正常仔猪肠道内大肠菌定居的研究I．正常仔猪肠道内大肠菌血清型的定居及更替的观察

用NY-10株大肠菌口饲初生仔猪14头,定期用直肠棉拭从仔猪分离大肠菌并鉴定其血清型。其中10头猪共观察7一13天不等,直至NY一10从棉拭中消失为止,二头猪观察16和24天,最后二头猪观察50和53天。     

华东地区致初生仔猪腹泻大肠杆菌的O血清型和毒力因子

从江苏、江西、安徽等7个省疑似黄、白痢直肠棉拭及病死猪的十二指肠和肠系膜淋巴结中分离鉴定出339株病原性大肠杆菌。经O血清型鉴定,除77株未能定型、41株自凝外,测定出221个分离株的O血清型,这些分离株覆盖了64个血清型,以O107、O101、O20、O93、O11和O149为主,共99株,占定型菌株的44.80%。这些血清型与已报道的常见血清型间存在一定差异。运用黏附素单抗对以上菌株进行F4、F5、F6、F18、F41　5种黏附素检测,共97个分离株表达黏附素(28061%),而表达两种和3种黏附素的菌株分别有22株和8株,它们分别占表达黏附素菌株的22.68%和8.25%,其中单独表达F4、F6、F5+F41黏附素菌株分别有18、30、15株,分别占表达黏附素菌株的18.56%、30.93%和15.46%;同时运用多重PCR对其中145个分离株进行毒素基因(Sta、STb、LT、SLT2e)的检测,拥有Sta和STb毒素基因的菌株分别占检测菌株的51.72%和3724%。F6、F4、F5+F41和Sta、STb为该地区致初生仔猪腹泻大肠杆菌常见的毒力因子。     

粤北地区仔猪腹泻大肠杆菌分离鉴定及耐药性分析

为了解粤北地区规模化猪场仔猪腹泻大肠杆菌耐药情况,为该病防控提供用药参考,对来自6个规模化猪场疑似仔猪大肠杆菌引起的腹泻粪便和肠道内容物进行了大肠杆菌分离鉴定,对分离鉴定的40株大肠杆菌进行了药敏试验。结果表明,分离菌株对22种受试药物均产生不同程度耐药性,强力霉素和四环素耐药菌株比例最高,达到97.5%,其次是复方新诺明、庆大霉素、氯霉素和红霉素耐药菌株达到80%以上。敏感性最高的药物为丁胺卡那霉素,其次是头孢西丁,敏感菌株比例分别为85%和84.5%。试验菌株均产生不同程度多重耐药性,最少为4重耐药性,10重及以上耐药性菌株比例达到80%以上。研究表明,粤北地区仔猪腹泻大肠杆菌耐药性严重,要重视药敏监测,以指导合理选用药物防控该病。     

早期灌喂母源粪菌对新生仔猪肠道菌群发育的影响

【目的】粪菌移植(fecal microbiota transplantation,FMT)作为一种治疗手段,已在人类肠道疾病治疗中有较多应用,但在干预新生仔猪肠道菌群上的研究未见报道。本文旨在研究早期母源粪菌移植对新生仔猪肠道菌群发育的影响。【方法】选取一窝12头杜长大新生仔猪,随机分为粪菌处理组(feces treatment,FT)和对照组(control,CO)。FT组仔猪出生后1–5 d每日灌注母源粪菌接种液,CO组灌注等量生理盐水。于1、3、5、7、10、14、18和22日龄采集仔猪粪样,Miseq高通量测序分析仔猪粪便菌群。【结果】灌喂母源粪菌有增加仔猪肠道菌群丰富度的趋势;主坐标分析显示,两组仔猪粪样菌群结构簇并未分开,并在18和22日龄时靠近母猪粪样菌群结构簇;随日龄增加,两组仔猪肠道中的变形菌门丰度均显著降低,而厚壁菌门的丰度显著增加,且从10日龄起拟杆菌门和厚壁菌门之和约为90%;与对照组相比,灌喂母源粪菌增加了10日龄时Escherichia-Shigella的丰度,而降低了18日龄时该菌属的丰富度,18日龄时肠球菌属和普氏菌属的丰度则显著增加。【结论】1–3日龄口服灌喂母源粪菌液并不能影响仔猪肠道菌群的定殖,这一阶段主要受母体微生物结构的影响;灌喂粪菌液对仔猪肠道菌群定殖的影响最多持续10–14 d;而且仔猪在22 d左右,肠道菌群结构逐渐趋同于母猪肠道菌群。     

