青杄均一化cDNA文库构建及EST序列分析

以青杄花粉和针叶为材料,将青杄全长cDNA与Gateway供体载体pDONR222重组,构建了其非剪切型全长cDNA原始文库,利用基因组DNA饱和杂交技术对原始cDNA文库进行均一化处理,构建青杄的均一化全长cDNA文库。文库的总库容量为1.1×106CFU/mL,平均插入片段长度大于1.0 kb,重组率大于95%。定量RT-PCR检测表明,青杄高丰度表达基因EF1-α在均一化cDNA文库中的表达量下降了约41倍。接着对文库中随机的5 144个克隆进行了测序,获得高质量的有效EST(expressedsequence tag)序列为5 144条,经拼接共获得单一基因(unigene)为2 717个,其中包括片段重叠群(contig)628个和单一EST序列(singlet)2 089个。NCBI同源比对分析表明,其中1 887个序列unigenes获得分子功能注释,这些EST涉及细胞生长、信号转导、转录、抗逆、能量代谢等功能。这些数据有助于对青杄的相关功能蛋白及分子机制开展进一步的研究。     

一种大规模筛选单克隆及提取质粒的改进方法

利用α-互补(X-gal IPTG)从cDNA库中筛选特异克隆,以此去除含有未插入片段和插入片段小的克隆。运用展库的方法,通过辅助噬菌体对库中多个载体的切割,将载体以质粒的形式转化到大肠杆菌中;同时对质粒DNA碱裂解提取方法做了改进,建立了一种简单实用的大量提取质粒DNA的方法。该方法利用特定的蛋白质吸附膜吸附提取过程中的蛋白质,从而去除了使用酚-氯仿抽提蛋白质的复杂过程,减少了质粒DNA的损失,是一次性获得大规模质粒DNA的有效方法。获取的质粒DNA样品在纯度和浓度上都可以满足测序、PCR及Southern杂交等分子生物学实验的要求。     

全长cDNA克隆的三种方法的比较研究

为了得到一段EST所在基因的全长,采用了快速扩增cDNA末端（RACE）、cDNA文库构建、λphage测序引物与特异性引物结合,非放射性探针进行噬菌体原位杂交等方法分别对该基因进行了克隆,结果得到了一致的全长cDNA,三种不同实验方法的应用,为更方便、有选择性地克隆全长cDNA基因奠定了基础。     

复方配伍的摄动模糊聚类方法

利用摄动模糊聚类方法对中药复方桂枝汤的药群进行了分类,结果表明该方法优于传统模糊聚类方法,避免了利用传递闭包求模糊等价矩阵进行分类的失真问题,与中药传统组方原则相吻合。     

复杂生物数据集的聚类数自动确定方法

聚类数目是影响聚类效果的关键参数,通常需要人工确定,对于较难获得这一先验知识的复杂生物数据集,聚类分析会因此受到限制。针对这一问题,文章提出一种自动确定最佳聚类数目的方法,该方法利用体现"类内紧凑类间离散"思想的优化聚类算法来执行主要计算,结合目标函数二阶差分的判定准则,通过聚类算法的自学习来确定最佳聚类数。实验结果显示,该方法能在复杂数据集上自动得到合理的聚类数目。     

一种新的cDNA末端快速扩增获取全长cDNA的方法

为克隆精子发生相关基因的全长cDNA,根据mRNA差异显示获得的ESTs设计引物。利用一种新的cDNA末端快速扩增方法（SMART RACE）扩增该EST的5′末端,并进行克隆测序,与cDNA差异显示获得ESTs拼接后,获得了三个新的全长cDNA。结果表明：SMAR RACE是一种简便、有效的克隆cDNA5′末端未知序列的技术。     

