LRRC15影响A549细胞自噬的作用研究

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种致病原因不明、进行性、慢性不可逆的间质性肺疾病。为探讨富含亮氨酸重复蛋白15(leucine-rich repeat-containing protein 15,LRRC15)在IPF的作用及调节机制,本研究构建了博来霉素(bleomycin,BLM)诱导的小鼠肺纤维化和A549细胞损伤模型,检测了LRRC15的表达变化。转染siLRRC15后分别采用MTT、GFP-RFP-LC3双荧光标记系统和免疫印迹等方法检测了细胞活性和自噬的变化。结果表明：BLM处理后,小鼠肺组织和A549细胞中LRRC15表达显著上调;将设计和合成的siLRRC15转入A549细胞,LRRC15的表达极显著降低,可以部分恢复BLM引起的细胞损伤;BLM处理A549细胞后,LC3-II和P62蛋白呈现上升的趋势;GFP-RFP-LC3双荧光标记检测发现,BLM处理后自噬体数量明显增多;进一步用siLRRC15处理A549细胞后发现,自噬关键蛋白LC3-II、ATG5、ATG7的表达增加,P62蛋白表达下调,自噬流的强度增加...     

细胞自噬与病毒感染

自噬是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性降解途径,在维持细胞存活、更新、物质再利用和内环境稳定中起着重要作用。目前已经发现大量新的自噬相关基因,同时发现自噬在病毒感染过程中发挥着重要的抗病毒作用:自噬可以将胞质中的病毒转运到溶酶体中,降解病毒;也可以将病毒核酸转运至胞内感受器上激活天然免疫;还可以将病毒抗原递呈给MHCⅡ类分子激活适应性免疫。自噬参与胞内微生物感染具有双重作用。一方面,自噬能够降解入侵的微生物,即以异源吞噬(xenophagy)的方式清除胞内的病原体;另一方面,有些微生物能够通过某些机制逃避自噬而利于自身存活。本文就细胞自噬及其与不同病毒感染关系的最新研究进展进行综述。     

吉西他滨与吉非替尼联合顺铂治疗西北区非小细胞肺癌患者的疗效分析

目的:比较吉西他滨与吉非替尼联合顺铂治疗非小细胞肺癌的临床有效性及安全性。方法:80例非小细胞肺癌患者根据入院顺序平分为治疗组与对照组各40例,治疗组采用吉西他滨联合顺铂治疗,对照组采用吉非替尼联合顺铂治疗,对比观察两组治疗效果及存活时间。结果:经过治疗后,治疗组无完全缓解患(CR)病例,部分缓解(PR)16例,有效率(RR)40.0%;对照组无完全缓解(CR)病例,部分缓解(PR)8例,有效率(RR)20.0%。治疗组的治疗有效率明显高于对照组,两组差异有显着性意义(P<0.05)。治疗组1年生存率为50.0%(20/40),对照组1年生存率为45.0%(18/40),两组1年生存率比较无统计学差异(P>005)。治疗组在治疗中有20例患者出现不同程度的不良反应,治疗组出现23例不同程度的不良反应。两组不良反应主要为皮疹、腹泻、转氨酶升高、皮肤水泡等。两组总的不良反应发生率与各个单项不良反应发生率相比无显着性差异,具有可比性(P>0.05)。结论:吉西他滨联合顺铂治疗非小细胞肺癌的临床有能取得更好的近期治疗效果,同时无明显不良反应,但不会提高1年生存率,值得推广应用。     

