毕赤酵母高密度发酵表达血管紧张素转化酶C-结构域

血管紧张素转化酶（ACE, EC3.4.15.1）在调节血压方面具有重要作用。研究证实,ACE的C结构域（ACE-C）是使血管紧张素I (AngI)分解的主要活性位点。在5 L 发酵罐中, 对重组毕赤酵母表达ACE C-结构域的发酵工艺进行优化,探讨温度、pH、甲醇浓度等主要因素对重组蛋白表达量和酶活力的影响。结果表明,当工业培养基添加2%蛋白胨为氮源时, ACE C-结构域的降解现象得到了有效控制;采用诱导温度为26℃,pH5.5,甲醇含量为1.5%的表达条件,ACE C-结构域表达量和酶活力分别达到446 mg/L和38.2U/ml,比活力达到86U/mg,是Sigma公司ACE标准品比活力的2倍,为大规模制备ACE C-结构域蛋白,筛选专一性更强的ACE C-结构域抑制剂奠定了基础。     

血管紧张素转换酶2调节肺肾素血管紧张素系统减轻肢体缺血再灌注诱导的急性肺损伤

目的探讨血管紧张素转换酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)对小鼠肢体缺血再灌注诱导的急性肺损伤的保护作用和机制。方法雄性野生型和ACE2转基因(过表达ACE2基因) ICR小鼠随机分为6组(n=18):野生对照组、野生模型组、ACE2对照组、ACE2模型组、ACE2模型+A779干预组和ACE2模型+MLN-4760干预组。采用橡皮筋结扎双侧后肢根部的方法建立急性肺损伤模型(缺血2 h,再灌注4 h)。HE染色观察肺组织病理学变化;肺组织脏器系数、湿/干重比、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)细胞计数和蛋白浓度检测肺组织含水量和肺泡毛细血管通透性;酶联免疫吸附法检测BALF中白介素-6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),以及肺组织血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)/Ang-(1-7)的浓度。qRT-PCR法分析肺组织ACE/ACE2的mRNA表达。Western Blot法检测肺组织ACE/ACE2和AT1/Mas受体的蛋白表达。结果与野生模型组相比,过表达ACE2基因可减轻肺组织病变,降低肺泡毛细血管通透性,降低BALF炎性细胞因子表达,逆转肺组织肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin system,RAS)稳态失衡。而且ACE2的这些保护作用被特异性ACE2抑制剂MLN-4760和Mas受体阻断剂A779所消除。结论 ACE2可通过ACE2-Ang-(1-7)-Mas轴改善肺组织局部RAS稳态失衡减轻急性肺损伤。     

利用酵母双杂交系统筛选水稻组蛋白去乙酰化酶HDA705的互作蛋白

为了解水稻(Oryza sativa)组蛋白去乙酰化酶HDA705的生物学功能,构建了HDA705酵母双杂交诱饵表达载体与双杂交文库,并筛选了与HDA705相互作用的蛋白。结果表明,HDA705的诱饵载体无自激活活性且对酵母无毒性作用,文库的滴度也适合常规的酵母双杂交文库筛选。通过对酵母双杂交文库的筛选,共获得了164个阳性克隆,经DNA测序分析,这些克隆编码47个可能与HDA705相互作用的蛋白,其中包括3个在逆境响应或激素信号转导过程中起到重要作用的(辅)转录因子、6个参与光合作用的叶绿体蛋白、1个含有R3H结构域的蛋白以及22种酶类等。这为进一步研究HDA705的生物学功能提供了重要的线索。     

