衣藻感光作用的实验

衣藻可依靠眼点的感光作用到光照适宜的地方,进行光合作用,维持自己的生活。但因衣藻个体很小,学生不易看到眼点,平时又没有这方面的感性认识,所以对衣藻能感光这一点感到比较抽象。为了使学生更好地理解这部分内容,设计以下实验,提供给学生一个自己动手动脑的机会...     

衣藻的细微结构

衣藻属于绿藻门、团藻目。它是绿藻中细胞结构特征的一个典型代表。大、中学植物教材中都以衣藻作为绿藻门的重要代表植物。本文根据目前电镜资料,描述如下。衣藻的细胞器衣藻虽然是较原始的单细胞真核藻类,但是它已具备了真核植物的各种细胞器。在光学显微镜下可以清楚地看到,在细胞壁内有包埋在细胞质中的大型杯状叶绿体和叶绿体腔内的细胞质及细胞核。在电镜下观察,细胞器与高等植物的相同。核膜具有双层膜结构、有核膜孔。细胞质中的内质网与核膜     

拟衣藻属一新种——中华拟衣藻及其生活史的研究

报道了团藻目衣藻科拟衣藻属一新种。此种从中国科学院武汉植物研究所一浇园粪缸中采得,在分离室内单种培养过程中,对其形态学和生活史进行了研究。营养细胞具有多个盘状色素体,与拟衣藻属已知的种类有明显的差别。经培养观察,作者发现除细胞分裂、无性生殖外,还有同宗异配式有性生殖,在生活史各阶段该藻中绿体中均未见蛋白核,因此,拟衣藻作为分类单元是一个有效的属。     

连续光照转暗培养联合药物处理实现衣藻细胞的高水平同步化

单细胞衣藻(Chlamydomonas)是光合作用和植物细胞周期等生物学过程研究的一个重要模式系统, 同步化培养是进行相关研究的必要手段。该研究探索了连续光照转暗培养联合细胞周期阻断剂实现莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)细胞高水平同步化的新方法, 并利用流式细胞术对同步化程度进行了精确的分析。结果表明, 连续光照转暗培养或联合S期阻断剂可以使衣藻细胞同步化到G1期或G1/S期边界; 连续光照转暗培养联合M期阻断剂或者在“加入-释放”S期阻断剂后再加入M期阻断剂可以使衣藻细胞同步化到M期, 同步化水平可达80%。具体的同步化培养步骤要根据研究对象(特别是某些衣藻突变株系)的特性和研究目的确定。     

转衣藻染色质烟草细胞核的变化及衣藻核基因的表达

应用反复冻融法以衣藻原生质体为材料制备衣藻染色质,应用显微操作技术准确将衣藻染色质转移到烟草叶片外植体中,进行连续培养并镜检观察。结果表明,经染色质转移处理的烟草叶片外植体、衣藻细胞核与烟草细胞核均发生形态上的变化。同时烟草叶片外植体正常发芽并获得再生苗,经RT-PCR检测发现,有衣藻核基因(rbcs2)的表达。     

衣藻叶绿体分裂相关基因CrFtsZ3的克隆及其原核表达

FtsZ蛋白在原核细胞以及植物细胞叶绿体的分裂过程中发挥着重要作用。为了研究叶绿体分裂装置的进化 ,运用RT PCR方法从莱茵衣藻中克隆了叶绿体分裂相关基因CrFtsZ3。由于已经从衣藻细胞中克隆了一个ftsZ基因 ,所以CrFtsZ3的克隆表明衣藻中已经存在两类不同的 ftsZ基因 ,这说明 ftsZ基因的复制与分歧发生于绿藻的分化之前。序列分析结果显示 ,CrFtsZ3所编码的蛋白质具有FtsZ蛋白的典型模体。进一步的原核表达与定位分析表明CrFtsZ3 GFP融合蛋白沿着宿主菌体的纵轴方向有规律地聚集成荧光点或荧光带 ,并且CrFtsZ3蛋白过量表达明显干挠了宿主菌正常的细胞分裂过程 ,说明衣藻CrFtsZ3蛋白能够识别宿主细胞内的分裂位点并影响细胞分裂过程 ,从而初步验证了它的生物学功能     

