猕猴桃6个LOX基因家族成员实时定量PCR引物特异性的检测与应用

从基因家族成员的视角开展基因表达研究是阐明基因功能的重要组成内容,实时定量PCR（QPCR）技术是分析基因表达的有效手段.以猕猴桃脂氧合酶（LOX）基因家族6个成员为对象,分析了引物特异性的检测方法.该方法整合了熔点曲线分析、琼脂糖电泳、交叉PCR扩增和PCR产物测序等分析手段,有效消除其他成员的交叉扩增干扰,为利用QPCR检测基因家族成员表达提供了特异、准确与可行的途径.     

红苞凤梨实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选

为筛选表达稳定的内参基因,以红苞凤梨(Ananas comosus var.bracteatus)不同发育时期的全绿、全白苗为材料,对10个组成型表达基因EF1、UBQ、ACT、GADPH、Histone、TUA、TUB、18S、elf-5A、α-tubulin进行筛选,并分析PetF基因的表达模式。结果表明,10个候选内参基因在红苞凤梨全绿、全白苗不同生长阶段中的表达稳定性不同。红苞凤梨不同生长时期以Histone和α-tubulin为最适内参基因,而全绿苗和全白苗的对比分析以18S、EF1和α-tubulin为最理想的内参组合。PetF基因在红苞凤梨发育过程及绿、白苗对比分析中的表达水平变化趋势一致,因此,所选的内参基因是合适的。     

绿豆象实时荧光定量PCR内参基因的筛选

绿豆象Callosobruchus chinensis是一种世界性分布的害虫,对绿豆、豇豆等豆科作物的产量与品质造成严重影响。本研究旨在筛选出适合分析绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中稳定表达的内参基因,根据绿豆象转录组测序以及相关参考文献报道,筛选出8个候选内参基因(β-Actin、β-Tubulin、α-Tubulin、AK、GAPDH、RPL40、Hsc70、eEF1-α),采用qRT-PCR技术分析在绿豆象不同发育阶段(幼虫、蛹、雌雄成虫)以及成虫不同组织中的(触角、头、腹、足、翅)各候选基因的表达量;利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和在线网站RefFinder并结合△Ct值评估8个候选内参基因的稳定性。结果显示,在绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中,各候选内参基因Ct值和跨度均不同,表明各候选内参基因表达量存在差异。不同算法综合比较内参基因稳定性以及GeNorm软件最佳内参基因数目的分析显示,在绿豆象虫不同发育阶段中推荐采用β-Act、β-Tub作为内参基因,而在绿豆象成虫不同组织中推荐采用β-Tub、α-Tub作为内参基因,这有利于在绿豆象的...     

茶树实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR分析（qRT-PCR）准确性的先决条件。该文以茶树（Camellia sinensis）芽、叶、幼根、嫩茎、花瓣、种子和愈伤组织为材料,应用实时荧光定量PCR技术,分析了18S rRNA、GAPDH、β-actin和α-tubulin4个常用内参基因在茶树不同器官组织中的表达情况。经GeNorm和NormFinder软件分析发现,当利用荧光定量PCR分析比较茶树不同器官组织中的基因表达差异时,可选择β-actin作为校正内参基因;而比较不同成熟度的叶片和愈伤组织时,可以选择GAPDH作为校正内参基因。     

茶树实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR分析(qRT-PCR)准确性的先决条件。该文以茶树(Camellia sinensis) 芽、叶、幼根、嫩茎、花瓣、种子和愈伤组织为材料, 应用实时荧光定量PCR技术, 分析了18S rRNA、GAPDH、β-actin和α-tubulin 4个常用内参基因在茶树不同器官组织中的表达情况。经GeNorm和NormFinder软件分析发现, 当利用荧光定量PCR分析比较茶树不同器官组织中的基因表达差异时, 可选择β-actin作为校正内参基因; 而比较不同成熟度的叶片和愈伤组织时, 可以选择GAPDH作为校正内参基因。     

黄梁木实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择

为筛选黄梁木(Neolamarckia cadamba)实时定量PCR最佳内参基因, 该研究以黄梁木的根、芽、叶、花、果、皮及形成层为材料, 利用RT-qPCR技术对ACT、CAC、CYP和EF1α等21个管家基因家族43个候选内参基因进行表达量分析, 并利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行内参基因稳定性分析。geNorm的分析结果显示, UPL基因的稳定性最高(M=0.443), UBQ基因的稳定性最低(M=2.859); NormFinder的分析结果显示, UPL基因的稳定性最高(E=0.223), UBQ基因的稳定性最低(M=4.759); BestKeeper分析显示, UPL基因的标准偏差(SD=0.513)最低。研究结果表明, UPL基因作为内参基因稳定性最高, UBQ基因的稳定性最低。因此可以选择UPL基因作为黄梁木不同组织中RT-qPCR定量分析的内参基因。     

