不同剂量柚皮素对FADU细胞生长的调节及机制研究

目的:探究不同剂量柚皮素(naringenin)对人下咽癌FADU细胞的作用及其相关机制。方法:以不同剂量(0、100、200、400、800μg/m L)柚皮素对FADU细胞进行处理,倒置显微镜观察细胞形态学变化;cck-8法检测药物作用后不同时间(24、48、72 h)FADU细胞增殖的变化;流式细胞仪检测柚皮素作用48 h细胞凋亡的变化;采用Transwell趋化小室体外侵袭实验测定48 h后细胞的侵袭能力的变化;蛋白免疫印迹法检测48 h后细胞内PI3K/AKT信号通路凋亡相关蛋白表达的影响。结果:cck-8法检测发现柚皮素抑制FADU细胞增殖作用明显,呈浓度和时间依赖性;流式细胞结果发现200,400,800μg/m L柚皮素作用48 h后,FADU细胞的凋亡率显著增高,差异有统计学意义(P0.05)。Transwell体外侵袭实验发现,随着柚皮素浓度增加,FADU细胞穿透聚碳酸酯滤膜的能力逐渐减弱,柚皮素有效的抑制FADU细胞在体外的侵袭能力,呈浓度依赖性。同时,蛋白免疫印迹法凋亡相关蛋白检测结果表明,FADU细胞内BCL2、P-AKT和P-PI3K蛋白表达均受到明显抑制。结论:柚皮素能有效抑制人下咽癌FADU细胞的增殖、体外侵袭能力,诱导细胞凋亡;其机制与下调PI3K/AKT信号通路凋亡相关蛋白表达有关。     

雷公藤红素抑制成人T细胞白血病细胞增殖及机制

本研究旨在分析雷公藤红素对成人T细胞白血病细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其分子机制。使用不同浓度的雷公藤红素溶液处理多种成人T细胞白血病细胞株,通过四唑盐比色法(MTT)、克隆形成实验检测细胞的增殖情况;Annexin V/PI双染检测细胞凋亡情况;最后通过Western blotting及双荧光素酶报告基因技术探究雷公藤红素抑制成人T细胞白血病细胞生长的调控机制。结果表明雷公藤红素能显著抑制成人T细胞白血病细胞增殖并诱导其凋亡,随着雷公藤红素浓度的增加Bax/Bcl-2蛋白比率明显升高,凋亡途径中Caspase-3/7蛋白也随之被切割活化,同时病毒编码的癌蛋白Tax的表达也明显受到抑制。以上结果表明,雷公藤红素通过调控Bcl-2家族蛋白,激活了Caspase途径诱导细胞凋亡,并通过抑制病毒关键蛋白Tax的表达,从而有效抑制了成人T细胞白血病细胞的增殖。该研究为临床应用雷公藤红素治疗成人T细胞白血病提供了实验依据。     

姜黄素作用PTEN/PI3K/AKT通路诱导食管癌EC109细胞凋亡

目的:研究姜黄素作用食管癌的分子机制。方法:体外培养人食管癌细胞(EC109),15~120μmol/L姜黄素处理后,采用CCK-8法检测姜黄素对细胞的增殖抑制作用,透射电镜观察细胞超微结构,Annexin V-FITC/PI双染激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡,流式细胞术分析15~120μmol/L姜黄素作用EC109细胞后PTEN/PI3K/AKT通路相关蛋白PTEN、AKT、GSK3β和Caspase 3的表达水平。结果:CCK-8检测结果姜黄素能显著抑制EC109细胞的增殖,呈剂量和时间效应关系;透射电镜和激光共聚集显微镜观察发现姜黄素能使EC109细胞发生凋亡;流式细胞仪蛋白水平分析显示姜黄素可增强细胞中PTEN、GSK3β和Caspase 3的表达,抑制AKT的表达。结论:姜黄素抑制EC109细胞的增殖并促进其凋亡的生物学效应与增强PTEN的表达抑制PI3K/AKT信号通路有关。     

