酿酒酵母原生质体融合及其融合子的鉴定

应用原生质体融合技术,得到乙醇产量较高的两株多倍体酵母菌融合子F_(28)和F_(38),融合频率为2×10~(-5)。测定融合子F_(28)、F_(38)每个细胞内DNA含量分别为2.14×10~(-8)、2.34×10~(-8)μg,而亲株DNA含量分别为0.78×10~(-8)和1.24×10~(-8)μg。并进行了融合子细胞增殖率、乙醇发酵能力及同功酶分析等试验。用固定化细胞发酵乙醇试验结果表明,在pH4.0,17％糖蜜为基质情况下,发酵3小时,融合子F_(28)、F_(38)的乙醇产量分别为77.21和77.09mg/ml;亲株乙醇产量仅为65.00mg/ml和68.40mg/ml。为固定化细胞发酵乙醇提供优良菌株。     

胡萝卜苷抑制HepG-2细胞增殖和迁移及拓扑异构酶表达

目的探讨胡萝卜苷对HepG2细胞增殖、迁移及DNA拓扑异构酶(topoisomerase,TOPO)Ⅰ和Ⅱ表达的影响。方法体外培养人肝癌HepG2细胞。CCK-8实验观察不同浓度(200μg/ml、150μg/ml、100μg/ml和50μg/ml)胡萝卜苷对HepG2细胞增殖的影响。qRT-PCR实验观察200μg/ml胡萝卜苷对HepG2细胞TOPOⅠ和TOPOⅡmRNA表达的影响。Transwell小室模型检测200μg/ml胡萝卜苷对HepG2细胞迁移的影响。结果胡萝卜苷对HepG2细胞增殖有明显抑制作用,并在一定范围内(0μg/ml~200μg/ml)呈现浓度依赖性。与未用胡萝卜苷处理的HepG2比较,经200μg/ml胡萝卜苷作用的HepG2细胞穿越基膜的数量显著减少,TOPOⅠ和TOPOⅡmRNA相对表达量显著降低。结论胡萝卜苷可能通过下调TOPOⅠ、TOPOⅡ基因表达而抑制HepG2细胞增殖,并具有抑制HepG2细胞迁移的能力。     

TALEN质粒转染HEK-293T细胞的条件优化

本研究探讨了TALEN质粒转染HEK-293T细胞的最佳转染条件。以TALEN质粒右臂中的绿色荧光蛋白为报告基因,分别研究转染试剂、质粒DNA的量、转染试剂与质粒DNA的比例对转染效果的影响,转染24 h后荧光显微镜下统计具有代表性视野的绿色荧光细胞,计算绿色荧光细胞/总细胞数的比例得出转染率,并利用CCK-8试剂盒检测细胞存活率。实验结果表明,TALEN质粒转染293T细胞,采用Fugene HD转染试剂比Lipofectamine 2000转染试剂细胞存活率高;以6孔板为例,转染质粒DNA量为4μg时转染效率最高(49.0±8.0)%;Fugene HD与质粒DNA比例(μg/μL)为3:1时转染效率最高。本研究建立TALEN表达质粒转染HEK-293T细胞的最佳转染条件,可作为相关研究或应用提供参考。     

纳米ZnO对人肺上皮细胞BEAS-2B细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨纳米ZnO对人肺上皮细胞BEAS-2B细胞增殖、凋亡的影响及分子机制。方法:用终浓度为3、6、12μg/ml的纳米ZnO处理BEAS-2B细胞12 h和24 h,对照组未加入纳米ZnO,各设3复孔,CCK-8法检测细胞活力,分析半致死浓度。筛选3、6μg/ml纳米ZnO处理BEAS-2B细胞24 h,各设3复孔,倒置显微镜观察细胞形态,Hochest33342染色观察细胞核,AO染色及扫描电镜观察细胞凋亡形态,流式细胞术检测活性氧水平、细胞周期进程、细胞凋亡;Western blot检测Bcl-2、Bax蛋白表达水平。结果:与对照组相比,纳米ZnO处理组细胞活力显著下降(P<0.01),处理24 h时IC₅₀为6.13μg/ml;纳米ZnO处理细胞24 h后,3μg/ml和6μg/ml组的活性氧水平显著升高(P<0.05,P<0.01)。6μg/ml处理组细胞周期阻滞于G2/M期、染色质固缩凝集、出现凋亡小体、细胞凋亡率显著增加(P<0.01)、Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)、Bax蛋白表达显著升高(P<0...     