健康仔猪肠道乳杆菌黑龙江地方株的鉴定与种属分析

为了从健康仔猪肠道中分离筛选用于研制微生态制剂的乳酸杆菌菌株,选择黑龙江省大庆、哈尔滨及宝泉岭地区部分猪场,采集12-60日龄健康仔猪肠道粪样64份。选用MRS乳酸杆菌专用培养基分离培养乳酸杆菌,通过分离株的形态特征和培养特性筛选出革兰阳性,厌氧,无芽胞杆菌48株。再通过生化试验鉴定和PCR种属分析,确定18株为乳酸杆菌。其中,罗伊乳杆菌7株,嗜酸乳杆菌5株,约氏乳杆菌2株,短乳杆菌1株,干酪乳杆菌假植物亚种1株,植物乳杆菌1株,詹氏乳杆菌1株。     

断奶仔猪源大肠杆菌LEE及HPI毒力岛的检测

应用Duplex_PCR方法,对240株断奶仔猪源大肠杆菌分离株的LEE毒力岛的eaeA基因和耶尔森菌强毒力岛核心区的irp2基因进行了检测,并对HPI毒力岛的fyuA基因及其在大肠杆菌染色体中的插入位置进行了分析,以及随机选取部分PCR产物进行了克隆和序列分析。结果表明:其中29株(12.08%)为LEE HPI ,39株(16.25%)为LEE ,11株(4.58%)为HPI ;另外还发现:不同病例来源的分离株之间,两种毒力岛的携带率不同;在断奶仔猪腹泻源分离株中,29株(20.71%)为LEE HPI ,22株(15.71%)为LEE ,9株(6.43%)为HPI ;断奶仔猪水肿病源分离株中,仅5株(6.58%)为LEE ,2株(2.63%)为HPI ,未发现LEE HPI 菌株;断奶仔猪水肿病并发腹泻源分离株中,仅12株(50%)为LEE ,未发现HPI 及LEE HPI 菌株。本实验克隆的eaeA(425bp)与已发表序列完全一致,irp2(280bp)f、yuA(948bp)、asn_tRNA_intB(1391bp)均与已发表的序列高度同源,同源性分别在98.2%、98.3%、95.8%以上;40株LEE HPI 或HPI 分离株中,29株(72.5%)为fyuA ,且其HPI毒力岛位于大肠杆菌染色体asn_tRNA位点。     

大肠杆菌生化反应特征的研究

本文就近十年来从国内15个地区收集的多种来源的l 836株大肠杆菌,在全面血清学分型的基础上分析研究其生化反应结果,得出了大肠艾希氏菌属典型反应的一般规律,并发现了某些肠道致病性大肠杆菌主要流行血清型的特征性生化反应,探索了血清香!!与生化反应间的内在联系与特征性生化反应血清型菌株在流行性婴幼儿腹泻中的病原学意义,讨论了目前在饮水、食品等卫生细菌学检验中所存在的一些实际问题。为肠道杆菌菌型鉴别诊断和改进大肠菌类细菌检验方法提供了依据。     

