生防木霉菌产几丁质酶特性研究

通过采取还原糖法对生防木霉菌真菌2号和真菌4号菌株在不同发酵时间产几丁质酶活性进行测定,并对几丁质酶特性进行初步研究.试验结果表明,同一菌株在不同发酵时间几丁质酶活性大小变化的趋势大致相同,真菌4号在培养145 h几丁质酶活性达到最大,真菌2号在培养170 h几丁质酶活性达到最大.在相同发酵时间,真菌4号菌株的几丁质酶活性比真菌2号菌株的几丁质酶活性要高.     

产β-1,3-葡聚糖酶植物内生放线菌的筛选及抑菌活性研究

本研究采用透明圈法, 对217株植物内生放线菌产β-1,3-葡聚糖酶进行了检测, 结果表明: 45.6%的菌株能够产生β-1,3-葡聚糖酶, 黄瓜内生放线菌中的产酶菌株最多为38个; 不同植物来源的内生放线菌中具有产β-1,3-葡聚糖酶能力的菌株比例不同, 其中黄精中的产酶菌株比例最高, 达到88.9%。产酶菌株粗酶液对油菜菌核病菌的抑菌活性测定结果发现, 36个产酶菌株的粗酶液表现出不同程度的抑制作用, 占总产酶菌株的36.4%, 其中菌株gCLA4的粗酶液能够完全抑制病菌菌丝生长。对gCLA4菌株产酶     

枯草芽孢杆菌产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的响应面优化

【目的】采用响应面法(RSM)优化枯草芽孢杆菌5 L发酵罐产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的发酵条件。【方法】利用Box-Behnken设计和方差分析。【结果】获得最佳发酵条件为:转速、通气量和培养基pH分别为500 r/min、1.05 vvm和5.08,发酵时间仅为22 h产β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力达2 294.4 U/mL。【结论】实验结果表明响应面法优化5 L发酵罐发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的条件合理可行。     

枯草芽孢杆菌SC2-4-1葡聚糖酶基因gluB的克隆及序列分析

β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性检测结果表明,从辣椒根际筛选的拮抗菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SC2-4-1能产生β-1,3-1,4-葡聚糖酶.以菌株SC2-4-1的基因组DNA为模板,用PCR方法克隆了该菌的葡聚糖酶基因gluB,其开放阅读框为711bp,编码237个氨基酸.Blast分析,该序列与已报道的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ATCC 842的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因gluB相似性为85%.所得基因序列的系统发育分析显示,该基因属于β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因.DNAMAN软件比对,所得葡聚糖酶氨基酸序列具有催化裂解β-1,3-和β-1,4-糖苷键的葡聚糖酶活性位点.     

(1,3)-β-D-葡聚糖在诊断深部真菌感染中的意义

探讨(1,3)-β-D-葡聚糖(BG)检测对于诊断深部真菌感染的临床意义。收集2009年同时进行(1,3)-β-D-葡聚糖检测和真菌培养的住院患者的临床资料。分析不同科室送检真菌抗原情况,重症医学科的(1,3)-β-D-葡聚糖检测阳性者真菌菌种分布情况以及(1,3)-β-D-葡聚糖检测假阳性情况。同时送检(1,3)-β-D-葡聚糖和真菌培养共275例,重症医学科送检最多,共178例:重症医学科(1,3)-β-D-葡聚糖检测阳性36例(阳性率20.22%);重症医学科(1,3)-β-D-葡聚糖检测阳性同时真菌培养阳性者25例,其中白假丝酵母菌10例,热带假丝酵母菌7例,光滑假丝酵母菌4例,阿萨希毛孢子菌2例,克柔假丝酵母菌1例,烟曲霉1例。11例(1,3)-β-D-葡聚糖假阳性,9例存在细菌菌血症。重症医学科等科室应加强真菌感染监测。深部真菌感染中,假丝酵母菌属感染最多见。细菌菌血症可能造成(1,3)-β-D-葡聚糖检测假阳性。     

混合真菌发酵制备支化β-1,3-葡寡糖

真菌来源的β-1,3-葡聚糖被证实具有很好的抗肿瘤、免疫调节功能,但其过大的分子量和水不溶性影响其功能和应用,研究表明低分子量结构的葡寡糖具有更好的水溶性和生物活性。因此,本研究将能产这种结构多糖的真菌与能产内切β-1,3-葡聚糖酶的哈茨木霉混合发酵,从而得到低分子量的葡寡糖,并保留支链结构。本研究建立了齐整小核菌-哈茨木霉与裂褶菌-哈茨木霉混合发酵体系,制得了2种支化β-1,3-葡寡糖,分别为小核寡糖和裂褶寡糖。通过发酵条件优化,小核寡糖摇瓶产量最高为4.53 g/L,在7 L发酵罐中的产量最高为9.94 g/L,其中小核寡糖聚合度(DP)为5～12,裂褶寡糖DP为5～15。抗氧化实验表明,小核寡糖和裂褶寡糖都有较好的活性,且裂褶寡糖优于小核寡糖。本研究成功制得2种支化β-1,3-葡寡糖,并证明具有良好的水溶性和抗氧化活性。     