槲皮素对血管内皮细胞增殖和迁移的抑制作用

本实验研究了槲皮素对人脐静脉内皮细胞株(ECV304)增殖和迁移的抑制作用。研究发现,槲皮素作用一定的时间后,能明显抑制ECV304细胞的增殖(IC50为50．08μg/ml)和迁移(IC50为7．84μg／ml),而且其抑制作用呈浓度依赖性;细胞出现凋亡形态学改变,琼脂糖凝胶电泳形成DNA条带,推测其诱导细胞发生了凋亡。     

纳米银体外抗腺病毒作用初步研究

目的探讨纳米银(silver nanoparticles,silver-nps)在体外对腺病毒3型(Adenovirus type 3,ADV3)的抑制作用。方法运用细胞培养技术、MTT测值法、CPE和免疫荧光观察法,分析纳米银对ADV3感染HeLa细胞的预防作用、直接灭活作用以及对ADV3子代病毒体生成的抑制作用。结果纳米银能明显杀伤ADV3,且呈剂量依赖性;纳米银在HeLa细胞上最大无毒浓度(TC0)为52.48μg/ml;ADV3在HeLa细胞上的组织半数感染量(TCID50)为10-2.74/100μl;最大无毒剂量范围内,50、25、12.5、6.25和3.125μg/ml的纳米银分别与100 TCID50ADV3等体积混合,细胞存活率分别为(95.38±2.60)%、(60.51±9.42)%、(57.99±8.72)%、(41.35±3.91)%和(37.88±3.75)%,而100 TCID50ADV3感染HeLa细胞后,测得细胞存活率为(31.92±8.98)%,二者相比差异有统计学意义(P0.05);免疫荧光结果显示,与纯病毒组形成的强特异性荧光相比,纳米银在ADV3吸附细胞后加入、吸附前预处理HeLa细胞和纳米银同ADV3同时作用三种途径特异性荧光都很少见,说明纳米银在不同途径下对ADV3均有抑制作用。结论纳米银对腺病毒3型具有明显的抑制作用。     

蛋白聚糖和溶血磷脂酸对不同细胞周期心脏成纤维细胞生长的影响

本文研究了蛋白聚糖（pG和）和溶血磷酸（LGA）对培养的处于不同细胞周期的SD乳鼠心脏成纤维细胞生长的影响及PG对LPA生物学活性的调节食用。采用流式细胞术测定细胞所处的周期;3H-TdR参人法测定细胞的DNA合成。研究结果表明（1）培养至次融汇状态的乳鼠心脏成纤维细胞经低血清（0.4%FBS）饥饿培养48小时,G0/G1期细胞占88.5%;G0/G1期细胞经2%FBS刺激24小时,G2期细胞占91。7%。（2）PGs对G0/G1期和G2期的心脏成纤维细胞的DNA合成均有摄制作用。2.94-47.04μg/ml PGs对G0/G1期细胞DNA合成的摄制率为80%-93%对G2期的抑制率为13%-94%.(3)1-80μmol/L范围内,LPA以浓度依赖方式促进不同细胞周期的心脏成纤维细胞DNA合成增加,50μmol/L LPA诱导G0/G1期和G2期细胞DNA合成的增加分别为78%±和122%±21%。（4）10μmol/L LPA存在下,2.94%-47.04μg/ml PGs使G0/G1期细胞和G2期细胞的DNA合成分别下降为对照的36%±11%-15%±10%和91%±13%-3%±1%,说明PGs可以抑制LPA诱导的心脏成纤维细胞DNA合成.上述研究结果提示PGs和LPA对乳鼠心脏成纤维细胞G1期至S期的转换有重要的调节作用,并可能通过调节心脏成纤维细胞的生长影响心肌肥厚的形成和发展.     