大黄素抑制胃癌细胞糖酵解并促进凋亡

目的:探讨大黄素对人胃癌BGC-823细胞凋亡及糖酵解的影响。方法:采用不同浓度大黄素(30μmol/L、90μmol/L、180μmol/L)、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)抑制剂处理人胃癌BGC-823细胞,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞活力,采用试剂盒检测细胞葡萄糖消耗及乳酸水平,western blotting检测细胞己糖激酶Ⅱ、Bcl-2相关蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)、PI3K、人低氧诱导因子1α(Human Hypoxia-inducible factor 1α,HIF-α)的表达。结果:大黄素能浓度依赖性的抑制BGC-823细胞增殖、葡萄糖消耗,降低乳酸水平;并降低己糖激酶Ⅱ的表达,促进凋亡蛋白Bax表达。PI3K抑制剂可抑制胃癌细胞糖酵解水平,而将大黄素与PI3K抑制剂联合使用后,与单一抑制剂组比,对细胞糖酵解抑制水平进一步加强,大黄素可下调PI3K下游蛋白及HIF-α的表达。结论:大黄素对人胃癌BGC-823细胞的增殖抑制作用其作用机制与调节PI3K途径及HIF-α,并抑制己糖激酶Ⅱ表达降低胃癌细胞糖酵解水平相关。     

雷公藤红素对过氧化氢诱导肌萎缩性侧索硬化症细胞模型氧化损伤的保护作用

本研究旨在探讨在H2O2诱导氧化应激损伤条件下,雷公藤红素对肌萎缩性侧索硬化症细胞模型SOD1G93ANSC34的保护作用及其相关分子机制。用不同剂量H2O2、雷公藤红素处理表达人突变SOD1G93A基因的NSC34细胞24h后,CCK-8试剂检测细胞存活率;丙二醛试剂盒检测细胞内丙二醛水平;real-time PCR检测细胞谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit, GCLC)和谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferases, GST)的表达水平;Western blot检测药物处理后细胞内MEK/ERK和PI3K/Akt细胞信号通路的激活。结果显示,50 nmol/L雷公藤红素预处理可提高H2O2 (10 μmol/L)损伤后SOD1G93ANSC34细胞的生存率,并使细胞内MDA生成减少,逆转H2O2诱导的SOD1G93ANSC34细胞内谷胱甘肽合成相关酶GCLC和GST mRNA表达下调。雷公藤红素处理0.5 h、1 h分别激活SOD1G93ANSC34细胞内MEK/ERK和PI3K/Akt信号通路达峰值,且MEK抑制剂PD98059和Akt抑制剂MK2206可阻断雷公藤红素对相关信号通路的激活效应。PD98059、MK2206预处理30 min均抑制雷公藤红素引起的SOD1G93ANSC34细胞内GCLC和GST上调。以上研究结果提示,雷公藤红素对肌萎缩性侧索硬化症细胞模型SOD1G93ANSC34细胞有抗氧化应激的保护作用,该神经保护作用与雷公藤红素调节SOD1G93ANSC34细胞内谷胱甘肽合成相关酶类生成有关,细胞内MEK/ERK和PI3K/Akt信号通路参与此调节过程。     

甘草次酸对甲状腺癌细胞SW579 凋亡的影响及其机制*

目的:研究甘草次酸对甲状腺癌细胞SW579凋亡的影响及其可能的机制。方法:甲状腺癌细胞SW579分成4组,每组设置5个复孔,对照组为含10%胎牛血清的DMEM培养基;低浓度甘草次酸组为含浓度50 μmol/L+ 10%胎牛血清的DMEM培养基;中浓度甘草次酸组为含浓度100 μmol/L+ 10%胎牛血清的DMEM培养基;高浓度甘草次酸组为含浓度200 μmol/L+ 10%胎牛血清的DMEM培养基;各组在5%的二氧化碳培养箱中孵育24 h和48 h后,通过Annexin V / PI双标记流式细胞术检测甲状腺癌细胞SW579的凋亡比例,蛋白质印迹法检测检PI3K、AKT1、p-AKT蛋白的表达。结果:与对照组比较,孵育24 h及48 h后,50 μmol/L甘草次酸组凋亡细胞比例有所升高,AKT1、p-AKT、PI3K蛋白的相对表达量变化不明显,均无显著性差异(P＞0.05);100 μmol/L和200 μmol/L甘草次酸组的凋亡细胞比例均显著升高,AKT1、p-AKT蛋白的相对表达量均明显降低 (P＜0.05)。结论:100 μmol/L和200 μmol/L的甘草次酸可通过抑制AKT蛋白的表达促进甲状腺癌细胞SW579 凋亡。     

