恶性疟原虫膜蛋白Pfs25在毕赤酵母中的组成型表达

目的:Pfs25蛋白是传播阻断型恶性疟疾疫苗的侯选抗原,在毕赤酵母中表达Pfs25蛋白,并对表达产物进行鉴定。方法:参照GenBank中公布的pfs25基因序列,通过毕赤酵母喜好密码子分析人工合成目的基因;采取定向克隆策略构建重组表达质粒pfs25/pGAPZαA,经BstXⅠ线性化,电转染法转化酵母菌株GS115,在Zeocin抗性的筛选培养基上获得表达目的基因的pfs25/pGAPZαA/GS115重组酵母菌,SDS-PAGE和Western印迹检测表达产物;通过在YPD培养基上传代培养和目的基因表达,验证重组菌株的遗传稳定性。结果:在毕赤酵母中表达了Pfs25蛋白,且重组菌株遗传性质稳定。结论:为研制基于Pfs25蛋白的传播阻断型恶性疟疾疫苗奠定了基础。     

人可溶性晚期糖基化终产物受体的酵母表达及其生物活性分析

将人可溶性晚期糖基化终产物受体(human soluble Receptor for advanced glycation end product,hsRAGE)cDNA插入巴斯德毕赤酵母组成型表达载体pGAPZαA,构建重组表达载体pGAPZαA-hsRAGE,并转化到毕赤酵母X-33中,利用含抗生素Zeocin的YPD平板筛选重组子。重组菌株在甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP)启动子的调控作用下,进行组成型分泌表达,在发酵液中获得了相对分子质量约45 kD的重组蛋白。摇瓶发酵结果表明,在发酵温度30℃、pH6.0、发酵时间72 h时重组蛋白表达占发酵上清液总蛋白68.4%。Western blotting显示,重组蛋白能够被相应抗体所识别。纯化后的重组hsRAGE具有与AGEs相互结合的活性,并能够显著地抑制AGEs诱导的人血管内皮细胞系ECV-304细胞NF-κB信号通路中NF-κB/p65基因的表达。     

人精氨酸酶在毕赤酵母的高效表达、纯化和活性研究

目的：人精氨酸酶（Arginase, Arg）的基因arg在毕赤酵母高效分泌表达,建立相应纯化工艺路线,研究重组人精氨酸酶的活性。方法：将人精氨酸酶基因arg按正确的阅读框架插入到毕赤酵母表达载体pPIC9α信号肽基因后,构建得到重组毕赤酵母表达质粒。转化毕赤酵母GS115筛选高表达菌株。结果：成功构建了酵母表达载体pPIC-Arg,转化毕赤酵母GS115后筛选到分泌表达目的蛋白Arg的菌株,目标蛋白可以分泌到培养基中。经过膜过滤和凝胶过滤层析对培养基上清进行纯化,即可获得纯度达到95%的活性产物。活性测定表明,纯化的Arg比活性为310 IU/mg。结论：成功构建了Arg的毕赤酵母高效表达菌种,建立了目标物质的分离纯化工艺。     

极细链格孢菌peaT1基因在毕赤酵母中的表达与功能 分析

建立了在毕赤酵母(Pichiapastoris)中分泌表达PeaT1蛋白的技术。将来源于极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)的基因peaT1亚克隆至酵母分泌型表达载体pPIC9K,构建了重组表达载体pPIC9K-peaT1,分别用SalI或BglII酶切线性化后电击转入毕赤酵母GS115菌株中,经MD平板筛选、PCR鉴定获得整合有外源基因的重组菌株。在α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,PeaT1在酵母中大量表达并分泌到胞外,SDS-PAGE检测表明表达蛋白的表观分子量约为35kD。表达蛋白上清稀释液能诱导烟草产生对TMV的抗性,其枯斑数抑制率可达到30.37%。每升表达上清液经超滤浓缩和离子交换层析可纯化目的蛋白16.13mg,该纯化蛋白能显著地促进小麦幼苗的生长。     

硫色曲霉β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的组成型分泌表达

目的：构建硫色曲霉β-甘露聚糖酶的毕赤酵母组成型分泌表达菌株,研究重组菌株的产酶水平。方法：EcoR I／Xba I双酶切质粒pPIC-mann-opt,琼脂糖凝胶电泳、回收目的基因片段后,与组成型毕赤酵母表达载体pGAPzαA连接,转化大肠杆菌,经筛选获得含有pGAP-mann-opt的重组克隆;提取pGAP-mann-opt,用限制性内切酶BspH I线性化后,转化毕赤酵母X-33感受态细胞,进行Zeocin抗性筛选和PCR鉴定。结果：获得了重组菌株,重组菌株在YPD培养基中摇瓶发酵24h,上清液酶活达到343U／mL,产酶蛋白约为1.0mg／mL。结论：构建的硫色曲霉β-甘露聚糖酶组成型表达菌株具有较好的应用前景。     