补骨脂素对前列腺癌LNCap-AD细胞增殖的影响及其分子机制研究

目的观察补骨脂素对体外培养的前列腺癌LNCa P-AD细胞增殖的抑制作用,并探讨补骨脂素抑制前列腺癌的作用机制。方法体外培养前列腺癌LNCa P-AD细胞,加入不同浓度的补骨脂素,CCK-8法检测细胞增殖抑制率、实时荧光定量PCR检测细胞AR m RNA的表达、Western Blot检测细胞PCNA和AR蛋白表达。采用单因素方差分析进行组间均数比较。结果与对照组相比,30、50、100μg/ml补骨脂素组LNCa P-AD细胞存活率均明显下降(P0.05),补骨脂素对LNCa P-AD细胞增殖的抑制作用呈浓度-时间依赖性。实时荧光定量PCR检测结果显示,与对照组(1.00±0.00)相比,30μg/ml组AR m RNA表达上调(1.63±0.04,t=17.72,P0.01),50μg/ml组AR m RNA表达无明显变化(0.98±0.04,t=0.66,P=0.53)、而100μg/ml组的AR m RNA表达则明显降低(0.46±0.07,t=15.18,P0.01)。Western blot法检测结果显示,30μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的补骨脂素干预48 h后,LNCa P-AD细胞PCNA蛋白表达均显著降低(11.88±0.21 vs 10.61±0.17 vs 6.62±0.13 vs 2.71±0.43,F=68.53,P0.01)。100μg/ml的补骨脂素可明显降低LNCa P-AD细胞AR蛋白的表达水平(0.43±0.06 vs 0.87±0.04,t=6.04,P0.01)。结论补骨脂素能在体外抑制前列腺癌LNCa P-AD细胞增殖,且呈剂量-时间依赖性,其机制可能与其下调LNCa P-AD细胞PCNA表达和影响AR表达有关。     

喜树碱对人类巨细胞病毒诱发染色体畸变的频率的调节效应

本文评价了所选用的DNA修复抑制剂对人类巨细胞病毒(HCMV)诱发外周血淋巴细胞(PBLs)染色体畸变频率的影响。以拓扑酶Ⅰ的一种抑制剂——喜树碱(0.05—0.3μg/m1)处理HCMV感染的人类PBLs30小时,结果导致HCMV诱发的染色体损伤频率显著的协同性增加(P<0.O1)。另一方面以ADP核糖聚合酶的一种抑制剂——3—氨基苯酰胺(3—AB)(3—30μg/ml),或者拓扑酶Ⅱ的一种抑制剂——新霉素(3—30μg/ml)处理HCMV感染的PBLs30时小,染色体损伤频率未见明显增加。在喜树碱处理的HCMV感染细胞中,染色单体型断裂包括染色体交换是染色体畸变的主要类型,这提示HCMV感染与单链NDA断裂有关,这些发现还提示,HCMV感染不会造成通过3-AB或新霉素敏感途径修复的直接DNA损伤。     