血管紧张素转换酶基因多态性与冠心病发病的相关关系

目的:从分子遗传学角度分析血管紧张素转换酶(ACE)基因I/D多态与中国北方汉族人群中冠心病发病的相关关系。方法:本研究收集在沈阳军区总医院心内科住院的行冠脉造影检查的病例为研究对象,冠脉动脉照影检查显示冠状动脉主支狭窄程度大于等于70%的入选为冠心病组,冠状动脉照影检查显示冠状动脉主支狭窄程度小于20%的为对照组,共入选568名冠心病患者以及性别与年龄相匹配的529名对照个体为研究对象,利用测序的方法分析检测血管紧张素转换酶(ACE)基因I/D多态在冠心病组与对照组中的频率分布情况。结果:血管紧张素转换酶(ACE)基因I/D多态基因型频率符合Hardy-Weinberg定律。血管紧张素转换酶(ACE)基因I/D多态(II型,ID型和DD型)在我们入选的568例冠心病组分布频率分别为50.3%,30.3%和19.4%,而在我们入选的524例对照组中的分布频率为57.7%,31.2%和11.1%,研究发现血管紧张素转换酶(ACE)基因I/D多态可能是中国北方汉族人群冠心病发病的独立危险因素(P0.05);利用多元回归分析发现,在调整了冠心病的其他危险因素后,血管紧张素转换酶(ACE)基因I/D多态的变化仍然是中国北方汉族人群冠心病发病一个独立危险因素,可以预测中国北方汉族人群冠心病的发生。结论:在中国北方汉族人群中,血管紧张素转换酶(ACE)基因I/D多态可能是冠心病发病的独立危险因素,在临床上可以早期预判冠心病的发生。     

高效液相色谱法测定可口革囊星的ACE活性

目的利用高效液相色谱法测定可口革囊星虫酶解物中具有抑制血管紧张素转化酶(ACE)活性的活性肽。方法用HPLC测定血管紧张素转换酶抑制肽活性,在该色谱条件下,可通过测定由ACE水解马尿酰组氨酰亮氨酸后产生的马尿酸峰面积或含量得到酶解液的活性。结果酶解物在质量浓度为0.48mg/ml时对ACE的抑制率为17.62%。结论可口革囊星虫蛋白经碱性蛋白酶水解后得到的酶解物活性较高。     

作为肾素-血管紧张素系统调节器和SARS病毒受体的人血管紧张素转换酶2

人血管紧张素转换酶2(ACE2)是目前已知的惟一的人血管紧张素转换酶(ACE)的同源物,是一种新型的金属羧肽酶,很多特性与ACE截然不同.ACE2在肾素-血管紧张素系统(RAS)中具有独特的作用,调节心脏功能和机体血压.最近ACE2被鉴定为SARS病毒的功能受体.ACE2已经成为目前药物研发的新靶点.对ACE2的认识才刚刚开始,有待进-步深入研究.     

用毕赤酵母组成型分泌表达Canstatin-N

目的:用毕赤酵母的GAP启动子调控组成型表达Canstatin-N。方法:将canstatin-N基因重组于毕赤酵母表达载体pGAP9K的多克隆位点获得pGAP9K-can-N。用电转法将pGAP9K-can-N转化毕赤酵母GS115。筛选高G418抗性的克隆作为工程菌GS115(pGAP9K-can-N)。发酵GS115(pGAP9K-can-N)分泌表达Canstatin-N,用离子交换法纯化目标蛋白。结果:以葡萄糖为碳源,发酵48h分泌表达人血管能抑素蛋白56 mg/L。结论:用毕赤酵母的GAP启动子调控组成型表达的人血管能抑素蛋白具有诱发血管内皮细胞凋亡的生物活性。     

抗菌肽牛乳铁多肽素（LfcinB）在毕赤酵母中的表达及活性鉴定

利用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastors)系统表达抗菌肽——牛乳铁多肽素(bovine lactoferricin,简称Lf-cinB),获得的分泌型表达产物具有较强的抗菌活性。首先将人工合成的LfcinB基因片段克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得的重组质粒pPIC9K-LfcinB通过限制性内切酶SalⅠ酶切线性化,经电穿孔法转化入毕赤酵母细胞SMD1168内。G418抗性筛选,得到高拷贝转化子,经PCR检测LfcinB基因与毕赤酵母染色体稳定整合。阳性克隆经甲醇诱导表达LfcinB。结果表明,抗菌肽牛乳铁多肽素基因已经整合到酵母细胞基因组中并获得表达,表达产物具有较强的杀菌作用。     