思茅松毛虫肠道真菌分离鉴定及水解酶活性初步研究

肠道微生物在昆虫的食物消化、免疫防御中发挥重要作用,但目前对昆虫肠道真菌了解不多。本研究以重要林业害虫—思茅松毛虫Dendrolimu kikuchii Matsumura为材料,分离鉴定其幼虫中的肠道真菌。采用传统微生物分离纯培养的方法从思茅松毛虫4龄幼虫肠道样品中分离肠道真菌,运用ITS序列分析鉴定,并对其产酶活性初步研究。经同源序列比对分析,思茅松毛虫4龄幼虫肠道中共分离得到12株真菌,分别属于德巴利酵母属Debaryomyces sp.,拟盘多毛孢属Pestalotiopsis sp.,青霉属Penicillium sp.,弯担菌属Curvibasidium sp.。产酶活性研究表明8株菌产纤维素酶,9株菌产淀粉酶,7株菌产脂肪酶,2株菌产蛋白酶。DKF-8产淀粉酶能力最高,酶活力是60.907 U/mL。DKF-10产纤维素酶能力最高,酶活力是14.276 U/g,菌株DKF-6产蛋白酶活力是5.561 U/mL,菌株DKF-8产蛋白酶酶活力是2.918 U/mL。思茅松毛虫4龄幼虫肠道真菌物种丰富度较低。本实验为未来深入研究思茅松毛虫肠道微生物功能提供了菌株材料。     

猪源大肠杆菌(ETEC、STEC、AEEC)毒力基因及其与O抗原型的关系

[目的]揭示从我国部分地区仔猪腹泻或水肿病病猪体内分离到的300个大肠杆菌分离株所属病原型(pathotype)、毒力基因及其与O血清型的关系.[方法]O血清型采用常规的凝集试验进行测定,毒力基因采用PCR方法检测.[结果]通过对这300个分离株的O血清型及其毒素、紧密素和黏附素基因进行鉴定,结果显示除50株未定型、17株自凝外,测定出233个分离株的血清型,这些分离株覆盖了45个血清型,其中以0149、0107、0139、093和091为主,共133株,占定型菌株的57.1%;拥有est Ⅰ、estⅡ、elt、stx2e和eae A基因的菌株分别为102(34.0%)、190(63.3%)、81(27.0%)、57(19.0%)和54(18.0%)株;分离株中有51株K88基因阳性(其中菌毛表达率为100%),75株F18基因阳性(其中菌毛表达率为50.7%),在K88菌株中,0149血清型与est Ⅰ或estⅡ elt密切相关,在F18菌株中,0107血清型与est Ⅰ或estⅡ、0139血清型与stx2e紧密相关.依其毒力特征可将这些分离株分为以下6种类型:ETEC、STEC、AEEC、ETEC/STEC、AEEC/ETEC和AEEC/ETEC/STEC,分别拥有190、24、36、32、17和1个菌株,占分离株的63.3%、8.0%、12.0%、10.7%、5.7%和0.3%.通过分析这些分离株的O血清型、毒素类型和黏附素型之间的相关性:猪源ETEC以0149、0107、093和098等血清型为主,0149:K88菌株主要与estⅡ或estⅡ elt肠毒素相关,0107:F18菌株主要与estⅡ相关,093和098血清型菌株主要与estⅡ肠毒素相关;STEC菌株以0139:F18血清型为主,拥有stx2e;AEEC菌株拥有紧密素,无明显优势血清型;ETEC/STEC菌株以0107:F18和0116:F18血清型为主,主要与est Ⅰ stx2e或estⅡ stx2e密切相关,ETEC/AEEC菌株以091和0107血清型为主,全部拥有肠毒素est Ⅰ和紧密素基因.[结论]我国至少存在6种病原型的猪肠道致病性大肠杆菌,其中ETEC为我国部分地区猪大肠杆菌病的主要病原,同时其病原型日益复杂.     