五龄飞蝗不同发育时间实时定量PCR内参基因的筛选

【目的】筛选5龄飞蝗不同发育时间的最适内参基因,为相关研究提供基础数据。【方法】本文选取β-肌动蛋白(β-actin)、延长因子(EF-1α)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、核糖体蛋白49(RP49)、α-微管蛋白(α-Tubulin)和18S核糖体RNA(18S rRNA)基因作为候选内参基因,运用实时定量PCR(qPCR)方法研究各基因在5龄飞蝗不同发育时间的相对表达量,用geNorm与Normfmder软件分析这6个基因表达稳定性。【结果】geNorm分析结果显示6个内参基因表达稳定度M值顺序为:β-actin(0.3720)>RP49(0.3750)>α-Tubulin(0.4030)>18S rRNA(0.4270)>EF-1α(0.4970)>GAPDH(0.6040)。M值越小表示基因表达稳定度越高,同时geNorm软件以标准化因子配对差异值(Pairwise variations)0.15默认为取舍值,由于V2/3=0.098<0.15,所以最适内参基因数目为2个。运用NormFinder软件也得出相似的结果。【结论】β-actin与RP49为5龄飞蝗不同发育时间的最适内参基因。     

毛竹实时荧光定量PCR内参基因的筛选及成花基因PheTFL1表达分析

通过qRT-PCR对毛竹相关成花基因PheTFL1的表达进行研究,为毛竹开花机理的研究提供理论依据.从毛竹UBC18、PP2A和EF1α等9个候选内参基因中筛选出在叶、幼嫩花序、花序轴、枝、竹青等11个组织器官中都稳定表达的PP2A用于毛竹PheTFL1基因qRT-PCR结果的校正.结果显示:PheTFL1基因在开花竹叶、枝和竹青中低丰度表达,与未开花竹差异不显著,但在花和花序轴中高丰度表达;在实生苗叶和根中高丰度表达,在实生苗茎中低丰度表达.PheTFL1基因在具有分生能力的幼嫩组织中高丰度表达,说明其不仅参与花发育的调控,还参与了分生组织生长的调控.     

Bt毒素诱导下小菜蛾实时定量PCR 内参基因的筛选

【目的】筛选出Bt毒素诱导后的小菜蛾Plutella xylostella (L.)的实时定量PCR最适内参基因。【方法】选取核糖体18S rRNA (18S rRNA)、 肌动蛋白（ACTB）、 延伸因子（EF1）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、 核糖体蛋白L32 (RPL32)、 核糖体蛋白S13 （RPS13）、 核糖体蛋白S20 （RPS20）和β-微管蛋白(TUB)基因作为候选内参基因, 以geNorm、 Normfinder和BestKeeper软件分析这8个基因在Bt毒素诱导后的小菜蛾不同品系中肠组织中的表达稳定性。并应用筛选出来的内参基因分析小菜蛾氨肽酶2（aminopeptidase N2, APN2）基因的表达水平。【结果】geNorm软件以RPS13和EF1为最稳定内参基因, NormFinder和BestKeeper软件均以RPS13和RPL32为最稳定基因。使用3种不同内参基因分析Bt毒素诱导后的小菜蛾Bt抗性和敏感品系中ANP2表达水平时, 新的内参基因EF1和传统内参基因RPL32表现了良好的稳定性, 二者作为标准化因子, ANP2表达量结果基本一致, 而使用18S rRNA作为内参基因, 却导致部分表达量分析结果有所误差。【结论】筛选出PRS13,RPL32和EF1可以作为小菜蛾某些试验条件下的内参基因, 对小菜蛾基因表达研究奠定了一定基础, 也对其他昆虫内参基因的筛选具有参考价值。     

实时荧光定量PCR中内参基因的选择

实时荧光定量PCR技术是分析基因表达谱的一种常用方法,在分析中选择合适的内参基因对数据进行校正是得到可信数据的关键。以Lactobacillus helveticus H9为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术,评价了5种常用内参基因ldh、recA、rpoB、gapdh和16S rRNA的表达稳定性,通过geNorm和NormFinder程序进行数据分析,结果表明5个候选内参基因在菌株不同的发酵时间点表达相对都较为稳定,结合两种分析得到其中最为稳定的基因是ldh,适合于用作后续实时荧光定量PCR试验中的内参基因。     

Primer Spanner:一个高效的定点突变PCR引物设计在线工具

基于PCR的实验策略在生物工程研究中具有广泛应用,如定点突变(site-directed mutagenesis,SDM),DNA拼接和载体构建。引物设计是这类实验技术中的关键一环,因其直接影响扩增效率和PCR产物的拼合。在嵌合式引物设计方法(一对突变引物在5'端具有互补序列)的基础上,开发了一个在线工具Primer Spanner(PS),可简单高效获得设计定点突变引物。PS可应用于单碱基或连续多碱基替换、插入、敲除等突变形式。通过大量突变实验与测序验证,结果表明该工具设计的引物进行的定点突变效果良好1)。     