转基因衣藻对重金属的抗性及对镉离子的富集

目的：研究了转基因衣藻对不同重金属离子的抗性和对Cd^2＋的富集行为。方法：将MT-like基因在莱茵衣藻细胞中的表达后通过摇瓶实验测试其对重金属离子的抗性和富集能力。结果：转基因衣藻对Pb^2＋、Zn^2＋和Cd^2＋三种重金属离子的抗性得到明显增强,其中以对Zn^2＋的抗性增强最为显著。转基因藻对Cd^2＋的富集能力经MT-like蛋白表达后较野生藻细胞有较大增加,最大达到144．48μmol／g,为野生藻的8．3倍。结论：转基因衣藻对重金属离子的抗性和对Cd^2＋的富集能力较野生衣藻有较大提高。     

豆血红蛋白基因lba的克隆及其转化衣藻叶绿体

降低细胞内的氧气含量是提高莱茵衣藻产氢效率的重要手段之一。本研究首次尝试将豆血红蛋白基因lba转入衣藻叶绿体中表达,利用豆血红蛋白具有与氧可逆结合的特性,期望降低转基因衣藻细胞内的氧气含量,达到提高衣藻产氢效率的目的。实验结果证明,lba成功转入到衣藻叶绿体中,且对其生长没有产生显著影响,这为下一步调控Lba在衣藻叶绿体中表达活性和提高衣藻产氢效率奠定了实验基础。     

4种常用抗生素对莱茵衣藻生长及光化学活性的影响

采用4种不同浓度的抗生素对(氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、氯霉素(Cmp)及四环素(Tet))莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)进行无菌化处理,研究抗生素种类及浓度对莱茵衣藻的细胞密度、叶绿素a含量及光化学活性的影响,以确定对莱茵衣藻细胞无害并能抑制伴杂菌生长的抗生素种类及使用浓度。结果表明:低于100μg/mL的氨苄青霉素(Amp)及20μg/mL的氯霉素(Cmp)处理,会使莱茵衣藻的细胞密度及叶绿素a的含量增加,卡那霉素(Kan)及四环素(Tet)各浓度的处理都会使细胞密度及叶绿素a的含量下降,并呈现抗生素的剂量依赖效应;50μg/mL的Amp及10μg/mL的Cmp在处理3 d后会增加莱茵衣藻的实际光合效率(YII)及相对电子传递效率(rETR),而后下降;Kan及Tet各浓度的处理都会使YII及rETR显著下降。结合4种抗生素对莱茵衣藻伴生菌的抑菌实验结果,表明在4种抗生素中,Cmp在抑菌范围内并不会明显地抑制莱茵衣藻细胞的生长与光化学活性,可用于莱茵衣藻细胞无菌化培养中。     

莱茵衣藻血红素加氧酶1过表达载体的构建和遗传转化

莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardti)是一种3套基因组都能进行遗传转化的真核生物,作为一种模式生物,它被用于生物学研究的各个领域。目前,发现血红素加氧酶具有多种功能活性,但关于它的作用机理还不是很清楚。本研究利用分子生物学技术,构建了莱茵衣藻HO-1过表达载体,用SpeI和BglII双酶切,DNA测序,GUS染色,PCR检测证明表达载体构建成功。将此构建通过农杆菌介导法导入莱茵衣藻细胞中,获得了能够稳定遗传的转化子。上述结果为后续进一步的功能研究奠定基础。     

叶绿体陪伴蛋白在几种藻类中的存在和分布

用豌豆叶绿体陪伴蛋白（ｃｈ－ｃｐｎ６０）的杭体对衣藻和多种蓝藻细胞提取液作Ｗｅｓｔ－ｅｒｎｂｌｏｔ分析表明：真核的衣藻和原核的有异形胞丝状蓝藻的一种鱼腥藻中存在一种与豌豆ｃｈ－ｃｐｎ６０抗体有交叉反应的蛋白,其一个亚基的分子量与豌豆该蛋白的分子量相似,而另一亚基的分子量高于豌豆的β亚基分子量。绿藻和丝状蓝藻中这一蛋白在热处理后含量增加,而经－２０℃冷处理１２ｈ后含量明显下降。在单细胞蓝藻中则检测不到这种蛋白。     

