T7 启动子作用下人尿激酶原 cDNA 在大肠杆菌中的高效表达及分离纯化

化学合成的人尿激酶原ｃＤＮＡ克隆在表达质粒ｐＥＴ１１ｄ中,在Ｔ７启动子的作用下,经０.１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导,在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中获得表达。其表达量占菌体总蛋白的１５％,表达产物以无活性的包涵体形式存在。经体外变复性,Ｚｎ^２＋选择性沉淀,抗体亲和柱层析,及Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ亲和吸附,所表达的人尿激酶原被纯化为单一条带,其比活约１１００００ＩＵ／ｍｇ。     

人尿激酶原cDNA在昆虫杆状病毒真核表达系统中的高效表达

人尿激酶原是一种新型溶栓剂,优于尿激酶,具有血纤维蛋白特异性,为了在昆虫杆状病毒表达系统中高效表达ｐｒｏ－ＵＫ,我们在ｐＡｃ３７３基础上,插入野生型ＡｃＭＮＰＶ ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ启动子区－７～－１碱基序列,构建了一个高表达转移载体ｐＡｃＹＴ．分别经三次克隆将ｐｒｏ－ＵＫ ｃＤＮＡ正向插入到转移载体ｐＡｃ３７３或ｐＡｃＹＴ的ＢａｍＨＩ－ＫｐｎＩ位点上。用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ将ｐＡｃＹＴ－ＵＫＤＮ     

人尿激酶原cDNA序列缺失突变体的构建及表达

采用PCR重叠延伸法和基因重组技术构建了人尿激酶原cDNA序列中缺失150～156位氮基酸的突变体,以COS-7细胞中获得暂时性表达以及在CHO细胞中稳定高效表达,其表达水平为450～500IU／10⁶cell／24h,表达产物经SDS-PAGE电转溶实验和westemblot分析证明,细胞分泌的Pro-UK突变体与天然Pro-UK以及完整全长DNA序列表达Pro-UK的分子量相同,为54kDa．绝大多数为单链,比完整cDNA序列表达产物的单链比例明显增高,与纤维蛋白的亲和性有所提高。     

人尿激酶原全长cDNA在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达

通过磷酸钙共沉淀技术,将含有尿激酶原cDNA的表达载体(pSV₂-PrUK)与含有二氢叶酸还原酶基因的表达质粒pSV2-dhfr-或MMTV—dhfr共转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株(CHO-dhfr^-)。利用选择培养基选择出二氧叶酸还原酶基因表达阳性(dhfr⁺)的转化细胞灶。用溶解圈法测定尿激酶型纤溶酶原激活剂(u—PA)的生物活性,其中两株显著高于其他株细胞,命名为CLF-14和CLF-8,表达水平依次为24Iu／10⁶细胞／48h,16Iu／10⁶细胞／48h。用ELLSA测定CLF一14和cLF-8细胞上清,表现为强阳性,阳性值比阴性对照值(P／N)大于10,CLF-14和CLF-8细胞表达量分别为0．14-o．22μg／10⁶细胞／48h和0．08-O．14μg／10⁶细胞／48h。分泌产物能被抗尿激酶(UK)血清抑制,而不被抗组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的抗血清和正常兔血清抑制。     

合成人干细胞cDNA在大肠杆菌中的高效表达与纯化

以pBV220为载体,进行了合成可溶型人干细胞因子(SCF)cDNA在大肠杆菌中的温控型的高效表达。SDS-PAGE检测表明,在实验室摇瓶培养中,目的蛋白可占菌体可溶蛋白的40％左右。表达产物复性后,经过凝胶过滤、离子交换层析,得到了电泳纯的重组rhSCF,经测定,纯化的rhSCF相对分子质量为19000,氨基端15个氨基酸的序列与天然可溶形式的hSCF成熟分子的序列完全一致。     

人胸腺素α原cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用基因工程方法制取人胸腺素α原获得成功。用２０μｇ／ｍｌ植物血球凝集素（ＰＨＡ）和５００Ｕ／ｍｌ重组人白细胞介素２（ＩＬ－２）联合刺激人胎儿胸腺细胞,从中提取总ＲＮＳ,经反转录ＰＣＲ获得了人胸腺素α原ｃＤＮＡ;将之克隆入ｐＵＣ１９中,序列测定表明与已报道序列一致,进一步将之亚克隆入原核表达载体ｐＢＶ２２０,转化大肠杆菌ＤＨ５α,观察到在不改变氨基酸编码的前提下,增加胸腺素α原上游引物中Ａ、Ｔ含量     