仔猪BPI基因表达水平与大肠杆菌F18菌株感染的关系

文章利用已建立的苏太猪F18大肠杆菌病抗性和敏感性资源家系群体作为实验材料,分别选择8头35日龄左右生长性状基本一致的大肠杆菌F18菌株抗性和敏感性断奶仔猪,运用Real-time PCR方法检测BPI基因mRNA在断奶仔猪各个组织的分布情况,并比较其在大肠杆菌F18菌株抗性型和敏感型断奶仔猪个体间的差异表达水平,为探讨该基因在免疫和抗大肠杆菌F18菌株感染中的作用提供依据。结果表明,在对所有个体检测的11个组织中,BPI基因在心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉、胸腺、淋巴结中几乎不表达,或表达量很低,但在十二指肠和空肠中表达量很高。在十二指肠和空肠中,BPI基因在抗性组的表达量均显著高于敏感组的表达量(P<0.05)。由此表明,BPI基因对抗断奶仔猪肠道中大肠杆菌F18菌株的感染可能具有直接作用,并且个体对大肠杆菌F18菌株的抗性可能与BPI基因在肠道中表达量上调有关。     

苏北地区规模化猪场产肠毒素大肠杆菌的分离鉴定及灭活疫苗效果评估

[目的]产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是引起仔猪腹泻的重要病原菌,本研究通过调查苏北地区规模化猪场ETEC的流行情况,分析其生物学特性,研制具有免疫保护效果的优势血清型菌株的灭活疫苗,以期对苏北地区ETEC的防控提供参考。[方法]从苏北地区规模化猪场采集3-30日龄的仔猪新鲜粪样、肛拭子及小肠组织样,分离出ETEC,对分离菌株进行血清型鉴定、耐药性测定、小鼠致病力测定;最后通过动物免疫试验研究优势血清型菌株灭活疫苗对小鼠的免疫保护效果。[结果]从21个规模化猪场采集病料562份,通过PCR鉴定及测序得到141株ETEC;血清凝集试验鉴定出85株菌的O抗原血清型,其中08、0101和0128为优势血清型,占定型菌株的61.2%(52/85),其他血清型包括09、03、020、0148、0149等;分析141株ETEC对14种常见抗生素的耐药情况,得出分离株对新霉素、红霉素、四环素、庆大霉素、强力霉素、阿莫西林、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑高度耐药,耐药率均高达80%以上;对恩诺沙星敏感性较高,敏感率达50.4%(71/141);对多粘菌素B和头孢噻肟中介耐药,占比分别为66%(93/141)和51.8%(73/141);多重耐药现象严重,其中10重耐药的菌株占比最大,为19%(27/141);小鼠攻毒试验测得08血清型强毒株YC-6的半数致死量(median lethal dose,LD50)为1.4×10^7 CFU/只,最低致死量(minimum lethal dose,MLD)为3×10^7 CFU/只;08血清型强毒株YC-6和0101血清型强毒株LYG-3制备的单价灭活疫苗对小鼠的保护率均达到100%,因此利用08血清型强毒株YC-6和0101血清型强毒株LYG-3研制二价灭活疫苗,结果显示该二价疫苗对感染不同血清型ETEC小鼠的保护率在83%以上。[结论]本研究通过对苏北地区ETEC的流行病学调查,得出其优势血清型,并研制出针对对优势血清型免疫保护效果较好的二价灭活疫苗,给临床ETEC的监测和防控提供参考。     

肠道沙门菌O:4(B)菌群脉冲场凝胶电泳分子分型

为了明确2010年食源性疾病监测中分离的肠道沙门菌O:4(B)菌群的PFGE分子型别,探讨其多态性及其与分子流行病学关系,我们将分离获得的29株O:4(B)血清型沙门菌进一步鉴定培养,挑取单个菌落增菌,供试菌株基因组DNA用限制性内切酶Xba Ⅰ消化酶切后进行脉冲场凝胶电泳分型,所得结果用Bionumerics5.1软件进行聚类分析.实验结果表明,根据电泳指纹图谱,可将29株肠道沙门菌O:4(B)菌群分为24个PFGE型别,菌株间的相似值在56.31%~100%之间,同一血清型别的沙门菌有多个PFGE型别.脉冲场凝胶电泳对O:4(B)群沙门菌有较高的分型能力,可有效的应用于食物中沙门菌溯源分析及分子流行病学研究.     