实时荧光定量PCR检测凡纳滨对虾proPO基因标准曲线构建

酚氧化酶原(proPO)系统属于一种酶联级系统,在凡纳滨对虾抵抗病原菌侵袭过程中具有重要作用。Real-time PCR检测技术已经成为国际上检测基因表达通用的方法,能对低丰度mRNA水平进行定量,可在体外对细胞活性进行评估,选择该方法进行外界环境因子胁迫下的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)组织proPO表达分析。在实时荧光定量PCR中,标准曲线法是最为简单、准确的定量方法。为了快速、准确的定量proPO基因在逆境下的表达水平,构建了正确、可靠的proPO基因表达标准品质粒和标准曲线。结果表明,该法所构建的标准曲线能够保证数据的精确性,满足实时荧光定量试验的要求,完全可以作为proPO基因荧光定量检测的参照标准。     

鳕鱼成分的实时荧光PCR检测方法

研究建立了鳕鱼成分的实时荧光PCR检测方法。依据鳕鱼的16S rRNA基因序列设计一对PCR引物及探针,对12种鳕鱼样品和71种非鳕鱼动植物样品进行实时荧光PCR检测,结果显示,只有12种鳕鱼样品产生荧光信号,其他非鳕鱼样品均不产生荧光信号,实验表明此方法具有特异性,其检测限为0.01 ng/μl鳕鱼DNA和0.01%鳕鱼肉粉。对市售的鳕鱼样品进行实际样品检测,均能很好地检出鳕鱼成分。此法特异性强,灵敏度高,可作为鳕鱼成分鉴定的检测方法。     

Real-time PCR: duplexing without optimization

Real-time PCR applications generally require determination of the threshold cycle of a gene of interest in parallel with an endogenous control. In standard situations, the gene-specific and control reactions are run as separate samples (singleplex). In contrast, duplex approaches combine both reactions within a single well, thereby saving time, cost, and material. However, establishing duplex reactions usually requires laborious optimization justifiable only for the analysis of large sample series. Hence, in research settings, singleplex approaches are used most commonly. To establish conditions for duplexing without the need of optimization, we tested the performance of 40 premade TaqMan gene expression assays in duplex reactions with an endogenous control using three different polymerase mixes. The results were compared with singleplex reactions. Duplexing results obtained with one of the multiplex polymerase mixes correlated extremely well (r(2)=0.95) with the singleplex reference. The findings of our study demonstrate that the combination of this polymerase mix and premade gene expression assays will yield reliable and reproducible results in duplex approaches without preceding optimization.     

实时荧光定量PCR在固氮酶基因检测中的应用

实时荧光定量PCR是近年发展起来的一种新的实时定量检测特定核酸技术,它是核酸探针技术、荧光共振能量传递技术和PCR技术的有机结合。与常规PCR相比,它具有特异性更强、能有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,扩大了PCR的应用范围。概述实时荧光定量PCR技术在固氮酶(nifH)基因检测中的应用与研究进展,并探讨该技术的发展和应用前景。     

引物间同源性和裂口对PCR扩增的影响

采用ＰＣ／Ｇｅｎｅ软件对能扩增出特异睡不能扩增的ＰＣＲ引物进行同源性比较,同源间“裂口（ｇａｐｓ）”差数的统计,得出源率小于或等于３５％,“裂口”差数大于或等于３,是获得理想ＰＣＲ扩增效果的关键参数之一的结论,为引物设计提供了一条直观的依据。     

转基因烟草荧光定量检测方法研究

依据实时定量PCR原理,参照35S启动子、NOS终止子、GUS基因和NPTII基因序列设计TaqMan引物和荧光标记探针。采用美国MJ公司OpticonTM2荧光定量PCR检测系统对烤后烟叶进行转基因定量检测技术研究,从中筛选出扩增效率高,灵敏度好的PCR引物和探针序列,同时通过对扩增体系,扩增条件的梯度实验,优化出荧光定量检测的最佳反应体系和反应条件,从而建立了转基因烟草定量检测方法。该方法经验证其检测灵敏度达到0.05％。在2003年6月参加CORESTA(国际烟草科研与合作中心)组织的国际烟草转基因定量检测合作试验中,该优化转基因烟草定量检测技术获得了较好成绩,对盲检样品检测结果评价(Z-score)列国际12家实验室之首,证明此法灵敏度高、稳定性好。     

实时荧光PCR检测水产品中副溶血性弧菌

目的探索副溶血性弧菌快速检测法,应用于日常监测及食物中毒的快速查源。方法用副溶血性弧菌实时荧光试剂盒对水产品样本进行检验,以副溶血性弧菌toxR基因为靶序列,设计1对引物和探针,采用热裂解法提取DNA。结果实时荧光PCR从42份水产品样品的增菌液中检出13份样品副溶血性弧菌阳性,与传统培养法相比一致性极好（K=0.943,K〉0.75）。结论实时荧光PCR方法在副溶血性弧菌的检验方面较传统方法具有快速、灵敏、特异性强等优势,具有广阔的应用前景。