冠突曲霉 veA基因缺失型与野生型的差异代谢物研究

为了鉴定冠突曲霉 veA基因缺失型与野生型的差异代谢物,寻找与 veA 基因产孢相关的代谢物,采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）的代谢组学技术,分别收集2个菌株培养48h的菌丝体,经液氮研磨、超声萃取、三甲基氯硅烷衍生化后上机检测,将GC-MS检测的数据进行前处理和代谢物注释,并用统计学相关软件进行差异物筛选和相关性分析。结果显示,共鉴定99种代谢物,其中差异代谢物41种,野生型菌株中表达上调的显著差异代谢物有20种, veA缺失型菌株中表达上调的显著差异代谢物有21种,并预测差异代谢物的相关性,发现与623种代谢物产生相关性,其中313种呈正相关,310种呈负相关。筛选出来的差异代谢物涉及有机酸、氨基酸、碳水化合物、醇类、脂肪酸类等多种代谢物质,其中有机酸和氨基酸类代谢物占主导地位。本研究结果为进一步研究冠突曲霉代谢物与产孢的关联提供了一定的理论基础。     

冠突散囊菌的研究与应用进展

冠突散囊菌是茯砖茶发酵中的优势菌,其数量和质量直接关系到茯砖茶的品质,国内外学者对其进行了比较全面的研究。本文中,笔者综述了冠突散囊菌的分离鉴定、分子生物学、培养、发花过程、保健功能及其应用等几个方面,并对其研究与应用前景进行了展望。     

冠突散囊菌发酵黑毛茶提取液的研究

以冠突散囊菌菌丝干质量为考察指标,以黑毛茶提取液为原料,对冠突散囊菌液态发酵培养基成分、发酵条件进行优化,并分析发酵过程中理化成分和功能成分的动态变化,比较发酵前后芳香性成分组成。得到的最佳培养基为9 g/L的黑毛茶提取液中添加90 g/L葡萄糖、7.5 g/L NH_4Cl和5 g/L CaCl_2;最佳发酵条件为250 mL摇瓶中装液量100 mL、接种冠突散囊菌孢子数2.4×10~6个(V(装液量)∶V(孢子悬液)=20∶1)、初始pH 4.0、28℃发酵8 d。在最优条件下发酵,发酵结束后菌丝干质量增加约10倍,发酵过程中发酵液中各成分呈现动态变化,茶多酚、总蛋白和水浸出物质量浓度分别减少了36.36%、53.80%和21.95%,总黄酮类、游离氨基酸和茶褐素质量浓度分别增加了14.40%、76.75%和5.08%,茶黄素、茶红素发酵前后含量都较低,芳香性成分增加了12种,多为酯类和醇类。     

转录因子ACZ影响冠突曲霉色素及产孢数量的研究

本实验室前期在高渗条件下筛选得到8个转录因子,其中ACZ (SI65-00458)基因表达量最高,推测ACZ基因在冠突曲霉中参与响应渗透压及调控孢子的产生。因而本研究利用同源重组原理,构建了ACZ基因敲除载体,通过农杆菌介导转化,筛选获得了ACZ敲除菌株,将敲除株分生孢子液接种在含不同浓度NaCl的MYA培养基上,以野生型冠突曲霉为对照,观察敲除株与野生型菌株的区别。研究发现:培养基中不加NaCl时色素有明显变化,野生型为黄色,敲除株为褐黄色;在低渗透压下,菌落边缘不规则;在高渗透压下,敲除株产生的分生孢子数量为野生型的4倍多;无论是在27℃还是在37℃培养,敲除株在低渗及高渗条件下,菌落直径都较野生型小,菌丝较稀疏。表明敲除ACZ基因会影响冠突曲霉菌丝生长、色素的合成及孢子的产生。     