功能性新型冠状病毒RBD结构域在毕赤酵母表面的展示*

目的:设计并构建新型冠状病毒(SARS-CoV-2)受体结合结构域(receptor binding domain,RBD)在毕赤酵母表面的展示体系,并对表面展示的RBD进行功能性评价,从而为以RBD为靶点的高通量药物筛选平台奠定基础。方法:将四种锚定分子与新冠病毒RBD融合,电转化至毕赤酵母中;通过细胞免疫荧光分析,筛选能够成功展示RBD的锚定系统;进一步分析其与血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)受体的亲和力,证明展示在细胞表面RBD分子的功能。结果:仅Sed1p锚定分子能够有效呈递RBD至毕赤酵母细胞表面,展示效率约为70%;亲和力分析结果表明,ACE2受体和表面展示RBD的亲和力(K_D = 30.42 nmol/L)与溶液中RBD的亲和力(K_D = 16.00 nmol/L)较为接近。结论:这一体系能够在毕赤酵母表面高效地展示具有生物学功能的RBD,可用于抗新冠病毒RBD药物的高通量筛选和评价。     

血管紧张素转换酶2对心脏作用的研究进展

血管紧张素转换酶2作为肾素—血管紧张素系统的新成员,对心脏功能及心脏节律发挥着重要的调节作用。缺乏ACE2会造成心功能的下降,原因可能是心肌慢性缺氧、血管紧张素Ⅱ水平的提高、血管紧张素(1-7)对心脏保护作用的缺失以及其他肽类底物的增加。但同时ACE2的过度表达又会引起心脏传导紊乱和致死性的心律失常。因此,ACE2精确的生理作用有待进一步明确,但调节ACE2的活性可能为心血管疾病的治疗提出了新的思路。本文主要介绍了ACE2的分布与特性,及其对心功能及心脏节律的影响。     

玉米赤霉烯酮降解酶多拷贝毕赤酵母菌株的构建及高效表达

通过密码子优化、体外多拷贝构建实现玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)降解酶基因(zlhy-6)在毕赤酵母GS115菌株中的高效表达。按酵母密码子偏好性优化zlhy-6基因的密码子,与α因子信号肽编码序列一起合成,插入到pAO815质粒中,通过酶切酶连构建含1–6个表达盒的表达质粒,将其转入毕赤酵母GS115菌中,获得ZEN降解酶重组菌株。重组蛋白分子量为28.9 kDa,与预期一致。重组菌用甲醇诱导3 d,蛋白浓度达最高,之后下降;在pH 5.0、4.5条件下诱导培养,表达量最高;每天添加0.8%的甲醇、接种量10%表达水平最高;4拷贝的转化子表达水平最高,三角瓶发酵3 d,酶活性达到10 U/mL。在1 g玉米渣中添加0.1–0.5 mL发酵上清液,水解24 h,玉米渣中ZEN的降解率为44.08%–75.51%。研究结果为ZEN降解酶工业生产及在食品饲料中的应用奠定了基础。     

Selective inhibition of the C-domain of angiotensin I converting enzyme by bradykinin potentiating peptides

Somatic angiotensin I converting enzyme (ACE) contains two functional active sites. Up to now, most of the studies aimed at characterizing the selectivity of inhibitors toward the two ACE active sites relied on the use of ACE mutants containing a single functional active site. By developing new fluorogenic synthetic substrates of ACE, we demonstrated that inhibitor selectivity can be assessed directly by using somatic ACE. This useful screening approach led us to discover that some bradykinin potentiating peptides turned out to be selective inhibitors of the C-domain of ACE. The peptide pGlu-Gly-Leu-Pro-Pro-Arg-Pro-Lys-Ile-Pro-Pro, with K(i)(app) values of 30 nM and 8 microM, respectively, for the C- and N-domain of ACE, is to our knowledge the most highly selective C-domain inhibitor of ACE so far reported. Inhibitors able to block selectively either the N- or C-domain of ACE will represent unique tools to probe the function of each domain in the regulation of blood pressure or other physiopathological events involving ACE activity.     