吉西他滨与吉非替尼联合顺铂治疗西北区非小细胞肺癌患者的疗效分析

目的：比较吉西他滨与吉非替尼联合顺铂治疗非小细胞肺癌的临床有效性及安全性。方法：80例非小细胞肺癌患者根据入院顺序平分为治疗组与对照组各40例,治疗组采用吉西他滨联合顺铂治疗,对照组采用吉非替尼联合顺铂治疗。对比观察两组治疗效果及存活时间。结果：经过治疗后,治疗组无完全缓解患（CR）病例,部分缓解（PR）16例,有效率（RR）40．0％;对照组无完全缓解（CR）病例,部分缓解（PR）8例,有效率（RR）20．0％。治疗组的治疗有效率明显高于对照组,两组差异有显着性意义（P〈0．05）。治疗组1年生存率为50．0％（20／40）,对照组1年生存率为45．0％（18／40）,两组1年生存率比较无统计学差异（P〉005）。治疗组在治疗中有20例患者出现不同程度的不良反应,治疗组出现23例不同程度的不良反应。两组不良反应主要为皮疹、腹泻、转氨酶升高、皮肤水泡等。两组总的不良反应发生率与各个单项不良反应发生率相比无显着性差异,具有可比性（P〉0．05）。结论：吉西他滨联合顺铂治疗非小细胞肺癌的临床有能取得更好的近期治疗效果,同时无明显不良反应,但不会提高1年生存率,值得推广应用。     

Beclin 1对凋亡和自噬的调控作用

Beclin 1是自噬关键调控蛋白之一,参与自噬体膜形成.近期,大量研究结果指出, Beclin 1是caspase家族蛋白酶的全新底物,可被caspase剪切.剪切后的Beclin 1失去自噬调节功能,转而加剧凋亡进程.因而,Beclin 1对细胞凋亡和自噬起着重要的调控作用. 本文主要对细胞凋亡和自噬的相关性,以及Beclin 1在两通路中的调控作用进行了回顾与总结.在此基础上,进一步讨论了Beclin 1与人类疾病如肿瘤、神经系统退行性疾病的关联.最后,简要介绍了实验室常用于Beclin 1研究的工具.     

细胞自噬的基因调控及其与稻瘟病的关系

细胞自噬是真核生物中广泛存在的过程,并且在进化上十分保守.在真核生物分化和发育的过程中,它参与胞内细胞器和蛋白质的周转,被认为在细胞的形态建成方面发挥重要作用.现就细胞自噬的分子机制和功能做一介绍,并对稻瘟病菌细胞自噬的研究现状进行了回顾.     

Egr-1基因沉默对A549细胞放射敏感性的影响

目的:探讨Egr-1基因沉默对人肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响。方法:选用A549细胞株作为研究对象,将其分成A、B、C三组,即空白对照组(只加入RPMI-1640培养)、阴性对照组(加入LV3-NC-sh RNA)、实验组(加入EGR1-homo-2294-sh RNA),采用慢病毒介导的sh RNA干扰技术使实验组细胞Egr-1基因沉默表达。利用荧光显微镜、自动化荧光定量细胞成像分析系统分析sh RNA转染,利用FQ-PCR分析Egr-1表达,再利用细胞克隆形成实验检测细胞放射敏感性参数的差异。结果:慢病毒介导的sh RNA成功转染阴性对照组、实验组细胞;空白对照组与阴性对照组Egr-1表达无差异(P0.05),实验组与空白对照组、阴性对照组比较Egr-1均受到明显抑制(P0.05);克隆形成实验中细胞放射敏感性参数D0、SF2实验组细胞与空白对照组、阴性对照组比较均存在明显差异(P0.05)。结论:Egr-1基因沉默使A549细胞放射敏感性降低,Egr-1表达可能与肿瘤细胞对放射的敏感性有关。     