T7 启动子作用下人尿激酶原 cDNA 在大肠杆菌中的高效表达及分离纯化

化学合成的人尿激酶原ｃＤＮＡ克隆在表达质粒ｐＥＴ－１１ｄ中,在Ｔ７启动子的作用下,经０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ诱导,在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中获得表达。其表达量占菌体总蛋白的１５％,表达产物以无活性的包涵体形式存在。经体外变复性,Ｚｎ＾２＋选择性沉淀,抗体亲和柱层析,及Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ亲和吸附,所表达的人尿激酶原被纯化为单一条带,其比活约１１００００ＩＵ／ｍｇ。     

人尿激酶原基因在大肠杆菌中的高效表达

本文用ＰＣＲ方法对人工合成的尿激酶原ｃＤＮＡ基因５＇端进行改造,将之克隆到表达载体ｐＫＫ２３３－２中,转化大肠杆菌ＪＡ２２１,经ＩＰＴＧ诱导,获得了占总菌体蛋白１５％的高表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ结果显示表达产物主要为单链尿激酶,并且在菌体内基本上以无活性的包含体形式存在,经体外变复性,从１升培养基中可获得３０００００单位的活性尿激酶原。     

中国人r——干扰素cDNA在大肠杆菌中的高效表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术从中国人淋巴细胞ｍＲＮＡ反转录产物中克隆了ＩＦＮ－ｒ－ｃＤＮＡ,序列分析证实了分子进化规律对ＩＦＮ－ｒｃＤＮＡ序列存在多态性的推论。在此基础上应用ＤＮＡ重组技术,将去信号肽中国人ＩＦＮ－ｒ ｃＤＮＡ克隆到原核表达质粒ｐＢＶ２２０ ＰＲＰＬ启动子下游,转化大肠杆菌ＤＨ５ａ,通过温度诱导表达,成功地在大肠杆菌中稳定、高效地表达了中国人ＩＦＮ－ｒ ｃＤＮＡ,其表达水平占全菌可溶性总     

人尿激酶原cDNA在昆虫杆状病毒真核表达系统中的高效表达

人尿激酶原(pro-urokinase,pro-UK)是一种新型溶栓剂,优于尿激酶,具有血纤维蛋白特异性。为了在昆虫杆状病毒表达系统中高效表达pro-UK,我们在pAc373基础上,插入野生型AcMNPV polyhedrin启动子区-7～1碱基序列,构建了一个高表达转移载体pAcYT。分别经三次克隆将pro-UK cDNA正向插入到转移载体pAc373或PAcYT的BarnHI-KpnI位点上。用LiPofectin将pAcyT-UKDNA或pAc373-UK DNA与AcMNPV DNA共转染到昆虫Sf9细胞中,空斑法筛出重组病毒阳性克隆株。高效表达结果是:1.ELISA法确定重组病毒Sf9细胞分泌表达产物pro-UK为96mg/L培养基上清,平板法测定溶圈活性为1600IU/mL培养基上清;2.亲和层析一步法纯化表达产物,回收率选70％,以上,比活约为60000IU/mg;3.纯化的pro-UK,无论是否经还原处理,其SDS-PAGE图谱均为相同的单一条带,MR 50000;4.Western blot与SDS-PAGE图谱吻合。     

人尿激酶原cDNA在中国仓鼠卵巢细胞(CH0)中高效表达研究

通过构建高效表达载体,改进转染方法,与二氢叶酸还原酶(dhfr)基因共扩增等手段在CH0细胞内高效表达了人尿激酶原(Pr0-UK)cDNA。首先将pro—UK cDNA插入到sR α启动子的下游,构建成表达质粒pMGl0102,在cos－7细胞内进行暂时性表达,结果表明此启动子的表达水平比SV40早期启动子高约5倍。然后将质粒pMG10102和pSV2－dhfr线性化后用磅酸钙共沉淀法转染CH0－dhfr-细胞,经一系列筛选后获得20个能表达pro—UK的细胞克隆,纤维蛋白溶解平板法(FAPA)测定表达水平为12．5—100IU／10⁶cells／d．再经MTX加压共扩增,得到9株高表达细胞系,其中最高的表达水平达到400—500Iu／10‘cells／d。2—3个月连续传代,表达水平未下降,表明细胞株是稳定的。Western Blot分析证明细胞分泌的重组pro－UK具有与天然pro—UK相同的分子量,而且培养液中不加蛋白酶抑制剂时,分泌的重组UK大部分为单链(60％以上)。     

