牛脑液泡型质子泵70kD和33kD亚基基因的表达

已分离了编码牛脑液泡型质子泵的70kD亚基的cDNA,利用聚合酶链反应(PCR)扩增了70kD亚基的编码片段,同时直接从牛脑cDNA库中得到了33kD亚基的编码片段.分别将相应片段连接到PET载体上完成70kD和33kD亚基基因在大肠杆菌中的表达.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹分析表明70kD和33kD亚基基因均得到明显表达.     

少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的表达

Δ⁶-脂肪酸脱氢酶是一种膜整合蛋白,也是多不饱和脂肪酸合成途径中的限速酶。在前期工作中,通过RT-PCR和RACE技术,从少根根霉NK300037中克隆到一个潜在编码Δ⁶-脂肪酸脱氢酶的序列,序列和功能分析结果表明该序列具有一个长度为1377bp、编码由458个氨基酸组成、大小为52kD的新的Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因。把少根根霉Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因(RAD6)亚克隆到表达载体pPIC3.5K,构建重组表达载体pPICRAD6,并转化到毕赤酵母菌株GS115进行表达。提取酵母细胞总脂肪酸和进行甲酯化,经气相色谱和气相色谱质谱连用分析表明,目的基因的编码产物能将C16∶1、C17∶1、C18∶1、亚油酸和α-亚麻酸在Δ⁶和7位间特异性脱氢而引入一个新的双键,生成更高不饱和的脂肪酸,该催化反应没有链长特异性,只有键位特异性。此外,按Kozak序列特点,改变目的基因转译起始密码子周边序列结构,并把改变后序列导入毕赤酵母GS115中进行功能表达分析,结果表明在毕赤酵母中这种改变同样能提高目的基因的表达水平。综合所有分析结果表明,巴斯德毕赤酵母更适合用来综合分析Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因的功能。     

猪2型圆环病毒ORF1与ORF2基因和伪狂犬病毒基因的重组与表达的研究

根据GenBank发布的猪2型圆环病毒(PCV2 )序列(AY0 35 82 0 ) ,设计两对特异性引物,采用PCR方法,分别扩增了猪2型圆环病毒ORF1和ORF2基因。将ORF1和ORF2基因的PCR产物回收并酶切后,依次插入到伪狂犬病毒gE gI双缺失通用转移载体pIECMV中,构建了猪2型圆环病毒_伪狂犬病毒重组中间转移质粒pIEORF1-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移质粒pIEORF1_ORF2与伪狂犬病毒TK^- gE^- LacZ⁺ 基因组共转染IBRS_2细胞,待发生细胞病变后收集病毒液进行空斑纯化,利用检测PCV2ORF1基因和ORF2基因的PCR方法筛选重组病毒TK^- gE^- gI^- ORF1-ORF2⁺ ,用Southernblotting鉴定重组病毒,并用Westernblotting检测ORF1_ORF2融合蛋白的表达情况,在此基础上也测定了重组病毒在不同细胞上的增殖滴度。结果表明,外源基因ORF1和ORF2已成功插入到TK^- gE^- LacZ⁺ 亲本株的基因组中,并获得了表达,表达的蛋白可与PCV2阳性血清发生反应。同时发现ORF1和ORF2基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力与亲本株相当。     

磷酸化和脱磷酸化对牛脑63kD环核苷酸磷酸二酯酶同工酶活性的调节

本文报道了CaM依赖性磷酸化和脱磷酸化对牛脑63kD PDE同工酶活性的调节作用。实验结果如下:(1)在存在Ca²⁺和CaM时,提纯的牛脑Ca²⁺/CaM-PK Ⅱ能催化牛脑63kD PDE同工酶磷酸化。最大磷酸参入量是1mol/mo1亚基;(2)在Ni²⁺和CaM存在时,提纯的牛脑钙调神经磷酸酶能催化磷酸化型63kDPDE同工酶脱磷酸化;(3)CaH²⁺对磷酸化型63kD PDE同工酶的半激活浓度(AC₅₀)高于非磷酸化型。     

肿瘤中neu基因的过量表达及其抑制

neu基因编码一种和表皮生长因子受体同源的磷酸蛋白,具有酪氨酸激酶的活性.近年来在多种人类肿瘤中发现neu基因的扩增和(或)过量表达.一些蛋白质因子或化学药物可以在转录水平阻遏neu基因的过量表达或者降低其产物p185^neu的酪氨酸激酶活性,抑制具有neu基因过量表达的癌细胞的转移和增殖.     