Beclin1、p53与肺癌恶性度及疗效预后的相关性研究

目的通过定量检测肺组织中Beclin1和p53表达水平,分析自噬蛋白Beclin1与凋亡蛋白P53在肺癌发生发展中的作用,研究二者之间及其与肺癌临床病理分期的关系、为肺癌早期诊断提供新的思路和实验依据。方法选取外科手术或纤维支气管镜肺组织56例,依据2003年UICC公布的肺癌TNM分期标准同时结合临床表现、胸部CT、X线检查、纤维支气管镜检查、腹部CT或B超等将入选的50例病例进行分组:其中Ⅰ期5例,Ⅱ期10例,Ⅲ期(ⅢA+ⅢB)26例,Ⅳ期9例,各组年龄、性别等控制情况基本匹配。组织病理学分级按2003年UICC标准:G17例,G219例,G324例。另取6例癌旁组织或者病理确诊为正常组织作为对照组织。采用流式细胞术检测和分析不同病理分期以及不同临床分期肺癌组织中Beclin1、p53的表达水平,对该表达情况与对应的分期进行样本均数两两对比式统计学分析,并与正常肺组织作对照。结果 P53蛋白阳性表达百分率:肿瘤患者(63.96±9.43)%显著高于正常对照组(24.90±4.68)%,t=49.46,P0.05;肿瘤转移者显著高于未转移者,P0.05;并且P53蛋白表达随患者临床分期和病理分级的增加而逐渐增高(P0.05)。Beclin1蛋白检出率的变化规律与P53蛋白检出率的变化相反:肿瘤患者Beclin1蛋白(31.72±20.53)%,显著低于正常对照组(92.26±4.51)%,t=35.84,P0.05;该指标随患者临床分期和病理分级的增加而逐渐降低(P0.05)。Beclin1蛋白与P53蛋白二者相关性分析,Beclin1与p53的表达呈负相关,r=-0.848,P0.05。结论 Beclin1与p53的联合检测可以作为肺癌诊断指标,为估计肺癌的恶性度及预后提供依据。Beclin1与P53蛋白表达水平与肺癌发生发展的关系密切,肿瘤发生过程中细胞自噬作用降低和抗凋亡作用增强同时并存,提高自噬能力成为肿瘤治疗的又一途径。     

吉西他滨联合顺铂序贯吉非替尼治疗晚期非小细胞肺癌

目的:观察吉西他滨联合顺铂序贯吉非替尼治疗晚期非小细胞肺癌的疗效与毒副反应。方法:71例经病理学诊断的晚期(Ⅲb-Ⅳ期)非小细胞肺癌患者,随机分成两组,观察组给予吉西他滨加顺铂化疗,序贯吉非替尼。对照组给予吉西他滨加顺铂化疗。结果:两组有效率(RR)为36.1%VS14.3%(P=0.0362);疾病控制率(DCR)比较x2=14.782,P<0.001;中位生存期(MST)为12.1月VS10.8月(P<0.05);有统计学差异;观察组除了皮疹、腹泻毒副反应较大外,其他与对照组相仿。结论:吉西他滨联合顺铂序贯吉非替尼治疗晚期非小细胞肺癌有较好的疗效和安全性,可以扩大样本继续观察。     

二烯丙基二硫上调Beclin1 介导白血病K562 细胞自噬性死亡的研究

目的：通过二烯丙基二硫诱导白血病K562 细胞发生自噬性死亡,探讨其作用机制。方法：40 mg/LDADS 作用K562 细胞12 小时后,透射电镜观察K562 细胞超微结构,MDC 染色荧光显微镜观察自噬泡及流式细胞仪定量检测自噬率,RT-PCR 检测Beclin1mRNA 的表达水平。结果：DADS 作用后的K562 细胞后,透射电镜可观察到胞质内出现大量自噬体;MDC染色荧光显微镜观 察显示,K562 细胞胞浆中的自噬泡明显增多,而空白组与溶媒组胞浆中的自噬泡很少;流式细胞术定量测定空白对照组、溶媒对 照组、DADS药物组自噬率分别为(7.27± 5.60)%、(7.10± 5.13)%、(27.39± 6.51)%（P<0.05）;空白对照组为0.658± 0.007,溶媒对 照组为0.671± 0.012,两者的Beclin1mRNA 的表达强度无明显差异（P>0.05）,DADS 药物组为0.911± 0.008,高于对照组（P<0. 05）。结论：二烯丙基二硫可诱导白血病k562 细胞发生自噬性死亡,其机制可能与Beclin1 的上调有关。     

