作者编制的一组用于分析DNA序列资料的计算机程序。程序用BASIC语言写成,在IBM微型机伤调试运行,包括序列打入、核苷酸频率统计、转译及限制酶切点查找等级部分。     

氧化硫硫杆菌pTt54质粒的限制性酶切分析及其在大肠杆菌中的克隆

对pTt54质粒进行了限制性酶切分析,实验证明pTt54质粒上有一个EcoRI切点和一个Sau3Ai切点,无BamHI、BclI,BglII、HindIII,Sall、XhoI、Kpnl、PvuII、Pstl切点。绘出了该质粒的酶切图谱,分子量为2.14Kb。pTt54质粒分别通过EcoRI位点和BamHI位点与pBR 325质粒重组,得到了重组质粒pSDT541和pSDT542,这两个质粒均可作为氧化硫硫杆菌遗传信息转移系统的载体。     

铜绿假单胞菌PIC－N萘降解基因的研究

铜绿假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＩＣ－Ｎ对萘、邻苯二甲酸、水杨酸等有较强的氧化能力。发现该菌株以禁为底物可诱导产生芳香烃分解酶系。菌株中存在一个５７．４ｋｂ的质粒,经限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ处理可产生７个片段,用限制性内切酶ＥｃｏＲⅠ处理可产生８个片段。将以限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ部分酶切的片段克隆至大肠杆菌质粒ｐＭＦＹ４３上,获得２９个克隆株。通过对含有菌株ＰＩＣ－Ｎ质粒ＨｉｎｄⅢ片段的７个重组质粒进行限制酶分析,绘出了该质粒ＨｉｎｄⅢ内切酶７个切点的酶切图谱。     

树鼩高重复顺序TSr(Bgl-Ⅱ)-1的核苷酸顺序分析及与灵长类α-顺序的比较

为了确知树鼩高重复顺序与灵长类动物的类α顺序有无相似处,我们再次把TSr(BglⅡ)-1片段克隆在质粒pWR33上,用“双链引物测序法”测得全部核苷酸顺序为353bp。并将此顺序与灵长类动物的类α顺序进行比较,发现其中有三个对应位置上与类α顺序的“冷点”保守区序列相似,其中还有一个有碱基变异的EcoRⅠ酶切点和四个潜在的HindⅢ酶切点,另外有两个与“凉点”区一致的小顺序,对这些相似性进行了讨论。     

一种在消除限制酶切点的实验中有效的富集方法

在基因工程的载体构建过程中,常常要遇 到需要消除某些多余的限制酶切点的操作。如 果要消除两个同种限制酶切点中的一个,通常 采用步骤如下：酶切DNA样品、分离部分酶 切后的DNA片段、用DNA聚合酶I Klenow 片段填平切口的粘性末端、再以T4连接酶进行 环化连接、最后进行转化、对转化子进行质粒 DN     

绿色木霉纤维素酶CBHⅡ基因的结构研究

实验经限制性酶切和双向Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交将重组质粒ｐＣＢＨＩＩ－１４的１４ｋｂ外源片段上的绿色木霉纤维素酶ＣＢＨＩＩ基因定位于４．４ｋｂ的ＥｃｏＲＩ片段上,将该片段克隆于质粒ｐＵＣ１９,获得重组质粒ｐＣＢＨＩＩ。通过限制性分析构建了ｐＣＢＨＩＩ上４．４ｋｂＥｃｏＲＩ片段的物理图谱。在此基础上用质粒制作该片段的亚克隆,采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测定了含绿色木霉纤维素酶ＣＢＨＩＩ基因的４０７４ｂｐ的ＤＮＡ序列,由ＧＴ－ＡＧ规则和ｃＤＮＡ序列推知该结构基因由４个外显子和３个内含子组成,总长１６１３ｂｐ,５′端存在与一般真核基因类似的两个特征性调控序列,但３′端不存在真核基因通常具有的特征序列而存在功能未明的短重复序列和嘧啶富集区。并对纤维素酶基因间的同源性和可能的功能作了初步的探讨。     

谷氨酸棒状杆菌启动子在枯草芽孢杆菌中的克隆及其序列分析

利用枯草芽孢杆菌启动子探针质粒pPL 603为载体,从谷氨酸棒状杆菌1014—6染色体DNA上克隆到一个有较强启动功能的DNA片段。生物素标记的DNA—DNA分子杂交实验证明该片段确实来自谷氨酸棒状杆菌1014—6染色体DNA。在绘制该片段限制酶酶切图谱的基础上,经另一个启动子探针质粒pPL 703的亚克隆,将其启动子功能区定位在Bamm酶切片段中。对后者进行了核苷酸序列分析,发现它具有棒状杆菌类启动子的－35区和－10医序列。     