茯砖茶中冠突散囊菌的研究进展

冠突散囊菌(Eurotium cristatum)是茯砖茶微生物发酵过程中的优势菌,在特定的条件下冠突散囊菌可在茯砖茶中形成黄色闭囊壳,俗称"金花"。本文从茯砖茶的产地、冠突散囊菌的鉴定历史以及对茯砖茶品质的影响与应用方面进行了综述,并对目前存在的问题及未来的发展方向进行了讨论与展望。     

冠突散囊菌nsdD基因超表达菌株的构建及表型分析

为了研究冠突散囊菌nsdD基因的功能,本研究将冠突散囊菌nsdD的cDNA置于强启动子三磷酸甘油醛脱氢酶启动子PgpdA下游及色氨酸合成酶C基因终止子TtrpC上游构建nsdD基因超表达载体PURT5750,采用根癌农杆菌介导方法将表达质粒PURT5750转化到冠突散囊菌进行功能验证。结果显示向基因组随机插入外源质粒DNA,随机挑选11个nsd D基因超表达转化子,对nsdD基因超表达转化子菌株培养观察并与野生型菌株相比发现,在5%和17%NaCl培养基中菌落差异不显著,而且仍能产生成熟的有性孢子。本实验为冠突散囊菌有性发育调控机制的研究提供了技术基础。     

冠突散囊菌对茶叶品质成分的影响研究

为揭示黑茶"发花"过程中冠突散囊菌对茶叶中主要品质成分的影响,以黑毛茶为原料,比较了"发花"前后各品质成分的差异。结果显示:"发花"过程中多酚类物质减少16.75%,黄酮类物质减少5.65%,水溶性蛋白减少22.77%,可溶性糖减少10.73%,水浸出物变化不明显。采用HPLC方法对"发花"前后黑毛茶中的氨基酸、生物碱、儿茶素、有机酸类成分的组成及含量进行比较:"发花"过程中氨基酸总量减少达88.62%,其中茶氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸的下降最为剧烈;生物碱"发花"后呈上升的趋势,咖啡碱的含量提高8.55%,可可碱提高11.76%;儿茶素类成分总量下降,其中没食子酸和简单儿茶素"发花"后含量升高,其他酯型儿茶素降低;主要的有机酸类成分总含量下降,苹果酸下降迅速,琥珀酸的含量上升到发酵前的8.42倍,研究结果为科学阐述"发花"对黑茶的品质形成机理及其作用提供参考。     

冠突散囊菌黑茶发酵液对消化酶活性影响的研究

在模拟人体胃肠环境中研究不同发酵时期的冠突散囊菌黑茶发酵液对淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性的影响。结果表明冠突散囊菌黑茶发酵液能显著提高α-淀粉酶、蛋白酶活力,并有效抑制脂肪酶活力。冠突散囊菌发酵液利于淀粉、蛋白质消化吸收,抑制脂肪分解吸收,为解释茯砖茶的保健功能提供了理论依据。     

脂代谢相关三基因突变小鼠肝脏差异表达蛋白组研究

应用双向电泳及质谱技术对5周龄三基因(apoE^-1- / LDLR^-1-/Lepr^db/db)联合突变小鼠和野生型小鼠肝组织的差异蛋白质进行比较研究,借此分析脂代谢相关三基因联合突变小鼠肝脏蛋白质表达特点,研究差异表达蛋白与血脂代谢紊乱和动脉粥样硬化的关系.在实验中检测到三基因联合突变小鼠和野生型小鼠肝脏中分别平均有（841±57）个和（1 017±50）个蛋白点（n=3）,两者的平均匹配率分别为71.9%,83.2%.三基因联合突变小鼠有140个蛋白点未能与野生型小鼠匹配,其中相差5倍以上的上调点和下调点分别为7个和39个.选取其中的6个点做质谱分析,鉴定为endoplasmin precursor(Grp-94)、酸性富亮氨酸核磷蛋白32家族成员A(acidic leucin-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A)、转铁蛋白前体、果糖二磷酸酶1、纤维连接蛋白前体、补体C3前体,纤维蛋白原B β多肽7种蛋白. 该结果提示,差异表达的蛋白对三基因联合突变小鼠的血脂代谢紊乱和动脉粥样硬化发生发展过程起一定作用.     

