原代小鼠肝脏细胞的高效分离纯化与培养*

摘要目的：建立一种能稳定获得高活力和高纯度原代小鼠肝脏细胞的分离、纯化及培养方法。方法：应用改良的Seglen 二步法原 位灌注和机械离心分离肝脏细胞,并用改良的高糖DMEM培养基进行培养。台盼蓝拒染法检测接种时肝脏细胞的存活率,倒置 显微镜动态观察肝脏细胞形态变化,应用免疫荧光技术对肝脏细胞进行Albumin 染色。结果：每只小鼠可获取肝脏细胞的总产量 平均为1.35× 106 / g体重,肝脏细胞存活率＞ 90%。倒置显微镜下观察贴壁前肝细胞直径为35.14 滋m± 4.35 滋m,肝脏细胞在接种 后3 h基本完成贴壁;肝脏细胞接种后24h,所有肝脏细胞均强阳性表达成熟肝脏细胞标志物Albumin,肝细胞纯度＞ 95%。结 论：改良的分离纯化及培养方法能稳定获得高产量、高活率及高纯度的小鼠肝脏细胞。     

原代小鼠肝脏细胞的高效分离纯化与培养

目的：建立一种能稳定获得高活力和高纯度原代小鼠肝脏细胞的分离、纯化及培养方法。方法：应用改良的Seglen 二步法原位灌注和机械离心分离肝脏细胞,并用改良的高糖DMEM培养基进行培养。台盼蓝拒染法检测接种时肝脏细胞的存活率,倒置显微镜动态观察肝脏细胞形态变化,应用免疫荧光技术对肝脏细胞进行Albumin 染色。结果：每只小鼠可获取肝脏细胞的总产量平均为1.35× 10^6 / g体重,肝脏细胞存活率＞ 90%。倒置显微镜下观察贴壁前肝细胞直径为35.14 滋m± 4.35 滋m,肝脏细胞在接种后3 h基本完成贴壁;肝脏细胞接种后24h,所有肝脏细胞均强阳性表达成熟肝脏细胞标志物Albumin,肝细胞纯度＞ 95%。结论：改良的分离纯化及培养方法能稳定获得高产量、高活率及高纯度的小鼠肝脏细胞。     

黄精多糖对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化中PINP和BMP-2表达的影响

探讨黄精多糖(PSP)对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化作用中I型前胶原N端前肽(Procollagen typeⅠN-terminal Propeptide,PINP)和骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)表达的影响。取8周龄雄性BALB/C小鼠1只,无菌操作分离小鼠股骨和胫骨,注射器冲出骨髓制成细胞悬液,传代3次后分为6组用于实验。空白诱导组仅加入等量成骨诱导培养基;阳性对照诱导组加入等量成骨诱导培养基及雌二醇(10-8mol/L);各PSP诱导组:加成骨诱导培养基和各自浓度的PSP(200、300、400、500 mg/mL)。每天在倒置显微镜下观察各组细胞的生长情况及形态变化。倒置相差显微镜镜下观察细胞形态变化。在培养第7 d、第14 d采用ELISA酶联免疫吸附法分别测量细胞PINP和BMP-2的表达量。实验结果显示小鼠骨髓间充质干细胞原代培养呈长梭形,有接触抑制现象,诱导后细胞呈三角形、多角形、不规则形状,细胞生长密集时可重叠生长。各不同浓度PSP诱导组均比非诱导组高表达PINP和BMP-2(P0.01)。表明PSP呈剂量相关性促进体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化,高浓度PSP可显著促进骨髓间充质干细胞骨向分化过程中BMP-2和PINP的表达。     

NRSE/RE-1 dsRNA诱导小鼠胚胎干细胞分化为NSE阳性的神经元样细胞

应用电打孔的方法将化学合成的NRSE/RE-1d sRNA转染小鼠胚胎干细胞,在去除LIF的条件下,直接接种培养,观察其分化情况,并对分化结果进行相关检测.结果显示分化细胞呈明显的神经样改变,免疫荧光显示NSE阳性率为（82.3±8.1）%.说明通过转染NRSE/RE-1d sRNA能有效地诱导小鼠胚胎干细胞向神经元细胞分化.     