DNA长链分子上核酸内切限制酶识别位置的预测

本文报道了我们自编的能在TRS-80(Ⅰ)型微处理机上执行的用于构造DNA分子的限制性内切酶酶谱的计算机程序。并给出了73种不同专一性的限制性内切酶在噬菌体M13 DNA(6407个核苷酸残基)上的识别位置(或切点位置)处理结果。该程序的最大优点是被检索的核酸序列,其长度在原则上是不受限制的(即不受计算机内存容量的限制),用户可根据需要对输入的序列进行任意的插入和删改。     

酵母质粒的结构,功能及其基因表达 Ⅰ.从单倍体酵母菌株7209-1A(saccharo myceS cerevisiae)中纯化的质粒及其鉴定

单倍体酵母菌株7209-1A(Saccharo-myces cerevisiae)中,含有2微米长的质粒,使用改进的抽提方法能快速简便制备酵母总DNA,用酸酚法或电泳割胶后经玻璃粉吸附法代替氯化铯-溴乙锭密度梯度超离心制备纯的酵母质粒,经电泳、电镜鉴定,该质粒为2.1±0.1微米长,存在两个不相连的反向重复顺序,电镜观察到哑铃状结构,其柄长为0.2±0.03微米,大环约2800bp,小环约2400bp,限制酶Pstl只有一个切点,而EcoRl酶的切点与A364A的完全不同。     

植物乳杆菌KLDS1.0728质粒p141的分子分析

对分离自植物乳杆菌KLDS1.0728的质粒p141进行了全序列测定,结果显示,该质粒全长为3597bp,平均G+Cmol%值为38%,并利用DNAMAN6.0软件得到该质粒限制性内切酶图谱。经NCBI网站ORFFinder软件分析确定其编码序列即ORF为15个,通过与公共数据库比对,发现可以识别功能的ORF有2个,其中包括质粒复制所必需的rep基因,p141的rep基因与已知序列的植物乳杆菌WCFS1内源质粒pWCFS101以及植物乳杆菌内源质粒pM4的复制蛋白基因相似性高达91%。根据rep基因的相似性比较,判断p141的复制模式归属于RCR模式的GroupIII组,即pC194家族。另外,还发现质粒p141中存在mob基因,表明该质粒具有水平转移能力。但没有发现Tn4430转座子以及转座酶基因topl和topA,所以可以判断该质粒的基因比较稳定。此外,还发现该质粒序列中存在一定的与质粒复制和转移调控以及蛋白质表达等有关的重复序列,其对调控质粒的拷贝数有一定意义。     

脂肪嗜热芽孢杆菌质粒pFD101的限制性内切酶图谱

从脂肪嗜热芽孢杆菌T525中抽提得到的隐蔽性质粒pFD101,经纯化后通过琼脂糖凝胶电泳和电镜观察,确证为cccDNA。经测定,pFD101的分子量为3.83×10~6道尔顿。具有限制酶HindⅢ切点1个、SalⅠ和HpaⅡ切点各2个,没有EcoRI、BamHI和PstⅠ切点。根据限制酶片段的分子量作出了pFD101的简单酶切图。     

谷氨酸棒状杆菌质粒pXZ 10145的限制酶图谱和嵌合质粒的组建

从谷氨酸棒状杆菌中已经分离到质粒pxzl0145,该质粒带有氯霉素抗性。通过电子显微镜和BamH I酵切后在1％琼脂糖凝胶电泳上测定pXZl0145质粒的大小为5．3kb。用Bam—HI、PstI、EcoRI、saII等限制酶进行酶切,并用BamH I+sa1 I、BamH I+Pst I、Pst I+sal I、EcoR I+Pst I、EcOR I+BamH I等双重酶切,得到pxzlol45限制性内切酶的图谱。证明BamH I和Pst I为单一酶切点。将pxzl0 145与pBR322利用BamH I切点连接得到一嵌台质粒pxz34。这一质粒能在大肠杆菌中复制,在大肠杆菌中表现有氨苄青霉素和氯霉素的抗性,但是抗氯霉素的能力大大降低,只抗2Y／ml。     

针对乙肝病毒的串联序列amiRNA表达载体的构建

目的为优化RNA干扰研究方法,构建了针对乙肝病毒的串联序列amiRNA(artificial microRNA)质粒表达载体。方法设计针对乙型肝炎病毒S区的靶干扰序列,构建单一序列amiRNA质粒表达载体;将其中干扰效率好的两个序列串联起来,构建串联序列amiRNA质粒表达载体。结果经酶切及测序鉴定,插入序列与靶序列一致,载体构建正确。结论成功构建了新型针对乙肝病毒的串联序列amiRNA质粒表达载体,为进一步体外及体内实验奠定了基础。     