水杨酸和黄萎病菌毒素处理棉花愈伤组织使β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶的活性增加

不同品种棉花(Gossypium hirsutum L.)愈伤组织对黄萎病菌毒素粗提物的抗性与体内β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性水平有关.在毒素处理下,抗性品种比感性品种酶活性增加的幅度大、时间早.外源水杨酸(SA)处理后,棉花愈伤组织中的β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性增加.抗β-1,3-葡聚糖酶多克隆抗体与28 kD的蛋白条带有免疫交叉反应,毒素、SA、毒素+SA均能诱导该蛋白条带出现.     

小菜蛾幼虫血淋巴中β-1,3-葡聚糖结合蛋白的分离及其对根虫瘟霉侵染的免疫活性

用亲和沉淀法从小菜蛾(Plutella xylostella)幼虫血淋巴中分离获得2种β-1,3-葡聚糖结合蛋白,分子质量分别为75.9 ku和83.2 ku,主要存在于幼虫血浆中,但血细胞中未检出.研究表明,β-1,3-葡聚糖结合蛋白能特异性地识别β-1,3-葡聚糖,并显著激活幼虫血淋巴中的酚氧化酶原（ProPO）,与昆布多糖共存时所激活的酚氧化酶（PO）活性显著高于两者单独存在时的PO活性.与4株根虫瘟霉(Zoophthora radicans)菌丝裂解液共存时,β-1,3-葡聚糖结合蛋白能激活幼虫血淋巴中的ProPO,使PO活力显著高于该菌原生质体裂解液所激活的PO活性.显然,β-1,3-葡聚糖结合蛋白只有特异性地识别根虫瘟霉细胞壁中的β-1,3-葡聚糖后才能激活幼虫血淋巴中的ProPO,表明虫霉原生质体可逃避寄主免疫反应.此外,β-1,3-葡聚糖结合蛋白对不同菌株所激活的PO活性存在差异,各菌株所激活的PO活性由高到低依次为：ARSEF1342＞ARSEF2699＞F99101＞ARSEF1100,这与各菌株对小菜蛾的毒力强弱相一致,即菌株逃避寄主免疫识别的能力与其毒力相关.     

白菜型冬油菜β-1,3-葡聚糖酶基因在低温胁迫下的表达

为探明β-1,3-葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase)对油菜(Brassica campestris)抵御低温胁迫能力的作用,通过蛋白质谱分析得到β-1,3-葡聚糖酶蛋白,采用RT-PCR技术克隆白菜型冬油菜(B.rapa)陇油6号和天油4号β-1,3-葡聚糖酶的c DNA序列;并对该序列进行生物信息学分析;进而采用实时荧光定量PCR及半定量PCR检测β-1,3-葡聚糖酶基因在低温胁迫下的表达模式。结果获得长度为1 032 bp的陇油6号β-1,3-葡聚糖酶基因开放阅读框,编码343个氨基酸,相对分子量为38.102k Da,理论等电点为6.63,其与菜心(B.rapa subsp.chinensis)和甘蓝型油菜(B.napus)的蛋白质氨基酸序列同源性高达93.94%。该基因编码的酶是一个主要由α-螺旋组成的亲水性稳定蛋白,含有1个信号肽,存在2个跨膜结构域。该基因在进化上高度保守,其保守序列属于植物的糖基水解酶家族17特有的保守结构域。β-1,3-葡聚糖酶基因表达模式分析显示,4°C时该基因上调表达,继续低温(–4°C)胁迫处理,该基因上调表达至峰值,至–8°C时其表达下调。研究表明从白菜型冬油菜中克隆的β-1,3-glucanase在冬油菜品种陇油6号抗寒过程中发挥作用。     