人胚胎干细胞分化为神经干细胞诱导方法的对比研究

目的探讨人胚胎干细胞分化为神经干细胞过程中,经拟胚体（embryonic body,EB）法和直接分化法的不同效率。方法人胚胎干细胞常规培养消化后,分为两组：A组,经EB法分化;B组,添加noggin和ITSFn直接分化法。倒置相差显微镜观察细胞形态变化,RT-PCR检测细胞各阶段标志物,免疫荧光及流式细胞仪观察两组细胞Nestin阳性细胞率。神经干细胞继续分化,免疫荧光、RT-PCR法检测MAP2、GFAP表达。结果RT-PCR检测到OCT4、nestin表达。B组nestin阳性细胞率明显高于A组,差异有统计学意义（P〈0.01）,且诱导周期短于A组。神经干细胞继续分化,得到不同数量的神经元和胶质细胞,MAP2、GFAP分别阳性。结论在体外采用定向分化诱导,人胚胎干细胞不经EB,可直接定向分化为神经干细胞,且诱导效率比EB法高。因此直接分化法是一种经济实用的诱导方法。     

小鼠表皮干细胞的分离与培养

目的:探讨体外分离和培养小鼠表皮干细胞和分析表皮干细胞克隆形成能力的方法。方法:采用中性蛋白酶和胰酶消化新生小鼠表皮基底层细胞,将细胞直接接种在细胞瓶中,在无滋养层条件下培育;利用表皮干细胞标记物K15和α6整联蛋白进行免疫荧光鉴定;以小鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层与成年小鼠角质细胞共培养,进而分析表皮干细胞的克隆形成能力。结果:新生小鼠表皮干细胞克隆在培养2～3 d后开始形成,细胞核质较小,细胞呈小而圆的形态特征;传代后的细胞可以被K15和α6整联蛋白特异性标记。结论:利用该方法能够实现对小鼠表皮干细胞的体外培养和传代。     

过表达细胞周期蛋白的Dl对成熟表皮细胞去分化为表皮干细胞的作用

目的：观察过表达细胞周期蛋白D1（CCND1）对成熟表皮细胞去分化为表皮干细胞的调控作用。方法：构建携带CCND1基因的真核表达载体PEGFP-N1-CCND1,将PEGFP-N1-CCND1转染人成熟表皮细胞,5 d后,倒置显微镜下观察细胞形态;细胞计数法观察细胞的增殖情况;免疫荧光法检测表皮干细胞标志抗原β1整合素和成熟表皮细胞标志抗原CK10的表达变化。结果：转染PEGFP-N1-CCND1后,细胞体积变小,核浆比例增大;细胞增殖较快,细胞数量比对照组增加了4倍（P<0.01）;表型检测结果显示,转染PEGFP-N1-CCND1组,表达干细胞标志性蛋白β1整合素表达阳性,成熟表皮细胞标志性蛋白CK10表达阴性,而转染空载体组则相反。结论：CCND1过表达能够诱导成熟表皮细胞去分化为表皮干细胞。     

山羊角膜缘干细胞荧光蛋白(Venus)细胞株的建立及角膜上皮植片构建

角膜缘干细胞是角膜上皮更新与修复的来源,角膜上皮受损严重常会导致角膜盲。尽管近几年通过角膜缘干细胞移植术(LSCT)治愈角膜上皮受损的临床应用已被推广,但是对于角膜缘干细胞移植受损机体后的修复机理并不明确。为了实现角膜缘干细胞移植后的活体追踪,使用G418筛选标记有Venus荧光蛋白的角膜缘干细胞株(GLSC-V),并以其为种子细胞接种于去上皮羊膜上,体外培养21d构建成荧光角膜上皮植片。荧光倒置显微镜下观察GLSC-V的细胞质和细胞核均有绿色荧光表达,在体外培养荧光至少持续3个月。免疫荧光检测GLSC-V细胞P63、Integrinβ1均呈阳性表达,对GLSC-V细胞及未转染的GLSCs进行半定量RT-PCR检测显示,两组细胞皆未表达终末分化角膜上皮细胞基因k3、k12,GLSC-V中p63及pcna较未转染组细胞略上调,venus强表达。经HE染色观察构建的人工角膜组织由5～6层上皮细胞组成,组织中上表皮细胞个数少、体积大且呈扁平状;基底部细胞密集、体积小且成立方状。经免疫荧光检测仅组织基底部最基层细胞表达P63,上表皮细胞不表达。该人工角膜与正常角膜上皮组织结构特性相似,可用于移植,为研究角膜缘干细胞修复严重受损角膜上皮机理奠定基础。     