基于PI3K/AKT/mTOR信号通路探讨二甲双胍对结肠癌HCT116细胞的作用

摘要 目的：研究二甲双胍通过磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶 B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路对结肠癌HCT116 细胞的作用。方法：体外培养结肠癌HCT116细胞,分别加入二甲双胍(20,40,80 μmol/L)处理HCT116细胞48 h,另设对照组。MTT法检测各组细胞增殖能力。Transwell实验检测各组细胞侵袭能力的变化。Annexin-FITC/PI 双染法分别检测各组处理48 h后细胞凋亡情况。免疫印迹法检测48 h后PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表达水平。结果：相比于对照组,二甲双胍20,40,80 μmol/L各处理组对HCT116细胞的增殖具有明显的抑制作用,且呈浓度依赖效应,差异具有统计学意义(P＜0.05)。与对照组比较,二甲双胍20,40,80 μmol/L各处理组细胞凋亡率明显较高,且呈浓度依赖效应,差异具有统计学意义(P＜0.05)。相比于对照组,二甲双胍20,40,80 μmol/L各处理组HCT116细胞侵袭能力明显减弱,且呈浓度依赖效应,差异具有统计学意义(P <0.05)。与对照组比较,二甲双胍20,40,80 μmol/L各处理组Bax蛋白表达水平明显升高,而Bcl-2、p-Akt及p-mTOR蛋白表达水平明显降低,且呈浓度依赖效应,差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论：二甲双胍在体外可抑制人结肠癌HCT-116细胞的增殖,促进其凋亡,抑制其侵袭能力,其抗肿瘤机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路激活相关。     

吴茱萸碱抑制人结肠癌HCT-116细胞体外增殖和迁移

吴茱萸碱(Evodiamine,Evo)对人结肠癌HCT-116细胞体外增殖和转移的影响及其可能机制初探。体外培养人结肠癌HCT-116细胞株,加入Evo1.5μmol/L、3μmol/L、6μmol/L、12μmol/L、24μmol/L、48μmol/L、96μmol/L继续培养48 h,CCK-8法检测Evo对HCT-116细胞生存活性的影响;Transwell法和划痕法检测STF-118804、Evo对HCT-116细胞体外迁移的影响;RT-PCR和Western blotting检测不同浓度的Evo(0μmol/L,1.5μmol/L,3μmol/L,6μmol/L)和STF-118804(10μg/L)诱导HCT-116细胞48 h后,细胞中SIRT1、NF-кB、MMP-9蛋白的表达情况。不同浓度的Evo(1.5μmol/L,3μmol/L,6μmol/L,12μmol/L,24μmol/L,48μmol/L,96μmol/L)作用于HCT-116细胞48 h后,细胞的增殖均受到明显抑制(p0.05),且在一定范围内呈浓度依赖性;且Evo能抑制HCT-116细胞的迁移。Evo可明显下调HCT-116细胞内SIRT1、MMP-9 m RNA和蛋白的表达,上调NF-кB m RNA和蛋白的表达。体外实验表明,Evo对结肠癌细胞增殖和迁移的抑制作用是通过抑制SIRT1的表达,激活NF-кB信号通路,进而抑制MMP-9来实现的。     