食蟹猴肠道志贺氏菌感染情况的调查

本文对 337只食蟹猴肠道志贺氏菌进行调查 ,其感染率为 1 1 %。对所分离到的 2 7株志贺氏菌进行生化、血清学鉴定 ,分属三个群 ,八种血清型 ,痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌所占比例分别为 1 0 8%、86 5%、2 7% ,以福氏志贺氏 2a型居多 ,占 59 5%。对八种志贺氏菌血清型菌株进行药敏试验 ,结果表明 ,不同血清型菌株对同一种抗菌药物的敏感性、耐药性均有差异。提示不同血清型的菌株均可自然感染食蟹猴 ,在治疗时 ,对感染不同血清型志贺氏菌的食蟹猴区别用药 ,以提高治愈率 ,避免因用药不当所造成的经济损失。     

断奶仔猪肠道菌群的研究

研究断奶仔猪在不同生理状况下的肠道菌群,结果表明：健康仔猪肠道内容物中,从十二指肠到结肠,所测定的８种细胞数量都随肠段后移而逐渐增加,４３日龄仔猪肠道内容物中以乳杆菌、肠球菌和梭菌占绝对优势,双歧杆菌次之;与健康仔猪相比,下痢仔猪肠道中肠球菌、梭菌和乳杆菌等优势菌群的数量明显低于对照组;饲喂了含肠球菌的活菌制剂的仔猪肠道中双歧杆菌和类杆菌的数量比对照组明显增加,但肠球菌数量却无显著改变。     

用原生质体转化技术构建含有大肠杆菌K88acLT-B和0149抗原基因的菌株

毒素源性大肠杆菌(ETEC）是可以引起幼畜腹泻 的致病菌,此类菌具有对宿主特异的起粘附定居作用 的菌毛,还有直接引起腹泻的肠毒素,目前已发现对热 敏感的肠毒素LT和对热稳定的肠毒素ST。在临床 中经常分离到的带有K88菌毛抗原的致病菌主要是 引起新生仔猪的急性腹泻,其发病、流行都比较快,是 新生仔猪死亡的一个重要原因,给畜牧业造成极大的 危害〔‘’。本实验室经过几年的研究,已经构建了具有 K88ac菌毛抗原和LT肠毒素B亚单位抗原的无毒菌 株,并已作为疫苗菌株应用于畜牧业中。但是考虑到 自然界野生型菌株生命力强,还具有多种不同的。抗 原,所以发展口服免疫的活菌苗有必要考虑上述因素。 这样当孕猪口服免疫活菌苗后,即可以产生更好的免 疫应答,刺激细胞和体液免疫系统,产生保护性伉体, 通过初乳给新生仔猪提供保护。本实验利用我们构建 的带有K88ac抗原和LT=B抗原基因的PMM085质 粒（待发表于生物工程学报,1987,和一株带有0149 抗原和K88ac抗原的野生型菌株,在用常规的Ca'十 处理受体菌转化未获成功后,又利用PEG诱导的原 生质体转化方法,把质粒PMM085转化到上述带有 014,抗原基因的野生型菌中,得到了带有K88ac,LT-B 和014,抗原基因的无毒菌株。可望此菌株能更好地 模仿自然感染致病菌株,在免疫中产生更好的预Vi作 用。     

毒素源性大肠杆菌CFA/I、CS_3重组菌株的粘附力、免疫原性和保护性的研究

本研究采用可逆性肠结扎成兔腹泻(RITARD)动物模型检测了毒素源性大肠杆菌(ETEC)定居因子抗原Ⅰ(CFA/Ⅰ)和表面抗原3(CS_3)重组菌株的肠道粘附力、免疫原性和保护性。经肠道及口服接种时重组菌株对肠道均有较强的粘附力,与CFAs阴性宿主菌相比P<0.01。口服免疫家兔时,第四周血清抗体滴度达到高峰,分别为1∶9 000和1∶80 000;肠道免疫家兔后血清效价在第二周达到高峰,滴度分别为1∶8 000和1∶60 000。在抗体滴度高峰时进行ETEC野生株攻毒,结果显示口服组抗腹泻保护率为66.7％～75％,肠道组为50.1％～71.4％。攻毒后免疫家兔的排菌天数较对照组明显减少。     