龙眼花芽与叶芽差异蛋白分析

以龙眼(Dimocarpus longan Lour.)花芽和叶芽为材料,对龙眼花芽与叶芽分化发育过程中的差异蛋白质进行分析和鉴定,并探讨其生物学功能.本研究共鉴定出10个差异蛋白质:ATP synthase beta subunit,fructokinase,LHCII type Ⅰ chlorophyll a/b binding protein,peroxidase,ascorbate peroxidase,14-3-3 protein,14-3-3 family protein,putative cytosolic cysteine synthase 7,retrotransposon protein,putative,Ty1-copia subclass,Protein Group similar to late embryogenesis abundant proteins.这些差异蛋白质可能与龙眼花芽与叶芽的物质和能量代谢、自由基清除和抗氧化作用、信号转导和基础代谢、氨基酸代谢等生理过程密切相关.     

冠突散囊菌对茶叶品质成分及其抗氧化活性影响

从茯砖茶样中分离纯化制得冠突散囊菌Eurotium cristatum菌株,选用普通炒青绿毛茶做茶坯,应用人工接种发酵技术进行固体发酵制成发酵散茶。结果表明：冠突散囊菌发酵一个月后的炒青绿茶不仅品质成分明显改善,茶黄素和茶红素高于其他样品,而且苦涩味减轻;采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）法和2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)（ABTS）法测定发酵散茶的抗氧化活性,结果显示,对两种自由基的清除能力分别达到75%和56%以上,与湖南茯砖茶相近。发酵散茶的ABTS自由基清除能力分别高于对照和浙江茯砖茶64.7%和80.6%,而对DPPH的清除能力略低于对照,但是高于浙江茯砖茶。     

低产高级醇酿酒酵母突变菌株的差异蛋白组分析及

【目的】高级醇是白酒微量香气成分中的重要组成部分,但是高级醇含量过高会对酒的品质产生不利影响,而白酒中的高级醇主要是在酒精发酵过程由酵母产生的,因此酿酒酵母高级醇合成相关蛋白的研究对于控制高级醇产生具有重要意义。【方法】以诱变得到的低产高级醇酿酒酵母菌株ARTP5和原始酿酒酵母菌株CF4为研究对象,比较两株酵母的胞内蛋白组差异,寻找高级醇合成相关蛋白。【结果】与原始菌株CF4相比,诱变菌株ARTP5高级醇产量降低了20%,有45个胞内蛋白表达量差异2倍以上,通过MALDITOF-MS质谱鉴定出29个,主要包括碳源和能量代谢、胁迫反应过程、蛋白翻译和折叠过程、氨基酸代谢和高级醇代谢等途径的蛋白,其中ARTP5菌株表达上调的支链氨基酸代谢合成途径的ILV5蛋白和表达下调的高级醇合成途径中的ADH1蛋白与诱变菌株ARTP5高级醇降低具有一定相关性。【结论】与高级醇合成具有一定相关性蛋白的发现对于酿酒酵母酒精发酵过程高级醇的合成机制的解析以及白酒酿造过程高级醇产量的控制有重要意义。     

灰黄霉素高产菌F208发酵过程蛋白质表达差异的研究

目的 为探寻灰黄霉素生物合成过程中的关键酶,以蛋白质组学技术手段分析灰黄霉素高产菌F208发酵过程蛋白质表达差异.方法 通过双向电泳联用质谱技术对F208发酵过程蛋白质组图谱进行比较分析.结果 研究发现灰黄霉素产生期( 192 h)F208表达的蛋白质与产生前期(72 h)有较大差异,并鉴定出在灰黄霉素产生高峰期蛋白表达量明显增加的两个特异点是丝氨酸羟甲基转移酶和S-腺苷甲硫氨酸合成酶.结论 成功建立灰黄青霉菌丝体总蛋白双向电泳技术体系.并鉴定出两个蛋白特异点,极可能与灰黄霉素生物合成有关.     