雷公藤红素对抗过氧化氢诱导肌萎缩性侧索硬化症细胞模型氧化损伤的保护作用

本研究旨在探讨在H_2O_2诱导氧化应激损伤条件下,雷公藤红素对肌萎缩性侧索硬化症细胞模型SOD1~(G93A)NSC34的保护作用及其相关分子机制。用不同剂量H_2O_2、雷公藤红素处理表达人突变SOD1~(G93A)基因的NSC34细胞24 h后,CCK-8试剂检测细胞存活率;丙二醛试剂盒检测细胞内丙二醛水平;real-time PCR检测细胞谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamatecysteine ligase catalytic subunit,GCLC)和谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferases,GST)的表达水平;Western blot检测药物处理后细胞内MEK/ERK和PI3K/Akt细胞信号通路的激活。结果显示,50 nmol/L雷公藤红素预处理可提高H_2O_2(10μmol/L)损伤后SOD1~(G93A)NSC34细胞的生存率,并使细胞内MDA生成减少,逆转H_2O_2诱导的SOD1~(G93A)NSC34细胞内谷胱甘肽合成相关酶GCLC和GST mRNA表达下调。雷公藤红素处理0.5 h、1 h分别激活SOD1~(G93A)NSC34细胞内MEK/ERK和PI3K/Akt信号通路达峰值,且MEK抑制剂PD98059和Akt抑制剂MK2206可阻断雷公藤红素对相关信号通路的激活效应。PD98059、MK2206预处理30 min均抑制雷公藤红素引起的SOD1~(G93A)NSC34细胞内GCLC和GST上调。以上研究结果提示,雷公藤红素对肌萎缩性侧索硬化症细胞模型SOD1~(G93A)NSC34细胞有抗氧化应激的保护作用,该神经保护作用与雷公藤红素调节SOD1~(G93A)NSC34细胞内谷胱甘肽合成相关酶类生成有关,细胞内MEK/ERK和PI3K/Akt信号通路参与此调节过程。     

姜黄素类似物EF24诱导A549细胞自噬及凋亡关系的研究

从细胞自噬及凋亡关系角度探讨姜黄素类似物EF24对人肺腺癌细胞（A549）的杀伤机理。选用不同浓度的EF24对体外培养的A549处理,采用MTT方法检查细胞存活率,吖啶橙染色观察细胞形态,蛋白质免疫印迹（Western blot）方法检测与细胞自噬及凋亡相关蛋白的表达及对AMPK-mTOR-S6K信号通路的影响。结果显示,EF24作用24 h的IC50为8.5μmol/L,对A549细胞生长抑制作用优于姜黄素,而接近顺铂。自噬及凋亡蛋白检测显示,在4μmol/L、8μmol/L时A549细胞以自噬为主,在16μmol/L时以凋亡为主;加入100 nmol/L自噬抑制剂渥曼青霉素（wortmannin）后,细胞存活率同比升高。同时还发现,随着EF24浓度的增加,细胞内AMPK-Thr172磷酸化水平上升,mTOR-Ser2481、S6K-Thr389磷酸化水平的下调。由此可见,EF24可通过AMPK的激活下调mTOR-S6K途径抑制细胞生长,在EF24浓度4~8μmol/L范围内,自噬对凋亡起到促进作用。     

氧化应激诱导内皮细胞凋亡microRNA表达改变的研究

目的:研究氧化应激诱导的内皮细胞micro RNA的表达变化。方法:ECM(Endothelial Cell Medium)培养人脐静脉内皮细胞,利用不同浓度双氧水(0μmol/L,200μmol/L,500μmol/L,800μmol/L)刺激24小时后应用流式细胞术检测其凋亡水平。提取细胞总RNA,利用实时定量PCR(Quantitive real-time PCR;q RT-PCR)检测micro RNA表达量变化,并利用生物信息学软件预测可能的靶基因。结果:加入不同浓度双氧水处理24 h后的内皮细胞总凋亡率均显著高于对照组,200μmol/L、500μmol/L和800μmol/L组的凋亡率分别为(13.31%vs 4.75%,35.9%vs 4.75%,89.75%vs 4.75%,P0.01)。200μmol/L的双氧水处理内皮细胞后,micro RNA的表达出现了明显的改变。其中mi R-92a、mi R-126的表达明显下调(P0.05),mi R-181a、mi R-217、mi R-34a和mi R-320的表达明显上调(P0.05)。靶基因预测显示mi R-320、mi R-92a可能调控多个和内皮细胞凋亡相关的基因表达。结论:在氧化应激诱导的内皮细胞凋亡中,mi RNA表达发生改变并可能参与调控内皮细胞功能。     