小麦抗旱生态分类中适合性聚类方法的研究

探索了适合于小麦品种抗旱生态分类的聚类方法。选用２１个农艺性状和１５个冬小麦品种（系）,在聚类分析的各环节上,通过采用不同的策略,大规模进行了各种分类结果的比较。结果表明,在与专家经验分类接近程度上,数据转换方法中,原始数据法依次大于普通相关阵基础上的方差极大正交旋转法、Ｐｒｏｍａｘ斜交旋转法、主成份法;相似性度量上,欧氏距离大于马氏距离;聚类方式上,对应分析法和模糊聚类法大于最短距离法、最长距离     

白桦核心种质构建的聚类方法研究

以白桦240个家系的胸径、树高、材积和纤维素含量数据为依据,采用马氏距离计算家系间距离、10%的取样比例和优先取样法,研究了最短距离法、最长距离法、中间距离法、重心法、类平均法、加权配对算术平均法、可变法和离差平方和聚类法建构的核心种质与原种质的遗传参数、性状相关性及分布格局.结果表明,最短距离法构建白桦初级核心种质均值差异百分率、极差符合率、方差差异百分率和极差符合率分别为0、100%、75%和143%,4个性状相关性显著、相关系数均超过0.5,保持了原种质资源的空间分布格局,是构建白桦核心种质最佳方法.     

一种改进的构建杂交扣留cDNA文库的方法

介绍了一种改进的利用减法杂交构建λ噬菌体cDNA文库的方法,该方法利用处理的sscDNA减去两种对照的mRNA富集目的sscDNA并用磁珠法分离杂交单体,结果表明其增加了杂交单体的产量、简化了实验步骤,而且更有利于富集所需基因,是构建cDNA文库的一个有效改进.     

刺参管足SMART cDNA文库构建及EST分析

以大连广鹿岛野生刺参的管足mRNA为材料,利用SMART cDNA Construction Kit构建了表达型cDNA文库.初始文库的滴度为1.3 × 106PFU/mL,蓝白斑估测量组率合格.扩增后获得96 mL文库,滴度为1.8 × 1010PFU/mL,从扩增文库中随机挑取200个噬菌斑进行PCR检测,电泳检测结果表明重组率大于90％,片段大小在0.25 -2.0 kb之间的插入片段占80.4％,文库构建成功.随机选择122个噬菌斑转化为质拉pTriplEx2并测序,测序成功率83.6％,软件处理后100 bp以上的clean ESTs有72条,测通的为65条,占成功测序样品的63.7％.72条序列经SeqMan软件拼接,获得48条conting/singletons,在线Blast比对发现其中26条具有同源序列并获得注释,另外20条可能为新基因,其功能和结构有待进一步利用生物信息学的方法进行分析和研究.     

羊种布鲁氏菌侵染HPT-8细胞cDNA文库的构建及EST序列分析

拟建立羊种布鲁氏菌侵染HPT-8细胞的cDNA文库。分别提取布鲁氏菌侵染20min、1h、2h、3h、4h后HPT-8细胞总RNA,逆转录合成cDNA,同源重组法构建布鲁氏菌侵染HPT-8细胞的cDNA文库,测定其库容量和重组率,对文库63个克隆进行测序分析,采用BLASTx和BLASTn进行序列同源性比对,并将63个基因进行了功能分类。结果得到的羊种布鲁氏菌侵染人胚胎滋养层细胞HPT-8cDNA文库的库容为1.43×106,重组率是96.92%,插入片段大小为0.2-5.0kb。在63个基因中,与转录、能量代谢、运输及细胞因子相关的基因所占比例较高。构建的羊种布鲁氏菌侵染HPT-8细胞的cDNA文库,为研究宿主细胞受体和布鲁氏菌入侵途径,进一步了解布鲁氏菌的致病机理奠定了基础。     