大肠埃希氏菌SY-30菌株预防初生仔猪大肠杆菌病的研究

SY-30是埃希氏菌属(Escherichia)的一株大肠杆菌,该菌株产生大肠菌素,无致病性,对致病性大肠埃希氏菌具有明显的拮抗作用,我们将该菌制成活菌制剂,对101例初生仔猪大肠杆菌病临床效果观察及1330例效果累计表明,对该病的预防效果是肯定的。     

江苏某地健康绵羊群产志贺毒素大肠杆菌体内分离株的分子流行病学及致病力

【目的】探讨江苏某羊场健康绵羊体内产志贺毒素大肠杆菌的带菌和流行情况,同时就分离株的致病力和对Vero细胞的毒性作用作了研究。【方法】基于本实验室已经建立的EHEC O157:H7 EDL933W株的stx1、stx2、eaeA、hlyA四个基因的多重PCR检测并配合选择性增菌、平板筛选等方法对STEC进行分离鉴定。【结果】在为期6个月的连续跟踪调查中,共分离到STEC菌株107株,分离率为19.4%(107/550)。分离株属于41种O血清型、62种O:H血清型,未定型(ONT)有22株,粗糙型(OR)1株。其中属于绵羊STEC的优势血清型有O5(2株)、O91(1株)、O103(1株)。本文检测到的优势血清型为O93,stx2阳性菌株的分离率较stx1阳性菌株的分离率高,LD50测定结果表明分离株对小鼠致病力不高,受试的3个分离株均不能致小鼠死亡。对107株stx阳性分离株噬菌斑试验表明,71株阳性菌株携带噬菌体(66.3%,71/109)。受试分离株进行Vero细胞毒性试验,其中有一个菌株stx基因阳性但不能使Vero细胞产生病变。【结论】绵羊是STEC的天然宿主,可健康带菌。虽然STEC分离株对小鼠的致病力较弱,但不能排除其对人类安全的威胁。STEC携带志贺毒素基因并不意味着一定表达志贺毒素,需对志贺毒素的表达及调控机理做进一步的研究。     

大肠杆菌血清学分型的研究

本文报告1963--1973年间从我国15个地区收集的大肠杆菌3767株血清学分型研究结果。除少量菌株分自动物外,其余均分自婴幼儿腹泻患者粪便。共分离到82个。抗原组和43个H抗原。与流行性婴儿腹泻有关的肠遒致病性大肠杆菌O…菌株占45.66％,O128为9．51％,O114为9．10％,为国内最常见的0抗原组。O111: K11(B4)：H-9 O11：K58(B4)：H29O114：K90(B):H_三个血清型为国内最常见的血清型,共占48．7％。从腹泻患儿分离的普通大肠杆菌中,O1-一O11菌株占半数以上。     

美洲大蠊肠道内生细菌的分离及其初步抑菌活性研究

分离鉴定美洲大蠊肠道内生细菌,并初步研究了其抑菌活性。采用平板稀释法对美洲大蠊肠道内生细菌进行分离纯化,分离菌株通过形态学观察和16S rDNA基因序列BLAST比对进行种属鉴定。以金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌4株细菌为对象,采用牛津杯法初步鉴定各分离菌株的抑菌活性。BLAST比对分析结果表明:从15只美洲大蠊肠道内分离鉴定出125株内生细菌,分属12科20属。初步抑菌活性显示:部分菌株对金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌有明显抑菌活性。美洲大蠊肠道内生菌种类繁多,而且较多菌株具有抑菌活性。