胃癌和非癌病变ras P21表达的定量研究

应用流式细胞术对胃癌和胃粘膜的非癌病变组织细胞ras癌基因蛋白产物P²¹表达进行了定量研究,并探讨了ras P²¹表达与DNA倍体与增殖指数的关系.结果表明,胃癌P²¹表达量明显高于非癌病变组织的表达量.胃粘膜非癌病变组织中,胃癌前病变组织P²¹表达量明显高于慢性萎缩性胃炎组织的表达量,并发现P²¹蛋白的表达量与胃癌和癌前病变组织学分级、DNA倍体、增殖指数密切相关.     

用T7 RNA聚合酶体外转录合成大鼠肝tRNAIle

采用PCR技术从rec-M13mp18中扩增出120 bp的大鼠肝tRNA^Ile合成基因片段,经限制性内切酶BstNⅠ酶切后作为模板,利用T7 RNA聚合酶在体外无细胞体系转录由T7启动子带动的大鼠肝tRNA^Ile基因,生成不含修饰碱基的tRNA^Ile,并对体外转录反应条件进行了优化,回收的tRNA产量可达DNA模板量的40倍.     

丙型肝炎病毒基因组C区、NS3区、NS4区基因的融合、表达及初步应用

通过PCR技术从HCV全长基因组中扩增并克隆到Core区、NS4区的部分优势表面抗原肽的基因和C33a基因。再将它们以Core\,CC3c\,NS4的顺序和C33c、NS4的顺序分别拼接融合成融合抗原CCN、CN。片段之间以Gly-Gly-Gly-Gly柔性连接肽连接。经核苷酸序列分析表明,拼接点序列正确。将融合抗原CN、CCN基因分别克隆至T7启动子控制下的表达质粒PET24(a)+,PET22(b)+中,转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导可高表达分子量约为43kD、58kD的融合抗原,表达产物以包涵体形式存在。表达产物经Ni²⁺IDA亲和柱纯化后,并对融合抗原CN、CCN的抗原性做了初步的鉴定。     

梅花鹿FSH β亚基基因克隆与融合表达

以原构建的克隆载体为模板,PCR扩增梅花鹿FSHβ亚基基因,TA克隆后经双酶切插入表达载体pGEX-6P-2,阳性克隆导入E.coli BL21,IPTG诱导表达GST-FSHβ融合蛋白,SDS-PAGE进行分析鉴定.结果显示,FSHβ PCR产物大小约410 bp,测序结果与GenBank序列一致,成功构建了重组表达载体pGEX-6P-2-FSHβ,融合蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子量39.5 kD处,出现特异性蛋白条带,说明梅花鹿FSHβ亚基基因片段已在E.coli BL21中成功表达了FSHβ-GST融合蛋白,融合蛋白功能有待进一步分析.     

p21WAF1在丁酸钠诱导的人成纤维细胞凋亡中的表现

用丁酸钠（NaBu）诱导了人胚肺二倍体成纤维细胞凋亡（2BS）,检测其诱导过程中凋亡相关基因的表达变化,结果表明,p21^WAF1的表达在凋亡发生前即有明显下降,并持续至凋亡发生时, bcl-2的表达仅在凋亡发生时有所下降,c-myc和c-fos的表达有所上升,而p53和HER-2的表达无明显变化.用稳定转染了不同长度p21^WAF1启动子片段和下游绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的2BS-WP系列细胞进一步研究发现,其GFP的表达水平在NaBu诱导过程中下降,主要调控区域为p21^WAF1启动子的TATA box上游0～－800 bp.说明NaBu诱导的人胚肺二倍体成纤维细胞凋亡与p21^WAF1启动子的转录活性下降与密切相关,并且可能不依赖于p53.