内生枯草芽孢杆菌SWB8 菌株β-1，3-1，4-葡聚糖酶的抗菌作用及细胞毒性

【目的】本文研究从药用植物黄姜中分离的内生枯草芽孢杆菌菌株SWB8分泌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的抗菌活性和细胞毒性。【方法】利用液体发酵、凝胶渗透色谱(GPC)、十二烷基-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和液相层析串联质谱(LC-MS/MS)等方法纯化和鉴定枯草芽孢杆菌株SWB8合成的β-1,3-1,4-葡聚糖酶;利用纸片扩散法,检测葡聚糖酶抑制临床致病性细菌和真菌生长的活性;应用MTT法和流式细胞术(FCM)评估此葡聚糖酶对人肺腺癌细胞(A549)和骨髓间质干细胞(MSCs)的细胞毒性。【结果】细菌性β-1,3-1,4-葡聚糖酶显示了广谱的抗菌活性;抗肿瘤活性主要以细胞凋亡的方式选择性的抑制人肺腺癌细胞系A549细胞的增殖,而对人骨髓间质干细胞系MSC细胞无明显影响。【结论】首次报道β-1,3-1,4-葡聚糖酶的抗菌和抗肿瘤细胞的活性。内生枯草芽孢杆菌SWB8菌株有可能成为抗菌和高效低毒的抗肿瘤药物的潜在来源。     

细菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶分子改造和表达策略

β-1,3-1,4-葡聚糖酶作为一种饲料和食品添加剂有着广泛用途。迄今在杆菌、梭菌、瘤胃细菌、真菌、高等植物中都发现了β-1,3-1,4-葡聚糖酶。综述了细菌来源β-1,3-1,4-葡聚糖酶的性质、结构、分子改造与表达研究进展。     

细菌编码β-1,3-1,4-葡聚糖酶催化活性优化方法

β-1,3-1,4-葡聚糖酶是一类专一降解β-葡聚糖的内切水解酶。高效β-葡聚糖酶在啤酒酿造工业上具有十分重要的应用价值。目前,研究较多的β-1,3-1,4-葡聚糖酶主要来源于细菌。文中概述了细菌编码β-1,3-1,4-葡聚糖酶的分子生物学性质,并且从蛋白分子改造、表达调控和发酵条件优化三方面阐述了其催化活性提高的方法和成果。     

香蕉采后炭疽病发生与几丁酶、β-1,3-葡聚糖酶和多巴胺的关系

几丁酶、β－1,3-葡聚糖酶随着香蕉术后炭疽病的发展过程,活性逐渐增加;但当果实出现明显病害症状时活性略有下降。施保功处理在抑制香蕉采后炭疽病发生的同时也抑制了芭蕉炭疽菌可能诱导的几丁酶和β-1,3-葡聚糖酶活性的增加。多巴胺在香蕉采收时含量较高,但随着炭疽病的发生明显下降。对“黑油身”和“63－1”两个不同抗病品种分析表明,前者几丁酶和β－1,3-葡聚糖酶活性和多巴胺含量较高与其较强的抗病性相一致。     

小麦叶片β-1,3-葡聚糖酶的诱导、纯化与抗菌活性

三个小麦品种331、抗倒680和鲁麦23经氯化汞、水杨酸或核黄素处理后,叶片中的β-1,3-葡聚糖酶活性均有不同程度的升高.氯化汞处理24h对品种331该酶活性的诱导作用最强.因此取用氯化汞处理24 h的331小麦叶片研磨得到粗酶液.将粗酶液经硫酸铵分级沉淀、Phenyl-Sepharose Fast Flow疏水层析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Sephacryl S-100分子筛层析,得到了SDS-PAGE凝胶电泳谱带单一的β-1,3-葡聚糖酶样品.经SDS-PAGE(12%)和凝胶过滤层析,测得其分子量约为52.0～53.6 kD.抗菌试验测定显示,纯化的β-1,3-葡聚糖酶对供试的4种病原真菌的生长、孢子萌发或芽管伸长都有一定程度的抑制作用.     

水杨酸和黄萎病菌毒素处理棉花愈伤组织使β-1，3-葡聚糖酶和几丁质酶的活性增加

不同品种棉花(Gossypium hirsutum L．)愈伤组织对黄萎病菌毒素粗提物的抗性与体内β-l,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性水平有关。在毒素处理下,抗性品种比感性品种酶活性增加的幅度大、时间早。外源水杨酸(SA)处理后,棉花愈伤组织中的β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性增加。抗β-1,3-葡聚糖酶多克隆抗体与28 kD的蛋白条带有免疫交叉反应,毒素、SA、毒素 SA均能诱导该蛋白条带出现。     