脊髓灰质炎2型病毒样颗粒在毕赤酵母内的表达与鉴定

目的构建可稳定表达脊髓灰质炎病毒(poliovirus,PV)类病毒颗粒(virus-like particles,VLPs)的整合型重组毕赤酵母,鉴定PV VLPs在毕赤酵母细胞中的表达及组装情况。方法根据毕赤酵母密码子偏好性优化salk株II型P1和3CD基因并连接到p Pic ZA载体,构建p Pic ZA-P1-3CD表达载体;用Bgl II线性化p Pic ZA-P1-3CD载体,电转至毕赤酵母GS115中。通过Zeocin抗性筛选获得整合型重组毕赤酵母,随后用高浓度Zeocin抗性筛选得到高表达菌株。甲醇诱导后,用Western Blot检测目的蛋白表达;蔗糖密度梯度离心纯化PV VLPs并进行透射电镜观察。结果成功构建p Pic ZA-P1-3CD表达载体,获得PV VLPs重组毕赤酵母。Western Blot在重组毕赤酵母裂解上清中检测到目的蛋白的表达;蔗糖密度梯度离心纯化后,在透射电镜中观察到直径为30 nm左右的VLPs,其形态与天然的PV颗粒相似。结论成功构建PV-2型VLPs的整合型重组酵母系统,并在毕赤酵母中组装形成了VLPs,为酵母表达系统中PV VLPs疫苗的研制奠定了基础。     

利用GAP启动子在毕赤酵母中组成型表达人鹅型溶菌酶2

利用甘油醛三磷酸脱氢酶(glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase,GAP)启动子在毕赤酵母中表达人鹅型溶菌酶2(human goose-type lysozyme 2,h LysG2),并在小试规模建立一套有效的重组hLysG2(recombinant h LysG2,rh LysG2)生产工艺流程。根据毕赤酵母密码子偏爱性设计并人工合成hLysG2基因,将其连接至pGAPZαA质粒中,构建重组表达质粒pGAPZαA-h LysG2。将重组表达载体线性化后电转化毕赤酵母GS115感受态细胞,通过Zeocin抗性筛选获取高拷贝重组菌株,并在5L生物反应器中进行发酵培养。发酵60h后发酵液上清酶活性达到最高,发酵液上清经SDS-PAGE及Western blot检测证实rh LysG2得到表达。与诱导型表达相比,组成型表达发酵时间缩短了48h,上清中rhLysG2总活性提高了23.8%;使用甲壳素亲和层析和分子筛层析对rhLysG2进行纯化后,每升发酵液上清可纯化到187.4mg重组蛋白,纯化产物纯度达99.0%以上;浊度测定法分析显示,在p H 5.6、30℃和0.1mol/L Na+的条件下,rhLysG2可达到最大酶活性13 500U/mg。利用GAP启动子在毕赤酵母中成功表达了高纯度和高活性的rh LysG2,避免了甲醇的使用,缩短了发酵时间,提高了蛋白产量,为将rhLysG2开发为新型抗耐药菌药物奠定了基础。     

重组人GALNT3-sol蛋白在毕赤酵母中的高效表达和活性鉴定

目的:为了获得有催化活性的人乙酰半乳糖胺转移酶3(GALNT3),构建了GALNT3可溶性区域(GALNT3-sol)的真核分泌表达载体,在巴斯德毕赤酵母中表达并纯化GALNT3-sol蛋白,体外检测其转糖基活性。方法:以构建好的pET15b/GALNT3-sol为模板进行PCR,扩增编码人GALNT3-sol的cDNA片段(1 755 bp),将其克隆至真核表达载体pPIC9K,载体线性化后采用电击法转化毕赤酵母GS115。通过MD平板和G418平板筛选出阳性高拷贝重组菌株。阳性菌株经过甲醇诱导表达人GALNT3-sol重组蛋白,表达上清进行Ni-NAT分离纯化。分别采用SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化的重组蛋白,并使用HPLC和MALDI-TOF/MS分析其转糖基化反应的活性。结果:成功构建了能够分泌表达GALNT3-sol的毕赤酵母菌株。阳性表达菌株在BMMY培养基(pH 6.0)中20℃培养,经0.5%甲醇诱导表达96 h,摇瓶表达量可达5mg/L。SDS-PAGE和Western blot结果显示表达重组蛋白为糖基化形式。活性检测显示表达的重组蛋白具有转糖基活性。结论:成功获得可以高效分泌表达具有活性的人GALNT3-sol蛋白的毕赤酵母菌株,为进一步研究人GALNT3的性质及其应用提供了基础。     

犬细小病毒VP2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的表达犬细小病毒VP2蛋白（CPVVP2）,用于犬细小病毒病的诊断、疫苗研制和VP2蛋白功能研究。方法采用PCR方法对CPVVP2基因进行扩增,将CPVVP2基因克隆到毕赤酵母（Pichiapastoris）分泌表达载体pPICZαA中,构建真核重组表达载体pPICZαA—VP2,将该重组质粒线性化后,转化毕赤酵母菌GS115中,在甲醇诱导下表达CPVVP2,SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达蛋白。结果成功扩增了CPVVP2基因,构建了真核重组表达载体pPICZαA-VP2在毕赤酵母菌中表达出约64．35kD蛋白。Western blotting鉴定表明,表达VP2蛋白与犬细小病毒阳性血清有反应性。结论在毕赤酵母中成功地表达了CPVVP2蛋白,能被犬细小病毒阳性血清识别。     

α-2b干扰素重组质粒的建立及在毕赤酵母中的表达

目的:采用基因工程手段构建基因工程菌表达α-2b干扰素。方法:根据毕赤酵母密码子嗜好性原理设计并合成α-2b干扰素基因序列,将其插入到毕赤酵母Pichia pastoris的分泌型表达质粒pPIC9K中,得到重组分泌表达质粒pPIC9K-IFNα-2b,并用电转化法转化P.pastoris GS115。筛选出整合型His Muts菌株,进一步用G418筛选获得高拷贝转化子,经5d诱导表达后SDS-PAGE检测。结果:菌落PCR和序列测定结果显示重组表达质粒已成功构建,SDS-PAGE结果显示目的蛋白已成功表达。结论:在毕赤酵母中成功表达α-2b干扰素。