小鼠电融合四倍体胚胎早期发育的研究

多倍体发育现象在低等动物,尤其是在无脊椎动物中比较普遍,在哺乳动物中多倍体往往发育到胚胎早期就死亡,因而在自然界中不能存活。探讨哺乳类四倍体不能存活的原因是当今生物学研究的热点问题之一。目前,电融合技术是大量获得四倍体胚胎的主要手段。本以8－12周龄昆明小白鼠为实验对象,取其2－细胞胚胎于Whitten氏液中进行电融合,再移入CZB液中培养。电刺激的条件分别为：1．0kv/cm,40μs,和0．8kv/cm,80μs。对融合胚发育的状态、细胞数目及染色体组成等进行观察的结果表明,融合胚培养24小时后发育到4－细胞期,并发生致密化（Tab.1)。融合胚的囊胚形成时间与体内发育的同期胚胎及体外培养的同期二倍体胚胎基本一致（Tab,2;Fig.1)。融合囊胚的细胞数平均为13．0±4．95,显（P＜0．01）少于体外发育囊胚（37．0±5．92）和体内发育囊胚（41．6±2．4）的细胞数（Tab.3)。融合胚各个分裂相的染色体数目分布情况见Fig.2,其四倍体（4n＝80）率为42．86％,非整倍体率达57．14％。而对照组的体内发育囊胚的非整倍体率仅为11．54％;（Tab.4),与Kaufman的结果（12．4％）很接近,说明本实验中的染色体制备技术和分析方法是可行的。融合囊胚的细胞数目减少和高发的非整倍体率可能是四倍体胚胎发育能力差的原因。     

小鼠胚胎干细胞与四倍体胚胎的嵌合

The oviducts of superovulated Kunming white females were flushed 44-46 hours after treatment with human chorionic gonadotropin to collect 1074 late two-cell-stage embryos.The embryos were placed twenty at a time between two platinum electrodes laid 1 mm apart in 0.3M mannitol in the electrode chamber.The blastomeres were fused by a short electric pulse(80V for 50μsec) applied by a pulse generator.Fusion of blastomeres was usually completed in 20-60minutes.After 25 hours of culture,most of the tetraploid embryos developed to the four-cell stage.Zonae pellucidae of 387 four-cell-stage tetraploid embryos were removed by treatment with acid Tyrode‘s buffer.The embryos were plated on an ES cell layer,After 40 hours of coculture,248 embryos aggregated with ES cells were collected and transferred into the uteri of twenty four 2.5-day pseudopregnant recipinets.Ten recipients were pregnant.but no live fetuses were born.Three pregnant recipients were routinely subject to a Caesarean section on day 18 of pregnancy and seven abnormal fetuses were obtained.The results demonstrate that ES cells derived from C57BL/6 mice are pluripotential to a certain extent.     

小鼠遗传背景对4n胚胎及2n-4n聚合胚制作效率的影响

不同品系小鼠的 2 细胞期胚胎 (二倍体 ,2n) ,经电融合后 ,获得发育的 4 细胞期四倍体胚胎 (4n)的能力上存在着差异。将不同品系小鼠的 2n、 4n胚胎分别配对作聚合 ,所获 2n 4n聚合胚的发育结果表明 :在着床前 ,2n 4n聚合胚的获得率因胚胎品系组合的不同而异 ;胚胎移植后 ,聚合胚在与 4n胚胎相同或相近品系的移植受体中 ,其着床率较高 ;在着床后胎儿及出生仔鼠的获得率上 ,采用遗传杂合性的 2n胚胎所组成的 2n 4n聚合组合较高。上述结果提示 :小鼠的遗传背景可影响到 4n胚胎及相应 2n 4n聚合胚的制作效率。以GFP标记跟踪2n 4n聚合胚 4n细胞着床后的发育命运 ,发现 :妊娠中后期的孕体中 ,4n细胞限制性地分布至胚外组织     

抗肿瘤药物对小鼠早期胚胎发育的影响

表观遗传修饰在基因表达和克隆胚胎的早期发育方面有重要作用.表现遗传修饰至少发生在两个关键时期--配子形成期和植入前胚胎,如果在此期间发生异常,则会导致胚胎的死亡及出生后各种疾病的发生.其中DNA的甲基化是最重要的一种表观遗传修饰类型,DNA甲基化在哺乳动物发育过程中起关键作用.综述几种类型抗肿瘤药物作用机制——其使胚胎的DNA甲基化降低,引起转录活性降低,进而导致胚胎发育停滞.     