一个鼻咽癌相关EST的鉴定及其全长cDNA序列分析

鼻咽癌是我国南方及东南亚地区常见的恶性肿瘤之一.通过对鼻咽癌染色体高频率杂合性丢失区域3p21的表达序列标签(expressedsequencetag,EST)进行同源性比较分析,运用逆转录聚合酶链式反应的方法,筛选到一个在41.18%(14/34)的鼻咽癌活检组织及20.0%(1/5)的鼻咽癌细胞系中表达下调的ESTBG772301;并用Northern杂交方法,检测了该EST在多种正常成人组织中的表达状况及其所代表基因的转录本大小.在此基础上,对该EST来源的cDNA克隆(IMAGE:4839190)进行直接测序,获得了一个全长为2377bp的新cDNA序列;经生物信息学分析,发现它与已知基因序列无明显同源性,属于一个新基因,定位于染色体3p21.3,被命名为鼻咽癌表达下调基因(NPCEDRG,GenBank登录号:AF538150).其编码的蛋白质含169个氨基酸,与一个已报道的在进化上相对保守、功能未知的人类蛋白Nicolin1(简称NICN1)N端170个氨基酸残基的序列同源性为97%,但缺少NICN1蛋白C端43个氨基酸残基,可能是nicolin1基因不同剪接本的编码产物.     

Large-scale EST sequencing in rice

Large-scale cDNA analysis provides several great advantages for genome investigations in rice. Isolated and partially characterized cDNA clones have contributed not only to the construction of an RFLP linkage map and physical maps of the chromosomes but also to investigations of the mechanisms of expression of various isozymes and family genes. The ultimate aim of our large-scale cDNA analysis is to catalogue all the expressed genes of this important cereal, including tissue-specific, developmental stage-specific, and stress-specific genes. As of August 1996, the Rice Genome Research Program (RGP) has isolated and partially sequenced more than 29000 cDNA clones from various tissues and calluses in rice (Nipponbare, a japonica variety). The sequence data were translated into amino acid sequences for the 3 possible reading frames, and the similarity of these amino acid sequences to known proteins registered in PIR were examined. About 25% of the clones had significant similarities to known proteins. Some of the hit clones showed library-specific distributions, indicating that the composition of the clones in each library reflects, to some extent, the regulation of gene expression specific to differentiation, growth condition, or environmental stress. To further characterize the cDNA clones, including unknown clones, nucleotide sequence similarities of 24728 clones were analyzed and the clones were classified into around 10000 independent groups, suggesting that around a half or one third of expressed genes in rice have already been captured. These results obtained from our large-scale cDNA analysis provide useful information related to gene expression and regulation in rice.     

内蒙古菜蝽属4个种昆虫酯酶同工酶的比较研究

应用聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳技术,对内蒙古地区菜蝽属EurydemaLaporte横纹菜蝽E .gebleriKolenati、新疆菜蝽E .maracandicumOshanin、巴楚菜蝽E .wilkinsiDistant、菜蝽E .dominulus(Scopoli)4个种的酯酶(EST)同工酶作了比较研究。结果表明,菜蝽属4个种的EST同工酶谱带清晰、多态性强、稳定性好,且显示出各自种的特征酶谱,可作为菜蝽属昆虫系统分类学研究的重要分类特征。聚类分析结果进一步证明,内蒙古地区菜蝽属昆虫包含了4个独立的种。聚类图也清晰直观地反映了4种菜蝽之间的系统发育关系,即(((横纹菜蝽,巴楚菜蝽)新疆菜蝽)菜蝽)。     

夜香树均一化全长cDNA文库的构建及EST分析

为构建高质量的夜香树(Cestrum nocturnum)均一化全长c DNA文库,以其花朵为材料,采用DSN均一化技术与改进的SMART技术相结合,将连接产物进行脱盐浓缩后电转化进行构建。结果表明,未脱盐连接产物的转化效率为1μL连接产物有7000个菌落,理论重组率为96%;脱盐后,提升为4.1×106个菌落,理论重组率为98%;蓝斑也有插入片段,实际重组率应为100%;插入片段大小平均为1.6 kb。随机挑取500个单克隆(含50个蓝斑)测序,共获得464条EST,单一序列(unigene)为426条,占91.8%,其中片段重叠群26个,单基因400个,冗余率仅为8.1%,表明构建文库的均一化效果较好,可满足后续功能基因的筛选和基因信息的研究。