Effects of astragalus polysaccharide on apoptosis of myocardial microvascular endothelial cells in rats undergoing hypoxia/reoxygenation by mediation of the PI3K/Akt/eNOS signaling pathway

The study explores the effect of astragalus polysaccharide (APS) mediating P13K/Akt/eNOS signaling pathway on apoptosis of myocardial microvascular endothelial cells (MMECs) in hypoxia/reoxygenation (H/R). MMECs were classified into blank, H/R, H/R + 25 mg/L APS, H/R + 50 mg/L APS, H/R + 100 mg/L APS, H/R + LY, and HR + 100 mg/L APS + LY groups. Cell viability was detected using MTT assay and apoptotic cell morphological changes by Hoechst staining. NO content, cell cycle and apoptosis, PI3K/Akt/eNOS signaling pathway proteins were detected using nitrate reductase assay, flow cytometry and Western blotting. An increased cell survival rate, NO content and expression of PI3K/Akt/eNOS signaling pathway associated proteins, and a decreased apoptosis rate was observed in the H/R + 50 mg/L APS and H/R + 100 mg/L APS groups compared with the H/R and H/R + 25 mg/L APS groups. Compared with the H/R + 50 mg/L APS group, the apoptosis rate decreased, whereas the cell survival rate, NO content and expression of PI3K/Akt/eNOS signaling pathway associated proteins increased in the H/R + 100 mg/L APS group. The H/R + LY and HR + 100 mg/L APS + LY groups followed opposite trends. In comparison to the HR + 100 mg/L APS group, the apoptosis rate in the H/R + LY and HR + 100 mg/L APS + LY groups increased, and the cell survival rate, NO content and expression of PI3K/Akt/eNOS signaling pathway associated proteins decreased. Collectively, APS improves the damage caused by H/P by mediating PI3K/Akt/eNOS signaling pathway.     

RUNX1对氧糖剥夺诱导PC12细胞凋亡的保护作用研究

目的:研究RUNX1在PC12细胞氧糖剥夺模型中的表达及其对PC12细胞的保护作用,并探讨其相关机制。方法:体外培养PC12细胞并构建氧糖剥夺模型,将细胞分为对照组、氧糖剥夺组、RUNX1 si RNA处理组、si RNA对照处理组(sicontrol)、pc DNA3.1-RUNX1处理组(pc RUNX1)和pc DNA3.1对照处理组(pc DNA 3.1)。q RT-PCR和western blot检测RUNX1、磷酸化Akt(p-Akt)和总Akt(t-Akt)表达水平;MTT法检测细胞存活率;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。结果:与对照组比较,RUNX1在PC12细胞氧糖剥夺模型中表达水平显著升高;沉默RUNX1可下调PC12细胞的存活率,促进细胞的凋亡,有效抑制p-Akt蛋白表达,而过表达RUNX1显著提高细胞存活率,抑制细胞凋亡,并上调p-Akt蛋白表达;此外,PI3K/Akt通路抑制剂LY294002明显抑制RUNX1过表达对细胞存活率的促进作用和对细胞凋亡的抑制作用。结论:RUNX1可通过PI3K/Akt信号通路保护OGD对PC12细胞的损伤作用。     

The class I PI3K/Akt pathway is critical for cancer cell survival in dogs and offers an opportunity for therapeutic intervention