hIL—5cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达

从人外周血中分离淋巴细胞,经ＰＭＡ和钙离子载体Ａ２３１８７诱导,通过ＲＴ－ＰＣＲ技术获得ｈＩＬ－５ｃＤＮＡ片段。扩增其编码成熟多肽的ｃＤＮＡ片段插入ｐＢＶ２２０,在大肠杆菌ＤＨ５α中诱导表达,未能得到预期１４ｋＤ的重组蛋白的表达,只有一个克隆高效表达约１０ｋＤ的小肽。对该克隆测序表明,其ｃＤＮＡ缺失一个Ａ,导致在８６位氨基酸处于开始移码,高效表达一个９３个氨基酸的小肽。     

人白细胞介素—18基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用反转录ＰＣＲ（ＲＴＰＣＲ）法从人肝组织中分离人白介素１８（ｈＩＬ１８）基因。克隆到Ｔｖｅｃｔｏｒｅａｓｙ载体中,经酶切初步鉴定后进行ＤＮＡ序列分析,结果表明与文献报道完全一致。以ｐＢＶ２２０为表达载体,在大肠杆菌中高效表达了ｈＩＬ１８基因,重组蛋白占菌体总蛋白的２７．２％。为进一步研究其生物活性奠定了重要基础。     

人血小板生成素（hTPO）全长cDNA克隆及其在CHO细胞中的表达

以人胎肝ｍＲＮＡ为模板,采用ＲＴ－ＰＣＲ扩增了人ＴＰＯ编码区全长ｃＤＮＡ,全序列测定结果表明与国外报道序列一致;进而构建了ｐｃＤＮＡ３－ＴＰＯ永久表达载体,转染ＣＨＯ细胞后经Ｇ４１８加压筛选、ＴＰＯ表达稳定性等项指标测试,获得了稳定分泌ＴＰＯ的工程细胞株。     

猪Follistatin cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达

提取猪卵巢总RNA,用RT-PCR方法克隆了猪FollistatincDNA的完整开放阅读框,长1038bp。将FollistatincDNA连接到原核表达载体pGEX-4T-3中,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导,进行了GST-FS融合蛋白表达。用SDS-PAGE和Western杂交检测,结果显示在63kD处有特异性表达蛋白。     

人尿激酶原乳腺定位转基因小鼠的建立

应用大鼠β乳酪蛋白基因的上游调控序列和人尿激酶原ｃＤＮＡ构建成功了乳腺定位表达载体．用显微注射的手段导入到受精卵的雄前核,从注射的３００枚受精卵中,１４０枚被移植到９只假孕的受体小鼠．结果从获得的子一代小鼠中,经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实,有３只转基因阳性的小鼠．     

人PPARγ-LBD cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达纯化

从正常中国人的面部脂肪组织分离总RNA,采用RT-PCR获得人的PPARγ-LBD cDNA,然后克隆至原核表达载体pET28a,构建高效原核表达质粒pET28a-PPARγ-LBD,序列分析表明正常中国人的PPARγ-LBD cDNA序列与Gene Bank报道的序列一致。把构建的pET28a-PPARγ-LBD质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG进行诱导表达,Western blot检测表达产物,在相对分子质量34kDa处有特异的蛋白表达条带,表达蛋白以可溶性和包涵体方式存在。在N末端融合6×His纯化标签的表达产物用Ni~(2 )-NTA离子交换树脂进行纯化,纯化蛋白进行SDS-PAGE纯度分析大于90％以上。因此,获得了正常中国人的PPARγ-LBD cDNA序列,并且在E.Coli中成功表达和纯化了PPARγ-LBD蛋白。     

重组人尿激酶原在CHO细胞中的高效表达及其纯化

用鸡β- globin的MAR序列和人看家基因延伸因子1α(hEF-1α)的调控序列以及旱獭RNA稳定与输出序列,构建了重组人尿激酶原(recombinant human pro-urokinase,rhPro - UK)的高效表达载体,在CHO细胞中获得了rhPro - UK的高效稳定表达,rhPro - UK的表达水平达到1299 IU(以百万细胞1d的表达量计).采用阳离子交换层析、疏水层析和凝胶排阻层析的三步工艺纯化表达rhPro - UK的CHO细胞培养上清液,rhPro - UK的纯度达到98％、回收率为60％ ～70％.