重组人肠激酶轻链的原核表达、纯化及活性分析

【目的】在原核表达系统中实现人肠激酶轻链(Human enterokinase light chain,hEKL)的表达和纯化。【方法】通过PCR扩增得到编码hEKL的基因片段,利用基因重组技术构建原核表达质粒pMAL-s-hEKL,在Escherichia coli中进行诱导表达,菌体经超声破碎后利用Amylose亲和柱对目标蛋白进行纯化,并利用Tricine SDS-PAGE检测酶的切割活性。【结果】目的基因能够以可溶形式表达,每升发酵液可纯化得到40 mg纯度在97%以上的MBP-hEKL蛋白,活性检测表明该酶可以对含有肠激酶识别序列的蛋白进行特异性切割,酶活力达到6.0×105U/mol。     

青霉素酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达

以获得大量胞外青霉素酶为目的,将青霉素酶基因克隆至表达载体pWB980中,并转化到双蛋白酶缺陷的Bacillus subtilis DB104。重组菌在LB培养基中培养24小时后, SDS-PAGE分析发现目的蛋白分子量为28kDa,酶活力为339U/mL;通过筛选7种不同的发酵培养基发现4#培养基更利于青霉素酶的表达,最大酶活力为1580U/mL,较优化前提高了3.66倍,并对该重组菌进行了7L罐放大实验,结果显示在培养24小时产酶达到高峰,酶活力为1255.8 U/mL。     

费希尔曲霉脂肪酶在毕赤酵母中的优化表达及高密度发酵

【背景】脂肪酶广泛应用于纺织、食品、药品、皮革等工业领域,其在微生物中的异源表达研究进一步促进了脂肪酶产品的生产和应用。【目的】实现来源于费希尔曲霉的脂肪酶在毕赤酵母中的高效异源表达,探究其合适的表达及发酵条件,提高产量,降低成本。【方法】对费希尔曲霉的脂肪酶编码基因进行密码子优化后,应用pPIC9k质粒整合到毕赤酵母GS115基因组上,构建高产脂肪酶Lip605的毕赤酵母工程菌;并通过响应面发酵条件优化、筛选最适伴侣蛋白和高密度发酵相结合的方法,综合提高脂肪酶表达量。【结果】确定高产脂肪酶毕赤酵母工程菌的最优摇瓶发酵产酶条件为:甲醇3.103%(体积比),生物素0.4 mg/L,酵母粉11.5 g/L,酵母基础氮源培养基(yeast nitrogen base,YNB) 13.4 g/L,初始pH 6.4,装液量50 mL/250 mL,转速220 r/min,温度24°C,培养时间40 h。优化后的胞外脂肪酶酶活达到72.34 U/mL,较优化前提高了5.8倍;进一步选择12个伴侣蛋白分别与脂肪酶Lip605进行共表达,其中共表达伴侣蛋白Rpl10(pPICZA-RPL10)效果最佳,可使Lip605表达量进一步提高46.8%;在此基础上,经过10 L发酵罐分批补料的高密度发酵,工程菌株发酵142 h,胞外脂肪酶酶活最高达到680 U/mL,蛋白浓度为15.89 g/L。【结论】应用复合策略有效提高了脂肪酶Lip605在毕赤酵母中的发酵产量,为其进一步工业化生产奠定了良好的基础。     

Hydrolysis by somatic angiotensin-I converting enzyme of basic dipeptides from a cholecystokinin/gastrin and a LH-RH peptide extended at the C-terminus with gly-Arg/Lys-arg, but not from diarginyl insulin.