父系遗传背景对小鼠体细胞核移植效率的影响

为了评价父系遗传背景对小鼠体细胞核移植效率的影响,本试验用129/Sv小鼠、C3H小鼠和ICR的雄鼠分别与昆明雌鼠(KM)杂交的F1代为研究对象,以KM自交鼠F1代为对照,比较卵母细胞的可操作性以及重构胚的激活率、卵裂率和囊胚发育率。结果显示:129/Sv×KM、C3H×KM和KM×KM的去核效率显著高于ICR×KM(78.0%、82.9%、81.0%vs63.9%;P<0.05);129/Sv×KM的注核成功率显著高于C3H×KM、ICR×KM和KM×KM(83.0%vs59.6%、55.5%、71.4%;P<0.05);129/Sv×KM的重构胚激活率显著高于C3H×KM、ICR×KM和KM×KM(97.3%vs85.2%、81.7%、78.3%;P<0.05);C3H×KM的卵裂率和囊胚率显著高于ICR×KM和KM×KM(84.5%、28.2%vs63.2%、11.4%,64.5%、16.5%;P<0.05)。研究表明129/Sv、C3H和ICR3个品系父系遗传背景影响小鼠体细胞核移植效率,其中C3H父系遗传背景的卵母细胞可提高体细胞核移植效率。     

小鼠四倍体早期胚胎基因组甲基化模式

利用小鼠抗5-甲基胞嘧啶(5MeC)单克隆抗体检测了体外培养小鼠四倍体早期胚胎的基因组甲基化模式。结果表明: 利用电融合方法制备的小鼠四倍体胚胎在体外培养体系中经历细胞质融合、细胞核融合及细胞继续分裂发育直到囊胚期的过程, 在细胞质融合的时候胚胎卵裂球同体内体外培养二倍体胚胎一样, 呈现高度甲基化状态; 在细胞核开始融合的时候, 甲基化水平急速下降, 在细胞核完全融合的时候甲基化水平达到最低点; 随着胚胎继续分裂, 胚胎甲基化水平逐渐增加, 在桑葚胚期甲基化水平最高; 但是囊胚期四倍体胚胎内细胞团同滋养层细胞甲基化荧光信号没有差别, 这与体内体外培养二倍体囊胚内细胞团细胞甲基化荧光强度高于滋养层细胞甲基化荧光强度不同。因此, 小鼠体外培养四倍体胚胎的甲基化模式是不正常的, 这可能是四倍体小鼠难以发育到妊娠足月的原因之一。这是对小鼠四倍体早期胚胎基因组甲基化模式的首次报道。     

小鼠2—细胞期经电融合后的早期胚胎发育

小鼠２－细胞期经电融合后的早期胚胎发育小鼠,电融合,细胞数,核型,四倍体胚胎小鼠２细胞期经电融合后的早期胚胎发育ＥＡＲＬＹＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴＯＦＭＯＵＳＥＥＭＢＲＹＯＳＰＲＯＤＵＣＥＤＢＹＥＬＥＣＴＲＯＦＵＳＩＯＮＡＴ２ＣＥＬＬＳＴＡＧＥ关键...     