分泌载体pUS186的构建及地衣杆菌α—淀粉酶基因在枯草杆菌中的表…

利用枯草杆菌的分泌系统构建分泌型表达载体表达和分泌外源基因产物具有重要的商业价值。我们用鸟枪法克枯草杆菌染色体的启动子和信号肽序列。将克隆的序列连接到能在枯草杆菌中复制的质粒ｐＵＢ１８上,获得分泌型表达载体ｐＵＳ１８６。为了测试构建的载体ｐＵＳ１８６的功能,将地衣杆菌α－淀粉酶基因的缺失了启动子和信号肽序列的片段重组进该质粒,经过Ｂａｌ ３１酶切,Ｔ４ ＤＮＡ聚合酶补齐等处理,获得ｐＵＳＡ１８６Ｉ     

虹鳟鱼金属硫蛋白启动子的体外扩增、克隆及其序列分析

以含有虹鳟鱼金属硫蛋白基因的质粒ＤＮＡ为模板,以合成的两段３２个寡聚核苷酸为引物,经过ＰＣＲ扩增,合成了４３３ｂｐ的片段,把其克隆到ｐＢＬ－ＣＡＴ载体中,序列分析和限制酶切图谱表明所克隆的虹鳟鱼金属硫蛋白启动子含有４３３ｂｐ,含有ＴＡＴＡ和ＣＡＡＴ序列,与Ｈｏｎｇ报导的鳟鱼金属硫蛋白启动子的序列比较,其核苷酸泊同源率为１００％。     

转座子Tn233(CH)中抗性基因的定位

将Tn233(CH)从质粒DR233转座到可以扩增的质粒pBR322上,并绘制了包括7种限制性内切酶切点的pBR322:: Tn233(CH)DNA的限制图。经限制类型分析表明,链霉素抗性基因位于H3片段上,磺胺抗性基因位于H4片段上,汞盐抗性基因位于H1片段上。另外,B3片段上同时带有链霉素与磺胺的抗性基因,B1片段上带有汞盐抗性基因。     

枯草杆菌启动子－信号肽序列的克隆及序列分析

利用含红霉素抗性基因和缺启动子－信号肽序列的氨苄青霉素抗性基因的双功能质粒ｐＧＰＢ１４为探针载体,克隆了枯草杆菌的启动子－信号肽序列并对克隆的片段进行序列分析。枯草杆菌染色体ＤＮＡ经Ｓａｕ３Ａ酶解后与ＢｏｍＨＩ酶切的质粒ｐＧＰＢ１４连接,转化大肠杆菌Ｃ６００,筛选抗氨苄青霉素及抗红霉素的转化子,从双抗性转化子中提取重组质粒并经酶切分析,显示克隆的ＤＮＡ片段在０．２７－１．５ｋｂ之间。用Ｓａｎｇｅｒ的双脱氧链终止法测定了１０个克隆片段的ＤＮＡ顺序,结果表明,克隆的片段都含有启动子、核糖体结合优点及信号肽序列。克隆片段可以在大肠杆菌和枯草杆菌中恢复氨苄青霉素抗性的表型。β－内酰胺酶活力测定结果证明：大肠杆菌的酶活力主要积累在周质空间内而枯草杆菌的酶活力主要分泌到胞外。     

分泌载体pUS186的构建及地衣杆菌α－淀粉酶基因在枯草杆菌中的表达和分泌

利用枯草杆菌的分泌系统构建分泌型表达载体表达和分泌外源基因产物具有重要的商业价值。我们用鸟枪法克隆了枯草杆菌染色体的启动子和信号肽序列,将克隆的序列连接到能在枯草杆菌中复制的质粒ｐＵＢ１８上,获得分泌型表达载体ｐＵＳ１８６。为了测试构建的载体ｐＵＳ１８６的功能,将地衣杆菌α－淀粉酶基因的缺失了启动子和信号肽序列的片段重组进该质粒,经过Ｂａｌ３１酶切,Ｔ４ＤＮＡ聚合酶补齐等处理,获得ｐＵＳＡ１８６Ⅱ及ｐＵＳＡ１８６Ⅰ系列质粒,将这些重组质粒转化枯草杆菌ＱＢ１１３０（ａｍｙ－）后都能向胞外分泌淀粉酶,酶活测定结果表明,基因表达水平比用原有的启动子高１－２倍,蛋白质分泌率在８４－９６％之间。