酸性区3融合重链促进基于蛋白质内含子的双载体B域缺失型凝血因子Ⅷ转基因表达

最近的研究表明,蛋白质内含子(intein)介导的B区缺失型凝血因子Ⅷ (BDD-FⅧ)的轻链和重链剪接可顺式促进后者的分泌,而且剪接反应在细胞内、外均可发生．为进一步提高基于蛋白质内含子的双载体转BDD-FⅧ基因的功效,将具有促进重链分泌作用的位于Pro¹⁶⁴⁰～Ser¹⁶⁹⁰的酸性区3(acidic region-3,AR-3)引入重链,检验对蛋白质内含子剪接的BDD-FⅧ蛋白分泌和活性的影响．用融合蛋白内含子的附加ar-3重链(HCAR3IntN)基因和轻链(IntCLC)基因共转染培养的HEK293细胞,分别用ELISA和Coatest法定量分析分泌至培养上清中剪接BDD-FⅧ蛋白量和生物活性,并用免疫印迹观察了细胞内的BDD-FⅧ剪接．结果显示,共转HCAR3IntN和IntCLC基因细胞,分泌至上清的剪接BDD-FⅧ蛋白量和活性分别为(173±26) μg/L和(1.31±0.15) U/ml,明显高于未添加ar-3的蛋白质内含子融合重链(HCIntN)与轻链(IntCLC)基因共转染细胞[(102±12) μg/L和(0.79±0.09) U/ml],提示AR-3对蛋白质内含子剪接的BDD-FⅧ蛋白分泌和活性有明显改善作用．而且,分别转HCAR3IntN和IntCLC基因细胞混合培养后的上清中,亦检测到剪接的BDD-FⅧ蛋白和活性[(35±7) μg/L和(0.28±0.08) U/ml],表明蛋白质内含子可进行不依赖细胞机制的蛋白质剪接．另外,转基因细胞总蛋白呈现明显的可与FⅧ多克隆抗体进行反应的剪接BDD-FⅧ蛋白条带,直观地反映细胞内BDD-FⅧ的剪接．为动物模体内运用蛋白质反式剪接技术的双腺相关病毒载体(AAV)转BDD-FⅧ基因实验提供了依据．     

DNA对电穿孔转染效率的影响研究

以外源红细胞生成素eDNA的表达产物为指标,研究了运载DNA和重组表达质粒的构象对电穿孔转染CHO细胞的效率的影响。结果250μg/ml的运载DNA可使外源基因表达水平提高3倍;线性化质粒DNA比超螺旋DNA更适合于用电穿孔方法获得永久表达。这一结果提示,运载DNA的存在和质粒DNA的线性化对提高电穿孔转染CHO细胞的效率是必需的。     

通过睾丸内注射转染外源DNA在小鼠精子的表达

为研究睾丸内注射外源DNA法生产转基因小鼠(Mus musculus)的可行性,并探讨注射DNA的最佳浓度。将环形的质粒DNA pEGFP-N1与脂质体混合制备DNA-脂质体复合物,按DNA浓度不同分为0.08μg/μl、0.12μg/μl和0.24μg/μl3组,分别注射入成年SPF级昆明小鼠睾丸内,同时设空白对照;每组处理公鼠2只,注射5d后每只与3只成年母鼠同笼,20d后在荧光显微镜下检测公鼠附睾精子,并制作睾丸石蜡切片,检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达;PCR法检测各组后代阳性率。结果显示,3组小鼠附睾荧光精子比例分别为9.09%、47.06%和27.78%。3组小鼠的睾丸石蜡切片中均可看到不同强度的GFP表达。后代经PCR检测阳性率分别为17.26%、47.61%和22.11%。本实验证实了睾丸注射法能使外源DNA整合进入精子基因组,并能在自身和后代中得到表达,本研究中外源DNA注射浓度以0.12μg/μl效果为最佳。     

伴刀豆球蛋白A对培养静止软骨细胞形态和DNA合成的影响

培养的静止软骨细胞用ConA处理后,细胞形态从扁平形变成多角形、圆形与球形,同时可以观察到细胞周边存在大量的具有折光特点的细胞外基质。ConA能够完全抑制软骨细胞DNA的合成,LD_(50)为0.4—1.0μg/ml。ConA抑制DNA合成的作用是可逆的。20mmol/L的MeMan能够完全阻断其对软骨细胞形态和DNA合成的影响。     