冠突散囊菌发酵液对高脂饮食大鼠肥胖和肠道菌群的影响

本研究旨在探究突散囊菌发酵液对肥胖大鼠脂质代谢和肠道菌群紊乱的影响,为其开发利用提供科学依据。SD大鼠被随机分为正常组、模型组和冠突散囊菌发酵液干预的低、中、高剂量组,以及血脂康阳性对照组。通过高脂喂养建立食源性肥胖大鼠模型,正常组和模型组给予无菌水灌胃,各剂量组灌胃不同剂量冠突散囊菌发酵液。实验为期8周,末次给药后收集粪便和血清,用于肠道菌群分析和相关生化指标测定,并摘取肝脏进行病理学观察。结果显示,模型组大鼠体质量和Lee′s指数显著增加,血脂发生异常,肠道菌群多样性显著降低。冠突散囊菌发酵液显著降低了肥胖大鼠血清中总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇的含量,提高了高密度脂蛋白胆固醇的含量。测序结果亦显示,冠突散囊菌发酵液显著提高大鼠肠道菌群的多样性,上调瘤胃球菌NK4A214＿group、UCG-005、Christensenellaceae＿R-7＿group等菌群的丰度,下调拟杆菌属Bacteroides和Turicibacter的丰度。LefSe分析还显示,冠突散囊菌发酵液可显著增加大鼠肠道中乳酸菌Lactobacillus丰度,提高肠道的防御功能。综上所述,冠突散囊菌发...     

莱氏野村菌疏水蛋白基因Nrhyd的克隆及其表达特征分析

运用SMART RACE RT-PCR技术,从虫生真菌莱氏野村菌中克隆出完整的疏水蛋白基因Nrhyd编码区序列,以RT-qPCR技术,对莱氏野村菌Nrhyd基因在不同生长条件下的表达特征进行分析,从mRNA转录水平上探讨了不同培养条件对Nrhyd基因表达的影响。结果表明：Nrhyd基因全长733bp,5′非翻译区132bp,3′非翻译区262bp,开放阅读框（ORF）339bp,编码111个氨基酸,前体蛋白理论分子量10.6kDa,理论等电点为6.19。液体摇瓶培养条件下,Nrhyd基因的表达受抑制呈逐渐降低的趋势。固体培养条件下,Nrhyd基因表达量随着分生孢子的产生而升高,到产孢量达到最大的第8天时,表达量最高,以后随着产孢量的下降,基因的表达量降低。因此推测,Nrhyd基因在莱氏野村菌分生孢子形成过程中起重要作用。与不同真菌疏水蛋白基因的系统进化分析表明,Nrhyd基因与绿僵菌来源的同源基因关系最近。     

冠突曲霉Fig基因敲除菌株的构建及表型分析

为了研究冠突曲霉(Aspergillus cristatus) Fig基因的功能,本研究采用同源重组的方法获得敲除株。并对敲除株进行功能验证。结果显示对Fig基因敲除株培养观察并与野生型菌株相比发现,在含有不同浓度NaCl的MYA培养基中,仍能产生成熟的子囊孢子和分生孢子,但分生孢子数量是野生型的1/4,子囊孢子数量是野生型的1/5,且敲除株菌落几乎没有渗出液,无皱褶,菌落表面干燥,色素产生量急剧下降,这些结果表明Fig基因对冠突曲霉产孢起正调控,本实验为冠突曲霉发育调控机制的研究提供了一定的技术基础。     