E2F-1基因在肺癌中的表达及意义

目的：探讨E2F-1基因在肺癌中的表达及意义。方法：采用免疫组化S-P法,检测60例肺癌及20例正常肺组织中E2F-1基因蛋白的表达情况。结果：E2F-1在肺癌组织中的阳性率为91.7%,显著高于正常肺组织的10%,两组间差异有显著性（P〈0.05）;E2F-1与肺癌患者的性别、年龄、组织学类型、分化程度及淋巴结转移等无相关性（P〉0.05）。结论：E2F-1的异常高表达在肺癌的发生发展中起重要作用,可作为肺癌基因诊断和治疗的靶点。     

bFGF 诱导肺腺癌细胞系A549 上皮间质转化

目的:探讨上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程在肺癌侵袭转移中的作用。方法:体外培养A549细胞,以bFGF(10ng/ml)进行干预后,倒置相差显微镜观察细胞形态学变化;间接免疫荧光观察上皮细胞标志物E-cadherin和间质细胞标志物vimentin蛋白表达的变化;采用细胞划痕试验检测bFGF对A549细胞迁移能力的影响;采用transwell小室试验检测bFGF对A549细胞侵袭能力的影响。结果:bFGF(10ng/ml)干预后,在倒置相差显微镜下观察,A549细胞形态变成了梭形,形态如同成纤维细胞。间接免疫荧光显示A549细胞E-cadherin表达随时间延长逐渐减弱,而vimentin表达逐渐增强。细胞划痕试验显示,bFGF干预后细胞迁移能力提高。Transwell小室试验显示,bFGF干预后细胞侵袭能力提高。结论:bFGF在体外诱导肺腺癌细胞系A549细胞发生上皮间质转化,上皮间质转化是肺癌侵袭转移的重要机制之一。     

siRNA表达载体稳定沉默肺癌A549细胞MEKK3基因的细胞株建立

目的构建人MEKK3基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体并建立稳定沉默MEKK3基因表达的肺癌A549细胞克隆株。方法设计并合成针对人MEKK3基因4个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,以BamHI及Hindm酶切位点分别克隆入pSilencer4．1-CMVhygro载体,测序鉴定后以脂质体分别转染入A549细胞,Western印迹检测它们对MEKK3表达的抑制,并选择抑制效率最高的表达载体转染入A549细胞,潮霉素筛选后获得含该载体的抗性细胞克隆株,荧光实时定量PCR检测该细胞克隆株中MEKK3表达抑制。结果测序鉴定表明4个MEKK3siRNA表达载体正确无误;Western印迹结果显示对MEKK3的表达有抑制作用,其中pSilencer4．1-MEKK3siRNA2的抑制率达84％;荧光实时定量PCR结果表明,pSilencer4．1-MEKK3siRNA2可稳定沉默MEKK3mRNA的表达,有效率达83％。结论成功地构建了针对人MEKK3基因的siRNA表达载体,并成功地建立了能高效且稳定地沉默MEKK3基因表达的肺癌A549细胞克隆株。     

原子力显微镜研究多西他赛对人肺腺癌A549细胞的作用机制

利用原子力显微镜(AFM)研究了化疗药物多西他赛对肺腺癌细胞A549的作用机制。选取了不同浓度多西他赛作用下的A549细胞,观察和分析了多西他赛对A549细胞形貌信息和生物力学特性的影响。结果表明细胞的峰谷差和超微结构的平均粗糙度随着药物浓度增加而减小,表面粘附力随着药物浓度增加而增大。该结果对AFM可作为一种利用纳米量级分辨率进行药物药效评估的工具进行了佐证。     