离子浓度对小鼠2-细胞胚胎电融合的影响

四倍体胚胎的制备已经成为生物学家研究小鼠以及其它哺乳动物发育生物学的有力工具。目前,制备小鼠四倍体胚胎最常用的方法是电融合法,其中电融合液中的离了种类和离子浓度是影响胚胎电融合成败的关键因素。本文比较了Ca^2＋、Mg^2＋、Sr^＋、Na^＋、K^＋、Li^＋等阳离子对小鼠2-细胞胚胎电融合的影响。结果发现,在100V／mm电场强度、50μsec脉冲时程和2次脉冲的电融合条件下,少量二价阳离子的存在是胚胎融合所必须的,当Ca^2＋为0．1mM时,可使全部胚胎发生电融合,而一价阳离子的存在不利于胚胎的电融合。随着各种离子浓度的大幅升高,胚胎的融合率急剧下降、胚胎死亡数量增加以及死亡程度加剧。     

遗传修饰小鼠胚胎干细胞种系嵌合体小鼠的研制

利用显微注射的方法,分别将三株不同类型的经过遗传修饰的中靶ES细胞注射到C57BL/6J小鼠的囊胚中,通过胚胎移植将注射后的囊胚引入受体小鼠子宫中,分别获得了不同整合度的嵌合体小鼠,将高碳合度小鼠与C57BL/6J小鼠杂交,对这些仔鼠进行PCR及Southern鉴定的结果表明,三株修饰后的ES细胞均能整合入生殖系,得到了棕褐色子代鼠,表明获得了种系嵌合体小鼠。     

Mouse cloning and somatic cell reprogramming using electrofused blastomeres

Mouse cloning from fertilized eggs can assist development of approaches for the production of "genetically tailored" human embryonic stem (ES) cell lines that are not constrained by the limitations of oocyte availability. However, to date only zygotes have been successfully used as recipients of nuclei from terminally differentiated somatic cell donors leading to ES cell lines. In fertility clinics, embryos of advanced embryonic stages are usually stored for future use, but their ability to support the derivation of ES cell lines via somatic nuclear transfer has not yet been proved. Here, we report that two-cell stage electrofused mouse embryos, arrested in mitosis, can support developmental reprogramming of nuclei from donor cells ranging from blastomeres to somatic cells. Live, full-term cloned pups from embryonic donors, as well as pluripotent ES cell lines from embryonic or somatic donors, were successfully generated from these reconstructed embryos. Advanced stage pre-implantation embryos were unable to develop normally to term after electrofusion and transfer of a somatic cell nucleus, indicating that discarded pre-implantation human embryos could be an important resource for research that minimizes the ethical concerns for human therapeutic cloning. Our approach provides an attractive and practical alternative to therapeutic cloning using donated oocytes for the generation of patient-specific human ES cell lines.     

激光辅助制作小鼠嵌合体胚胎的研究

目的：探索激光辅助体外制作小鼠嵌合体胚胎的方法。方法：激光辅助去除不同发育阶段体外受精胚胎的透明带,随机组合卵裂球体外培养,观察胚胎融合情况。结果：没有透明带的卵裂球体外能够“自发”融合,并且融合胚胎在体外培养环境中,能够发育至囊胚期,显微镜观察其形态基本与二倍体胚胎无差别。结论：激光辅助方法获得裸露的卵裂球能够在体外培养环境制作嵌合体胚胎。     

不同品系小鼠的体外受精、胚胎冷冻及移植的比较研究

目的　探讨不同品系小鼠的体外受精、胚胎和精子的低温保存效果。方法　本实验分别在中国科学院上海实验动物中心 (SLAC)和日本熊本大学动物资源开发中心 (CARD)对 13个品系小鼠 (C57BL 6J、BALB c、C3H HeJ、ICR、KM、FVB、MRL、NOD、CBA、DBA 2、CD 1、BDF1、B6C3F1)的体外受精 (IVF)率、胚胎培养及移植成绩进行了比较研究。结果　各品系小鼠新鲜精子的IVF率 15 1%～ 87 9% ,冻融精子的IVF率 8%～ 80 % ;冷冻胚胎的复苏率4 2 6 %～ 83 9% ;冻融胚胎移植后的产仔率在 17 8%～ 5 1 8%。结论　遗传背景不同的小鼠体外受精率、冷冻胚胎复苏率和胚胎移植的产仔率差异有显著性。但同一品系两个实验室间的新鲜精子的IVF率、冷冻胚胎的复苏率及移植产仔率差异无显著性 (P >0 0 5 ) ;冻融精子的体外受精率CARD明显高于SLAC(P <0 0 1)。     