转基因衣藻lba及对照藻产氢培养条件的优化

通过对莱茵衣藻849及其转基因衣藻lba进行光照强度、细胞浓度和培养基中硫酸盐含量三因素三水平的正交实验,确定了两个藻种的最佳产氢条件,同时对转基因藻和849产氢培养条件下的光合放氧速率和pH进行了检测。实验结果表明,在25 ℃下,莱茵衣藻849和转基因衣藻lba的最佳产氢条件都为光照强度 60μmol/(m²·s),细胞浓度为叶绿素含量12.5μg/ml,培养基中硫酸盐含量0μmol/L。莱茵衣藻849和转基因衣藻lba的最高氢气产量分别达到了349μl/mg chlorophyll 和634μl/mg chlorophyll。在产氢条件下,转基因藻lba的净光合放氧速率比849低。结果为利用豆血红蛋白特性通过基因工程手段提高莱茵衣藻产氢量提供基础实验数据。     

同步化培养后莱茵衣藻生物量和总RNA含量的变化

为了探索莱茵衣藻经光/暗同步化培养后的细胞生长和总RNA的变化规律。本研究检测了16h光/8h暗同步化培养后莱茵衣藻的生物量和总RNA含量的变化规律。结果,在同步化培养结束后的前28h,莱茵衣藻的生物量呈现有节律的阶梯增长;在同步化培养结束后的28～48h,这种阶梯式增长方式逐步消失。在同步化培养结束后的前24h,总RNA含量呈现有节律的峰-谷-峰变化;在同步化培养结束后的24～48h,这种变化幅度逐步减小,节律周期也逐步缩短。对比同步化培养后莱茵衣藻生物量和总RNA含量的变化可以得出,同步化培养后莱茵衣藻的同步化节律仍然可以维持一定时间;但随着连续光培养时间的延长,这种节律逐步消失,通过测定生物量和总RNA含量的变化可以跟踪同步化培养后莱茵衣藻的同步化变化。     

莱茵衣藻E2泛素结合酶CrUBC23调控油脂积累

【目的】为研究莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzymes,E2)CrUBC23在莱茵衣藻油脂代谢中的作用,为高产油微藻基因工程改良和揭示藻类油脂合成及代谢调控机理奠定基础。【方法】qRT-PCR分析莱茵衣藻在低氮、低磷胁迫下泛素结合酶CrUBC23表达情况;克隆CrUBC23同源基因干涉片段和全长基因,构建RNAi干涉载体和过量表达载体,转化莱茵衣藻并检测生物量和油脂含量;构建CrUBC23-GFP融合表达载体,用农杆菌浸染洋葱表皮细胞进行亚细胞定位。【结果】莱茵衣藻在低氮、低磷胁迫下CrUBC23基因表达量显著增加,增加幅度分别为正常培养的4.98–5.80倍和1.85–5.20倍。RNAi干扰结果显示,转基因藻细胞中性脂含量降低5.5%,总脂含量降低3.16%–17.6%。过量表达结果显示,转基因藻细胞中性脂含量增加8.8%,总脂含量增加4.51%–14.03%。【结论】CrUBC23正向调控莱茵衣藻油脂代谢,该基因定位于细胞核。     

RNA干扰20S蛋白酶体α亚基基因对莱茵衣藻油脂代谢的影响

为了解20S蛋白酶体α亚基(20S proteasome alpha subunit A, POA1)基因对莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)油脂代谢的调控,对莱茵衣藻CC425在低氮胁迫下的CrPOA1表达进行了分析,克隆POA1同源基因片段,构建pMaa7IR/XIR干涉载体并转化莱茵衣藻CC425,对CrPOA1进行有效沉默,测定转基因藻株细胞干质量和油脂含量;克隆全长基因,构建CrPOA1-GFP融合表达载体并转化洋葱表皮细胞,进行亚细胞定位。结果表明,莱茵衣藻在低氮培养下,CrPOA1 mRNA水平比对照(正常培养)显著降低(P0.01),RNAi转基因藻株CrPOA1 mRNA水平比对照pMaa7IR/XIR(maa7)降低79.36%～85.35%,沉默效果较好;RNAi转基因藻株细胞干质量与对照maa7无显著差异,油脂含量比对照maa7显著降低6.38%～24.63%,CrPOA1正向调控莱茵衣藻油脂;亚细胞定位于细胞核。这表明CrPOA1参与了莱茵衣藻的油脂代谢过程。     