TRPM3表达上调通过调控Beclin1的表达促进卵巢癌细胞自噬

目的:探讨瞬时受体电位离子通道3(TRPM3)和Beclin1在卵巢癌中的表达和对卵巢癌细胞自噬的影响。方法:收集6例正常卵巢组织标本和20例卵巢癌组织标本,应用免疫组织化学染色法检测TRPM3和Beclin1在卵巢癌组织中的表达,采用western blotting法检测TRPM3和Beclin1在正常卵巢上皮细胞Moody和卵巢癌细胞Hey、ES-2中的表达差异。用TRPM3-siRNA瞬时转染细胞Hey和ES-2,通过western blotting法检测TRPM3基因沉默情况及Beclin1、p62和LC3的蛋白表达变化。结果:在正常卵巢组织和卵巢癌组织中,TRPM3的阳性表达率分别为33.3%、80.0%(P0.05),而Beclin1的阳性表达率分别为33.3%、65.0%(P0.05)。与正常卵巢上皮细胞Moody相比,卵巢癌细胞Hey和ES-2中TRPM3、Beclin1蛋白表达水平明显较高(P0.05)。沉默TRPM3基因表达的卵巢癌细胞中Beclin1和LC3蛋白表达与对照组相比明显降低,而p62表达升高(P0.05)。结论:卵巢癌组织和细胞中TRPM3蛋白呈高表达,可能通过调控Beclin1促进卵巢癌细胞的自噬。     

二烯丙基二硫上调Beclin1介导白血病K562细胞自噬性死亡的研究

目的：通过二烯丙基二硫诱导白血病K562细胞发生自噬性死亡,探讨其作用机制。方法：40 mg/LDADS作用K562细胞12小时后,透射电镜观察K562细胞超微结构,MDC染色荧光显微镜观察自噬泡及流式细胞仪定量检测自噬率,RT-PCR检测Beclin1mRNA的表达水平。结果：DADS作用后的K562细胞后,透射电镜可观察到胞质内出现大量自噬体;MDC染色荧光显微镜观察显示,K562细胞胞浆中的自噬泡明显增多,而空白组与溶媒组胞浆中的自噬泡很少;流式细胞术定量测定空白对照组、溶媒对照组、DADS药物组自噬率分别为（7.27±5.60）%、（7.10±5.13）%、（27.39±6.51）%（P〈0.05）;空白对照组为0.658±0.007,溶媒对照组为0.671±0.012,两者的Beclin1mRNA的表达强度无明显差异（P〉0.05）,DADS药物组为0.911±0.008,高于对照组（P〈0.05）。结论：二烯丙基二硫可诱导白血病k562细胞发生自噬性死亡,其机制可能与Beclin1的上调有关。     

EGCG对LPS刺激人肺腺癌A549细胞凋亡及CUGBP1蛋白表达的影响

目的：研究表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate,EGCG）对炎性刺激的人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响及与CUGBP1表达的关系。方法：MTT法检测EGCG和LPS刺激A549细胞增殖活性的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡;免疫细胞化学检测EGCG对LPS刺激人肺腺癌A549细胞内CUGBP1蛋白的表达。结果：与对照组相比,LPS体外显著促进A549细胞增殖,其胞核胞质内CUGBP1表达明显增强（P〈0.01）。加入EGCG可拮抗LPS促A549细胞增殖的作用,促进其凋亡,明显抑制LPS刺激的A549细胞内CUGBP1的表达（P〈0.01）。CUGBP1蛋白定量分析可知EGCG和LPS共同孵育A549细胞4h、24h时,细胞中的CUGBP1蛋白表达量较单纯LPS作用时降低。但EGCG和LPS共同孵育A549细胞24h,A549细胞中胞核CUGBP1蛋白表达量（1210.565±3.46）较4h时胞核CUGBP1蛋白表达量（67.344±3.68）高,差异有统计学意义（t=927.164,P〈0.001）。结论：EGCG可能通过干扰CUGBP1基因的表达抑制炎症刺激人肺腺癌细胞A549的增殖,促进其凋亡。