南瓜和丝瓜韧皮部伤流液中核酸的存在和鉴定

利用化学分析结合电镜技术,对南瓜和丝瓜韧皮部伤流液中的DNA和RNA,进行了定性和定量的研究。核酸样品经日立双波长和双光束分光光度计测定,在258 nm左右有一吸收高峰,低峰在230 nm附近,呈现出核酸的紫外吸收光谱曲线。南瓜伤流液中的DNA含量为60～238μg/ml,RNA为30～80μg/ml,而丝瓜则分别为30～120μg/ml和20～40μg/ml.DNA水解物经高压液相色谱(HPLC)测定、可将T.G.C.A四个碱基明显分开。DNA电镜观察,得到清晰的图象。电镜细胞化学鉴定,也表明伤流液中有核酸存在。上述结果证实瓜类韧皮部伤流液中含有DNA和RNA,它们可能参与了韧皮部的运输,并可随伤流液的流动而迁移。     

不同浓度尼古丁对牙周膜成纤维细胞增殖及纤维结合蛋白合成的作用

目的:探讨不同浓度尼古丁对人牙周膜成纤维细胞(PDLFs)增殖及纤维结合蛋白(Fn)合成的作用。方法:不同浓度的尼古丁(50 ng/ml,250 ng/ml,500 ng/ml,1μg/ml,2μg/ml,3μg/ml)作用于PDLFs,MTT比色法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测Fn合成含量。结果:不同浓度尼古丁作用下:人PDLFs的增殖均被抑制,且呈浓度依赖性。浓度为250 ng/ml~3 ug/ml的尼古丁有明显抑制人PDLFs增殖的作用(P0.05),3 ug/ml尼古丁显示出最强的抑制增殖作用(P0.01);人PDLFs的G0-G1期、S期、G2-M期与对照组相比,G0-G1期细胞周期分布比例逐渐增高,S期和G2-M期逐渐降低,差异均有统计学意义,呈浓度依赖性;人PDLFs合成Fn逐渐减少,呈浓度依赖性。浓度为50 ng/ml~3μg/ml的尼古丁均有明显抑制人PDLFs合成Fn的作用(P0.05),其中3μg/ml抑制作用最强。结论:尼古丁抑制牙周膜细胞的增殖及Fn的合成,呈浓度依赖性,并影响其细胞周期的进程,进而影响牙周新附着的形成,加重牙周病的病情。     

银杏内酯B抑制缺氧诱导的肝细胞凋亡

目的研究银杏内酯B对缺氧诱导肝细胞凋亡的影响。方法将原代培养的新生鼠肝细胞随机分为5组:正常对照组(N组)、缺氧对照组(H组)、缺氧加银杏内酯B(B1组、B2组、B3组)终浓度分别为1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml,缺氧(95%N2+5%CO2)12h建立缺氧模型,细胞荧光染色检测和流式细胞仪测定各组肝细胞凋亡率。结果缺氧引起肝细胞凋亡明显,加入银杏内酯B肝细胞凋亡数显著降低,但不同浓度银杏内酯B保护组间无显著性差异。结论银杏内酯B对缺氧导致的肝细胞凋亡有保护作用。     

糖基化终末产物对3T3-L1脂肪细胞脂联素分泌的影响

目的糖基化终末产物(Advanced glycation end products,AGE)对3T3-L1脂肪细胞脂联素(adiponectin,APN)分泌的影响。方法3T3-L1小鼠前脂肪细胞体外培养并诱导分化为成熟的脂肪细胞,以PBS和BSA作为阴性对照,用含不同浓度梯度(50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml)AGE的培养液对成熟的脂肪细胞体外培养48h,收集细胞和上清液,用RT-PCR方法检测脂联素mRNA的表达,ELISA方法检测培养液中脂联素蛋白的分泌情况。结果AGE干预组脂联素的表达在mRNA和蛋白水平较对照组均明显下降(P<0.05),并且随着AGE浓度的升高脂联素的合成和分泌逐渐减少,其中100μg/ml、150μg/ml AGE干预组脂联素的减少较对照组有显著差异(P<0.001)。结论糖基化终末产物能够通过抑制3T3-L1细胞脂联素mRNA的合成,近而抑制脂联素的分泌,且这种抑制呈浓度依赖性。     