Nucleostemin在大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导分化中的研究

目的探讨Nucleostemin（NS）在大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导分化中的机制及作用。方法取4～6周龄雄性SD大鼠两侧股骨、胫骨骨髓基质细胞,原代及传代培养。取第3代骨髓间充质干细胞分别用普通和矿化培养基培养,通过相差倒置显微镜观察细胞生长、MTT法检测细胞增殖、碱性磷酸酶和茜素红钙染色了解成骨活性。免疫组化SABC法及免疫荧光法检测NS在细胞中的表达情况,比较NS分别在普通培养基和成骨细胞诱导培养基作用下的表达情况。结果大鼠骨髓间充质干细胞在矿化培养基诱导下其NS的表达较普通培养基培养下的表达明显减弱,且呈时间依赖性衰减。成骨细胞的NS表达则为阴性。在矿化液作用下,骨髓间充质干细胞可诱导为成骨细胞。MTT显示矿化液培养细胞生长潜伏期长,对数生长期较对照组延长。结论NS作为核干细胞因子,在干细胞中和某些肿瘤细胞中表达丰富。细胞分化后,其表达明显减少。因此,NS很可能作为大鼠基质干细胞是否具有潜在分化能力的标志性因子。     

体外诱导小鼠脂肪来源干细胞向内皮细胞分化的实验研究

目的：探索体外小鼠脂肪来源干细胞（Adipose—derivedstemcells,ASCs）诱导分化为内皮细胞（endothelialprogenitorcells,EPCs）的可行性。方法：利用I型胶原酶消化法和传代培养纯化法从小鼠脂肪组织中分离、培养及扩增ASCs,通过流式细胞仪检测ASCs特异性表面抗原CD29和CD44、CD105的表达;取第2代ASCs进行内皮诱导：即BD基质胶包被＋内皮细胞生长诱导培养基（M199＋10％血清＋10ng／mL血管内皮细胞生长因子VEGF＋10ng／ml碱性生长因子bFGF）。诱导两周左右,倒置显微镜观察诱导前后细胞的一般形态学特征;同时通过成血管实验观察成管腔能力;通过免疫荧光鉴定CD31表型分子的表达。结果：成功培养小鼠ASCs;CD29、CD44、CD90、呈阳性表达,而CD31、CD34、CD45呈阴性表达;诱导后的细胞形态呈三角形或多边形;HE染色观察可见明显的管腔样结构;免疫荧光法CD31表达阳性;MTT法成功记录EPCs增殖生长曲线。结论：成功的诱导小鼠脂肪来源干细胞分化为血管内皮细胞,为后续体内移植实验提供理论基础,同时也为临床受损组织或器官的重建再生提供实验基础。     

Selection with two alleles and complete dominance

For a plant selection model with frequency-independent viabilities, fertilities and selfing rates, it is shown that apart from global fixation, for certain parameter combinations a protected polymorphism and facultative fixation (either allele may become fixed according to initial frequencies) may both occur. Facultative fixation requires different selling rates for the dominant and recessive type. Protection of the polymorphism requires resource allocation for male and female function. In this connection the problem of purely genetically caused population extinction is discussed.
For general frequency dependence and regular segregation, the chances for establishment of a completely recessive gene are compared to those of a completely dominant gene. It is proven that the process of establishment of the recessive gene, despite a fitness advantage, may be considerably endangered by drift effects if random mating prevails. The recessive gene may reach the same effectivity in establishment as a dominant gene, only if the recessive homozygote mates exclusively with its own type during the period of establishment.     

杆状病毒出芽病毒粒子膜融合蛋白的研究进展

杆状病毒是一类感染节肢动物的病原微生物,其基因组为双链环状DNA,大小为80～180kb.     

Inception of the Modern Public Health System in China and Perspectives for Effective Control of Emerging Infectious Diseases: In Commemoration of the 140th Anniversary of the Birth of the Plague Fighter Dr. Wu Lien-Teh

In this article, we systematically review Dr. Wu Lien-Teh's academic achievements and outstanding contributions in the prevention and control of the plague epidemic in northeast China and introduce the development of the earliest public health epidemic prevention system in China in order to commemorate the 140th anniversary of Dr. Wu Lien-Teh's birth. We hope that this article will provide insights into the effective prevention and control of emerging infectious diseases as well as the current worldwide pandemic of COVID-19, facilitating the improvement and development of public health systems in China and around the globe.