Endoproteolytic cleavage of protein prohormones often generates intermediates extended at the C-terminus by Arg-Arg or Lys-Arg, the removal of which by a carboxypeptidase (CPE) is normally an important step in the maturation of many peptide hormones. Recent studies in mice that lack CP activity indicate the existence of alternative tissue or plasma enzymes capable of removing C-terminal basic residues from prohormone intermediates. Using inhibitors of angiotensin I-converting enzyme (ACE) and CP, we show that both these enzymes in mouse serum can remove the basic amino acids from the C-terminus of CCK5-GRR and LH-RH-GKR, but only CP is responsible for converting diarginyl insulin to insulin. ACE activity removes C-terminal dipeptides to generate the Gly-extended peptides, whereas CP hydrolysis gives rise to CCK5-GR and LH-RH-GK, both of which are susceptible to the dipeptidyl carboxypeptidase activity of ACE. Somatic ACE has two similar protein domains (the N-domain and the C-domain), each with an active site that can display different substrate specificities. CCK5-GRR is a high-affinity substrate for both the N-domain and C-domain active sites of human sACE (Km of 9.4 microm and 9.0 microm, respectively) with the N-domain showing greater efficiency (kcat : Km ratio of 2.6 in favour of the N-domain). We conclude that somatic forms of ACE should be considered as alternatives to CPs for the removal of basic residues from some Arg/Lys-extended peptides.     

人甲状旁腺激素-血清白蛋白融合蛋白的构建及在毕赤酵母中的表达

利用重叠PCR技术拼接PTH和HSA基因,并将构建好的融合基因插入到载体pUC19测序后插入表达载体pPIC9K中,在启动子AOXⅠ和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白PTH-HSA。重组质粒pPIC9K/PTH-HSA经SalⅠ线性化后,电击转化毕赤酵母KM71,经G418筛选得到的转化子。PCR鉴定后,用甲醇诱导表达,蛋白电泳分析表明融合基因得到表达; Western blot分析表明发酵液上清中表达的融合蛋白PTH-HSA具有HSA的抗原性:用酶标法测定发酵上清中融合蛋白的甲状旁腺激素活性为318IU/ml     

Oenococcusoeni苹果酸-乳酸酶基因克隆及其在酿酒酵母中的表达

苹果酸-乳酸酶是苹果酸-乳酸发酵过程中负责苹果酸转化为乳酸的功能酶。在进行酒酒球菌SD2a的苹果酸-乳酸酶基因(mleA)克隆测序基础上,以PGK1强启动子和ADH1终止子为调控元件,以大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒YEp352为载体,构建了重组表达质粒并转化酿酒酵母YS58。酵母转化子用SD/Ura平板筛选鉴定。斑点杂交检测表明目的基因mleA转化到受体菌中,SDSPAGE检测表明获得的转化子表达了约60kDa的目标蛋白。获得的转化子在添加了L苹果酸的培养基中培养4d;取培养液上清用HPLC检测L苹果酸及L乳酸含量,采用t检验进行差异显著性分析,结果表明mleA基因进行了功能性的表达,将L苹果酸转化成L乳酸,L苹果酸和L乳酸含量分别与对照差异极显著和显著,苹果酸的相对降低率平均为20.95%。在有选择压力条件下,重组质粒相对稳定,而在无选择压力条件下,传代培养10d后大约有65%的重组质粒丢失。     

甲酸脱氢酶在Klebsiella pneumoniae中的表达和功能分析

在甘油厌氧发酵生产1,3-丙二醇的过程中,需要消耗还原当量NADH,NADH的有效供给决定了1,3-丙二醇的产量和得率。采用PCR方法从Candidaboidinii基因组中克隆编码甲酸脱氢酶基因fdh,将fdh基因片段插入载体pMALTM-p2X中,构建表达载体pMALTM-p2X-fdh,并转入1,3-丙二醇生产菌Klebsiella pneumoniae YMU2,获得重组菌Klebsiella pneumoniae F-1。研究了重组质粒的稳定性和IPTG诱导fdh基因过量表达的条件。结果表明,重组质粒具有良好的稳定性;fdh基因表达的蛋白分子量为40.2kDa;IPTG诱导表达研究表明,在IPTG浓度为0.5mmol/L时,诱导4h后甲酸脱氢酶表达明显;发酵过程中甲酸脱氢酶比酶活达到5.47U/mg;与出发菌株K.pneumoniae YMU2相比,重组菌F-1合成1,3-丙二醇的浓度提高了12.5%。