Influence of Nitric Oxide Synthase Inhibitors on Embryo Destruction and Morphological Features in Pre- and Postimplantation Mouse Embryos

Nitric oxide is an important intraovarian regulatory factor. The periimplantation period is a critical phase in mouse development. Although it was shown that nitric oxide plays an essential role during gestation, its role in the preimplantation period is not yet fully clear. We studied the involvement of nitric oxide in developmental competence (embryonic defects and morphology of pre- and postimplantation embryos) using nitric oxide synthase inhibitors, which suppress all forms of nitric oxide synthase, and female mice, to which the inhibitors had been administered before their mating with intact males. The level of mortality of pre- and postimplantation embryos in females mated to intact males increased soon after the administration of inhibitors. Studies of the morphology of embryos have shown that there was a delay in embryogenesis at the stages of cleavage and gastrulation. The results obtained suggest that nitric oxide is a potent regulator of embryonic differentiation, specifically in pre- and postimplantation mouse embryos.     

牛血清白蛋白对小鼠原核期胚胎玻璃化冷冻的影响

以小鼠原核期胚胎为对象,以胚胎的存活率、卵裂率、囊胚率以及囊胚细胞数作为检测指标,在M2液的基础上添加8种浓度(0,2,4,8,16,32,64,96mg/mL)牛血清白蛋白(BSA)配置防冻液,探讨防冻液和玻璃化冷冻后对胚胎发育的影响。BSA防冻液对胚胎发育影响的实验结果表明,8个浓度组间以及与对照组间胚胎的卵裂率、囊胚率以及囊胚细胞数无显著差异(P>0.05),说明在防冻液中加入一定浓度的BSA对小鼠胚胎无毒性作用。防冻液经玻璃化冷冻后对胚胎发育影响的实验表明,8个浓度组间冷冻胚胎复苏后的存活率、卵裂率、囊胚率及囊胚细胞数无显著差异(P>0.05)。表明BSA在这种防冻液中没有明显的保护作用。从经济、实用、生物安全角度考虑,不支持在玻璃化防冻液中添加BSA。     

婆罗门牛mtDNA D-loop变异及其遗传背景

对10头原种婆罗门牛mtDNAD-loop全序列912 bp测序,婆罗门牛遗传多样性丰富,检测到的9种单倍型兼有瘤牛(B.indicus)与普通牛(B.taurus)的遗传背景,核苷酸变异率为6.25 %,单倍型多态度为0.978±0.054 ,核苷酸多态度为0.014 30±0.008 68。所有单倍型聚为明显的两大分支,婆罗门牛的大部分单倍型为普通牛单倍型类群,并占绝对优势(90 %) ,仅Brah-6与亚洲瘤牛聚在一起,属于亚洲瘤牛线粒体单倍型,表明婆罗门牛的确是集亚洲瘤牛、欧洲普通牛等优良特性于一身(易产犊、产肉性能好、耐热与体表寄生虫等)的瘤牛品种之一。育种学家引种瘤牛的目的是改善当地牛的生产力与适应性,现代普通牛表现出明显又普遍的瘤牛渐渗现象。对现代的瘤牛品种而言,除亚洲瘤牛品种外,普通牛对其他瘤牛品种育成的贡献同样高。支持瘤牛(B.indicus)为独立驯化、起源于印度次大陆的假说。     