莱茵衣藻在本科实验教学中的应用

以莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhard6i）为实验对象,研究醋酸钠和硝酸钠胁迫对其生命活动的影响。实验结果表明醋酸钠可能会抑制衣藻的生长,而硝酸钠则无明显的促进作用。醋酸钠和硝酸钠对衣藻的胁迫效应差异很大,醋酸钠胁迫可以明显提高SOD和CAT的酶活性,硝酸钠则无明显作用,甚至有一些抑制作用。通过该研究,探索了衣藻在本科教学实践中的应用．对丰富本科实验具有重要意义。     

SMART技术构建衣藻细胞的酵母双杂交文库

衣藻是用来研究植物光合作用和动物纤毛常用的模式生物.为了研究蛋白质之间的相互作用,利用SMART技术构建了衣藻的酵母双杂交文库.使用Trizol试剂提取鞭毛再生过程和光周期培养的细胞进入分裂前的衣藻细胞的总RNA,经过Oligotex纯化得到mRNA;应用SMART技术和LD-PCR合成双链cDNA,经过CHROMA SPIN TE-400柱子去除短片段的cDNA;cDNA和线性化载体pGADT7-Rec共转化酵母Y187构建酵母双杂交文库.库容达到3.0 × 106CFU,重组率为70％,插入片段平均长度为0.6 kb.以上结果说明该文库质量较好,能够通过筛选文库得到与目的蛋白互相作用的蛋白质,为寻找蛋白质的作用伴侣打下基础.     

CPI大部分缺失影响莱茵衣藻光能转换特性的研究

用紫外光处理野生型莱菌衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）CC－125得到突变体CC－1047。电泳检测证明：突变型衣藻CC－1047缺失了绝大部分色素蛋白复合体I（CPI）。进而详细地研究了CPI的部分缺失对突变型衣藻的光物理和光化学反应的影响。野生型衣藻的低温荧光峰有两个,分别在691nm和717nm左右;突变型CC－1047的低温荧光峰只有一个,在709nm左右,且荧光强度增加了3－4倍。709nm的峰被认为是光系统I捕光天线色素所发出的。在突变体中出现的这个峰,说明天线色素吸收的光能未能传递到光系统I的反应中心,再进行电荷分离;而是以荧光的形式也发生了改变,野生型和突变型的荧光在开启作用光后都很快上升,但随后野生型的逐渐下降,而突变型CC－1047的基本上不下降;与野生型相比,突变型衣藻CC－1047的光系统I反应中心色系P700的氧化还原活性降低80％以上,表明突变型衣藻细胞内与PSI相关的电子传递已不能正常运转。     

疑难问题解答

问一、高中生物〈甲种本〉P、80图24,衣藻的有性生殖(图解)中,为什么衣藻的一个合子能产生出四个衣藻?答:衣藻是单倍体(n)的绿藻,每个衣藻只有两根鞭毛,产生的配子必然也是单倍体(n).两个同形状,同大小的配子融合形成的合子当然是二倍体(2n),合子萌发时进行"合子减数分裂",因而产生出四个单倍体的衣藻.下附,衣藻的生活史图:     

不同培养模式下魏氏真眼点藻生长和产油特性的研究

为了解魏氏真眼点藻(Eustigmatos vischeri Hibberd)的生物学特性,探究"批量法"、"两步法"、"补料法"和"添加碳酸氢盐"4种不同培养模式对魏氏真眼点藻生长和油脂积累的影响,本文分别采用不同初始浓度的硝酸钠供应、更换培养基、分次少量补加硝酸钠及添加低浓度Na HCO3或NH4HCO3等方法培养魏氏真眼点藻。结果显示,"批量"培养下,硝酸钠浓度为3.0 mmol/L时藻细胞生物量达到8.41 g/L,油脂最高可达到65.16%,油脂产率为0.30 g·L-1·d-1。"两步法"和"补料法"培养对藻细胞油脂积累没有显著影响,而通过"添加碳酸氢盐"培养对该藻细胞生长和油脂积累的效果最显著,其中Na NO3+NH4HCO3组生物量达到11.56 g/L,油脂最高达60.92%,与相同氮浓度"批量"培养相比,生物质浓度提高了1.0 g/L,总脂含量提高了10%,大大提高了该藻的总脂产率(达到0.39 g·L-1·d-1)。因此,魏氏真眼点藻是一株高产油藻株,当添加低浓度碳酸氢铵时最有利于促进该藻生物质浓度和总脂含量的提高,这是一种最佳的培养模式,具有潜在的开发和利用价值。