改良内皮抑素对人脐静脉内皮细胞抑制作用的实验研究

目的:探讨改良内皮抑素(RGDRGD-ES)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的抑制作用,摸索RGDRGD-ES对HUVEC细胞抑制作用的相对最佳作用浓度和时间。方法:通过快速定点诱变PCR方法获得含有RGDRGD膜序的改良人内皮抑素基因,并构建其原核表达载体。表达、纯化改良内皮抑素(RGDRGD-ES),运用MTT法和流式细胞仪检测RGDRGD-ES对人脐静脉内皮细胞的抑制作用。结果:1.诱变了ES基因,获得了改良的RGDRGD-ES基因,并成功构建其原核表达载体。2.获得了RGDRGD-ES蛋白。3.改良的RGDRGD-ES能够有效抑制人脐静脉内皮细胞的生长(P<0.01);抑制率随着药物浓度(10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml)的增加和作用时间(24 h、48 h、72 h)的延长而逐渐增加,具有浓度和时间依赖性(P<0.01);而30μg/ml与40μg/ml、50μg/ml组间、72 h与96 h组间无明显差异(P>0.05)。4.细胞凋亡率(作用24 h)具有药物浓度(10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml)依赖性(P<0.01),30μg/ml与40μg/ml、50μg/ml组间凋亡率无明显差异(P>0.05)。结论:成功构建了改良RGDRGD-ES基因的原核表达载体,RGDRGD-ES蛋白在30μg/ml浓度作用72小时条件下能够有效抑制人脐静脉内皮细胞的生长,改良内皮抑素(RGDRGD-ES)对HUVEC的抑制作用较ES明显提高。     

表没食子儿茶素没食子酸酯对人结肠癌HT-29细胞G1期的阻滞作用

目的:研究表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallaocatechin-3-gallate,EGCG)时人结肠癌HT-29细胞增殖的影响.方法:实验分为EGCG不同浓度处理组和阴性对照组.采用MTT比色法检测EGCG(30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL)对HT-29细胞的生长影响;应用流式细胞术分析EGCG对HT-29细胞周期分布的影响;免疫印迹观测EGCG对HT-29细胞p38MAPK、cyclinD1蛋白表达的影响.结果:MTT比色结果显示.不同浓度EGCG(30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml)对HT-29细胞具有明显的生长抑制作用,并呈剂量-效应依赖关系(P<0.05);流式细胞术分析显示,EGCG诱导人结肠癌细胞G1期阻滞,且随着处理时间的延长,其诱导周期阻滞的效应越明显(P<0.05);蛋白免疫印迹显示.总的p38MAPK不随处理时间和浓度的改变而改变,但是磷酸化的p38MAPK蛋白的表达随处理时间和处理浓度的增加而明显增加,而CyclinD1蛋白的表达随处理浓度的增加而明显减少.结论:EGCG诱导HT-29细胞G1期阻滞,抑制细胞增殖,可能与活化p38MAPK,下调CyclinD1蛋白表达有关.     

用微载体悬浮培养大量生产高活性鼠干扰素

用自制的MC-1型微载体进行悬浮培养,当其浓度为5mg/ml时,可较好地用以培养和增殖鼠L929细胞。当接种细胞量为30×10~4/ml左右时,一般在3天即可增殖至1×10~6细胞/ml。用25IU/ml鼠IFN起动12—24小时,用NDV作诱生剂,并采用环己亚胺(20μg/ml)和放线菌素D(2μg/ml)进行超诱导,IFN产量可高达1×10~6IU/ml左右,比活接近1.3×10~5IU/ml蛋白。尽量去除培养基,加胰酶—柠檬酸盐消化和高速搅拌,使细胞从载体上分离,再加新鲜培养基和微载体的方法进行扩大生产看来是可行的。这些实验表明采用微载体悬浮培养细胞的技术将更适于IFN的工业化生产。