ABSTRACT: BACKGROUND: Using novel small-molecular inhibitors, we explored the feasibility of the class I PI3K/Akt/mTORC1 signaling pathway as a therapeutic target in canine oncology either by using pathway inhibitors alone, in combination or combined with conventional chemotherapeutic drugs in vitro. RESULTS: We demonstrate that growth and survival of the cell lines tested are predominantly dependent on class I PI3K/Akt signaling rather than mTORC1 signaling. In addition, the newly developed inhibitors ZSTK474 and KP372-1 which selectively target pan-class I PI3K and Akt, respectively, and Rapamycin which has been well-established as highly specific mTOR inhibitor, decrease viability of canine cancer cell lines. All inhibitors demonstrated inhibition of phosphorylation of pathway members. Annexin V staining demonstrated that KP372-1 is a potent inducer of apoptosis whereas ZSTK474 and Rapamycin are weaker inducers of apoptosis. Simultaneous inhibition of class I PI3K and mTORC1 by ZSTK474 combined with Rapamycin additively or synergistically reduced cell viability whereas responses to the PI3K pathway inhibitors in combination with conventional drug Doxorubicin were cell linedependent. CONCLUSION: This study highlighted the importance of class I PI3K/Akt axis signaling in canine tumour cells and identifies it as a promising therapeutic target.     

Effect of PI3K gene silencing on growth, migration and related proteins expression of CD40 signal-mediated gastric cancer cells

In this study, we investigate effect of PI3K gene silencing on growth, migration and related proteins expression of CD40 signal-mediated gastric cancer cells. We observed that combination of sCD40L with PI3K siRNA could significantly inhibit AGS cells growth, block cells in G1 phase, and promote tumour cells apoptosis after 24 h treatment. Transwell test showed that numbers of cells per visual field in group PI3K siRNA or group sCD40L (after 24 h PI3K siRNA or sCD40L alone treatment) were fewer than that (32.54 ± 4.22) in control group. Numbers of cells per visual field in (after 24 h combination treatment of PI3K siRNA with sCD40L) were significantly fewer than that in group PI3K siRNA or group sCD40L. Compared with group sCD40L, expression level of Fas protein in group sCD40L + PI3K siRNA was significantly increased. The findings suggest that PI3K siRNA may strengthen CD40-induced specific antitumour effect via blocking PI3K/Akt signal pathway, resisting tumour immunoediting regulated by CD40 signal. Combination of sCD40L and PI3K siRNA is an important mechanism of gastric cancer therapy.     

补骨脂素抑制膀胱癌T24细胞增殖和迁移的作用及机制研究

目的探讨补骨脂素对人膀胱癌T24细胞存活率、细胞周期、细胞凋亡和迁移的影响及其分子机制。 方法分别用细胞培养液、3‰二甲基亚砜（DMSO）和不同浓度（10、30、50、100 μg/mL）补骨脂素处理膀胱癌细胞分成对照组、DMSO组和补骨脂素组,CCK-8检测细胞存活率。流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡。划痕实验检测划痕愈合率。RT-qPCR法检测磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）和蛋白激酶B （AKT） mRNA表达水平、Western blot法检测PI3K和AKT蛋白的表达及磷酸化情况。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。 结果与DMSO组比较,除10 μg/mL补骨脂素作用24 h外,其余浓度补骨脂素作用不同时间的细胞存活率随着补骨脂素浓度增高、作用时间延长而逐渐降低（P < 0.05）。与DMSO组比较,30、100 μg/mL补骨脂素干预24 h后,G1期细胞比例增多,G2/M期比例减少,细胞凋亡率[（9.16±0.97）%、（15.45±1.57）%比（1.02±0.36）%]升高,划痕愈合率[24 h：（45.00±3.44）%、（27.60±2.21）%比（66.10±2.61）%,48 h：（70.00 ± 3.40）%、（45.17±2.44）%比（85.17±3.85）%]降低,PI3K、AKT mRNA表达以及PI3K、AKT蛋白表达水平和磷酸化水平均降低（P均< 0.05）。 结论补骨脂素降低膀胱癌细胞存活率、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡和抑制细胞迁移,其机制可能与下调PI3K、AKT mRNA、蛋白表达及磷酸化水平有关。