冠突散囊菌转录因子stf1基因的克隆及其表达分析

利用RACE技术获得了冠突散囊菌stf1基因的全长DNA序列。该序列全长3 029bp,开放阅读框长度为2 664bp,从114–2 908bp,在253bp处含有一个131bp的内含子,预测编码887个氨基酸。同源分析结果表明该基因与Snd1/p100转录因子同源。应用相对定量SYBR Green I荧光定量PCR技术对stf1基因在不同发育时期的表达量的差异进行了检测。结果表明,这个基因在子囊孢子时期的表达量最高,在分生孢子时期的表达量最低,相比子囊孢子时期下降了1倍。为深入研究冠突散囊菌的产孢调控机制奠定了一定的基础。     

人工接种冠突散囊菌对白茶主要呈味物质的影响

本文为了排除其他微生物的干扰,首次以人工接种的方式研究了冠突散囊菌Eurotium cristatum对白茶主要呈味物质的作用。采用高效液相色谱、分光光度计等方法,分析表明冠突散囊菌能够显著降低白茶中呈苦涩味的表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和表儿茶素没食子酸酯（ECG）,并提高表没食子儿茶素（EGC）、Asp、His、咖啡碱和山奈酚的含量;灭菌压制的过程中EGCG可能异构化成为更稳定的没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）,且二者以相近的含量共存。冠突散囊菌可以降低人工发花白茶饼中呈苦涩味的化合物含量,从而达到减少白茶饼苦涩味的效果;灭菌压制过程也能够降低白茶饼的苦涩味物质的含量。“发花”处理为白茶带来了新的风味,可以丰富白茶产品种类,同时为促进粗老原料白茶的综合利用提供新思路。     

龙眼采后果肉劣变的差异表达蛋白分析

为探索龙眼(Dimocarpus longan)果肉常温劣变过程中蛋白质的变化, 采用蛋白质组学的方法, 在‘福眼’龙眼果肉常温劣变过程中发现共有24 个2 倍差异表达蛋白, 其中21 个蛋白被成功鉴定。这些蛋白参与了应激反应与防御(56%)、能量与碳代谢(19%)、初级代谢(5%)、蛋白转运(5%)和细胞骨架(5%)等细胞代谢活动。大多数与抗氧化作用密切相关的蛋白质都下调表达, 说明龙眼采后果肉的抗氧化能力有所下降, 不能有效地缓解ROS 积累引起的毒性作用, 从而使果肉劣变。此外, 与能量代谢相关的蛋白全部下调表达, 表明龙眼果实采后果肉劣变可能与能量供应不足有关。这些结果为龙眼采后保鲜技术研究提供科学依据。     

糠秕马拉色菌酵母态和菌丝态蛋白差异表达的研究

目的通过双向电泳及串联质谱技术鉴定糠秕马拉色菌酵母态及菌丝态差异蛋白,在蛋白水平探讨两态转化机制及致病机理。方法分别诱导糠秕马拉色菌标准株酵母态和菌丝态菌体,利用玻璃珠研磨和超声波破碎细胞壁,三氯乙酸/丙酮沉淀获取总蛋白。双向电泳分离蛋白,PDQuest软件比对找出差异蛋白点。电喷雾串联质谱对差异点进行肽段测序,用Mascot和NCBI的Blast软件经蛋白质数据库鉴定蛋白质。结果经双向电泳分离的糠秕马拉色菌酵母态、菌丝态蛋白各有800多个蛋白点、64个蛋白点表达量有3倍以上差异,其中11个为酵母态特有,9个菌丝态特有。在选取的40个差异点中,成功鉴定出22个点,共16个蛋白。经Mascot和Blast软件检索,有明确功能的蛋白中,肌动蛋白、丝切蛋白等9个蛋白在菌丝态上调,谷胱甘肽转移酶、细胞支架信号蛋白等5个蛋白下调。结论鉴定出16个蛋白分别与细胞代谢、运动、氧化应激等功能相关,为了解糠秕马拉色菌表型转换机制和致病机理提供重要信息。