淀粉液化芽孢杆菌β1-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆及表达

为了比较不同的表达系统对β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl)的效果,本研究将高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens BS5582的bgl基因(GenBank Accession No.EU623974)克隆到3种不同的质粒载体中,即构建pEGX-4T-1-bgl、pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl重组质粒.比较了pEGX-4T-1-bgl,在不同Escherichia coli宿主中表达效果,以及pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl在E coli BL21(DE3)中的表达效果.结果表明,E. coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bgl能够表达最高的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活,其总酶活可达(322.0±8.8)U/mL,是出发菌在最适摇瓶发酵条件下产酶活的40.1%.对该重组菌的产酶条件进行了分析,结合IPTG和乳糖协同的诱导作用,在基础产酶培养基中产最高总酶活为(1883.3±45.8)U/mL,表明其具有良好的工业应用价值.     

几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因研究进展

几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶是重要的水解酶,实践证明,转几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因植物能比较有效地抵抗真菌侵染。本综述了几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶结构分类、抗真菌机理．及其近年来在抗黄曲霉病研究中的应嗣研究,并对今后的研究及应用进行了预测。     

呼吸科肺部真菌感染患者血清1,3-β-D葡聚糖检测分析

【摘 要】 目的 为了解血清1,3-β-D葡聚糖在呼吸科肺部真菌感染患者的检测水平,探究血清1,3-β-D葡聚糖对肺部真菌感染患者的诊断及治疗监测的效果。方法 对2011年至2013年东阳市横店集团医院的呼吸科就诊的50例肺部真菌感染患者作为实验组,而以30例非真菌的肺部感染患者及30例健康人群作为对照组,分析三组人群血清1,3-β-D葡聚糖的检测水平,同时对实验组中真菌半定量检测结果与血清1,3-β-D葡聚糖比较分析。结果 试验组血清1,3-β-D葡聚糖明显高于两组对照组(P<0.01),而非真菌的肺部感染组与健康人群组之间差异无统计学意义（P>0.05）; 针对肺部真菌感染组的分析,发现痰液中真菌半定量培养阳性程度与患者血清1,3-β-D葡聚糖的水平呈现出正相关,痰液真菌培养半定量3+组血清1,3-β-D葡聚糖水平显著高于1+组和2+组(P<0.01)。结论 呼吸科肺部真菌感染患者血清1,3-β-D葡聚糖水平明显增高,且与痰液真菌培养阳性程度正相关,可作为临床肺部真菌感染诊断及疗效监测的指标之一。     

淀粉液化芽孢杆菌b-1,3-1,4-葡聚糖酶基因的克隆及表达的优化

为了比较不同的表达系统对β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl)的效果,本研究将高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amylolique faciens BS5582的bgl基因(GenBank Accession No.EU623974)克隆到3种不同的质粒载体中,即构建pEGX-4T-1-bgl、pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl重组质粒。比较了pEGX-4T-1-bgl在不同Escherichiacoli宿主中表达效果,以及pET20b(+)-bgl和pET28a(+)-bgl在E.coliBL21(DE3)中的表达效果。结果表明,E.coliBL21(DE3)-pET28a(+)-bgl能够表达最高的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活,其总酶活可达(322.0±8.8)U/mL,是出发菌在最适摇瓶发酵条件下产酶活的40.1%。对该重组菌的产酶条件进行了分析,结合IPTG和乳糖协同的诱导作用,在基础产酶培养基中产最高总酶活为(1883.3±45.8)U/mL,表明其具有良好的工业应用价值。     

黄粉虫β-1,3-葡聚糖识别蛋白的分离纯化及部分生物学功能

采用中性盐沉淀、凝胶层析等常规方法纯化黄粉虫Tenebrio molitor血淋巴中的β-1,3-葡聚糖识别蛋白,并对其在酚氧化酶原激活系统中的作用进行了初步的研究。结果表明:黄粉虫血淋巴的β-1,3-葡聚糖识别蛋白的分子量约为70 kDa,主要分布于血浆中。纯化的β-1,3-葡聚糖识别蛋白只能特异性地识别β-1,3-葡聚糖而不能识别肽聚糖。在β-1,3- 葡聚糖所诱导的酚氧化酶原的激活过程中,随着酚氧化酶原激活程度的提高,内源性β-1,3-葡聚糖识别蛋白的含量逐渐减少。抗β-1,3-葡聚糖识别蛋白多克隆抗体对黄粉虫血淋巴中由β-1,3-葡聚糖所诱导的酚氧化酶活性起抑制作用,且该抑制作用呈现一种剂量依赖性的趋势。上述结果有助于深入了解β-1,3-葡聚糖对黄粉虫血淋巴酚氧化酶原激活系统的激活作用。