数量性状发育遗传模型及其分析方法的研究进展

发育遗传模型是同时反映性状遗传和发育本质、提供影响遗传变异及调整发育进程的有关因素的信息的模型。建立在群体遗传学基础上的直接效应模型适用于单一基因控制的简单性状。渐成模型将遗传变异分解成直接分量和渐成分量(母体效应和互作效应),能更好地反映有机体遗传和发育的生物学机制。生长轨迹模型有效地综合了复杂性状各分量的发育动态,可获得连续的、综合的、详细的、动态的发育信息。条件遗传分析方法不仅可以估算特定时间段的净效应,且可将净效应分解为不同遗传分量,了解各效应分量的相对贡献。 Abstract：Developmental genetic models and analysis methods for quantitative traits are presented.Developmental genetic models should reflect the genetic and developmental essence,and provide the information of the factors influencing the genetic variation and the developmental process.Direct effect models,which based on the population genetics,may be suitable to analyze simple traits with single gene.Epigenetic models can decompose the whole genetic variation into direct and epigenetic components (maternal effects and epigenetic interaction effects),so that biological mechanism can be better understood.Growth trace models effectively synthesize the developmental dynamics of components of complex traits.With them,continuous,compositive,detailed,and dynamic information of development is available.Conditional analysis method can not only estimate the net effects in a specific time interval,but also depose them into genetic components and help to appreciate the contributions of different effects.     

猪卵母细胞体外成熟的发育潜力及核移植重构胚构建方法的研究

为了提高猪体细胞核移植重构胚发育潜力,本研究对体外成熟28 h、32 h、36 h、40 h、44 h、48 h、52 h和56 h的猪卵母细胞分别进行去核构建重构胚.研究结果表明,成熟44 h的卵母细胞核移植后有较高的融合率(58.99%)、卵裂率(67.52%)和囊胚率(22.78%),而成熟48 h的卵母细胞则分别为56.51%、65.73%和15.96%;且卵龄为44 h的卵母细胞核移植后分裂率与囊胚率显著高于卵龄为40 h、36 h、32 h、28 h的卵母细胞的分裂率与囊胚率(P＜0.05).卵龄为48 h的卵母细胞融合率高于卵龄为52 h卵母细胞的融合率(P＜0.05).同时我们还探讨了不同去核方法(盲吸法、Hochest33342染色法和Spindle-view system)对猪体细胞核移植重构胚发育能力的影响.研究结果发现,盲吸法、Hoechest33342染色法和Spindle-view system法的去核率分别达到76.33%,100.00%和98.40%.Hoechest染色法去核率显著高于盲吸法的去核率(P＞0.05),而与Spindle-view法去核率没有差异(P＞0.05).三种方法在融合率和囊胚率方面差异不显著(P＞0.05),但Hoechest染色法的分裂率较低,差异显著(P＜0.05).进一步的研究表明,细胞质内注射进行核移植构建重构胚的分裂率和囊胚率分别为68.13%和6.44%;透明带下注射法则为60.37%和8.08%,两者差异不显著(P＜0.05);两者均可运用于猪体细胞的核移植,这为建立有效的猪体细胞核移植体系提供了参考.     

高浓度葡萄糖对昆明小鼠早期胚胎发育的影响

建立昆明小鼠受孕模型,分离并体外培养胚胎细胞.检测了各培养浓度下的细胞增殖、分化与凋亡.胚胎细胞在0.2mmol/L和5.56mmol/L葡萄糖浓度的KSOM培养基中能正常发育和孵化;而在浓度为15.56mmol/L和25.56mmol/L葡萄糖培养基中胚胎发育和孵化均受到损害(P<0.005),且总细胞数和内细胞团细胞数也明显减少(P<0.01),但其细胞凋亡率与0.2mmol/L和5.56mmol/L葡萄糖浓度下胚胎细胞凋亡率无显著性差异(P>0.05).随着葡萄糖浓度的增高,胚泡总的表面积无明显变化,但胚胎细胞密度呈增加趋势.高血糖对早期胚胎的发育具有毒性作用,提示高糖可能导致妊娠合并糖尿病患者的流产和胎儿畸形率升高.