结核分枝杆菌膜蛋白的异源表达与纯化研究进展

膜蛋白是一类与生物膜相互作用、具有重要功能和独特结构的蛋白质。异源表达纯化一直是了解膜蛋白结构和功能的重要瓶颈。结核分枝杆菌作为典型的胞内致病菌,其膜蛋白的研究具有很好的代表性以及重要意义。目前用于表达膜蛋白的有大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞等表达系统,但结核菌膜蛋白的表达宿主还往往局限于大肠杆菌。异源表达需要综合考虑蛋白的来源、疏水性、跨膜区等特性。低温、加入共表达因子以及改变培养条件有助于结核菌膜蛋白的可溶性表达。另外,包涵体复性也是获得结核菌目的膜蛋白的重要途径。随着新的表达系统,新的促可溶表达策略,新的包涵体复性手段,新的纯化方法的应用,将有更多的膜蛋白异源表达纯化成功,为蛋白质功能研究奠定基础。     

提高大肠杆菌可溶性重组蛋白表达产率的研究进展

大肠杆菌表达重组蛋白相比真核细胞具有成本低廉、大规模发酵容易、条件易于自动化控制等优点,通过大肠杆菌表达重组蛋白是一种高效、经济的途径,重组蛋白表达量可达到大肠杆菌总蛋白质量的50%。具有正常生化活性的重组蛋白通常为可溶性形式,因而对于以得到活性产物(如抗体、酶等)为目的的研究,通常采用可溶性表达途径。目前已有多种以可溶性重组蛋白为活性物质的治疗性药物经批准上市,但并非所有外源基因均能实现可溶性高表达,因此重组蛋白的可溶性高表达具有重要研究价值。在总结近年提高经大肠杆菌可溶性表达重组蛋白产率研究的基础上,从启动子的选择、SD序列的引入、信号肽的优化、宿主细胞的选择、共表达其他蛋白质,高密度发酵等方面阐释在大肠杆菌中提高可溶性重组蛋白表达产率的方法。     

融合表达载体的研究进展

基因工程的实施,主要包括DNA克隆、外源基因的表达及其重组产物的纯化。基因表达是指一个外源基因在表达系统中,既能高效表达又具有原来的生物学活性。目前有三个表达系统,即大肠杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞。其中大肠杆菌最早研究应用,但表达质粒转人受体菌（宿主）后,并不都能获得理想的结果,它涉及到许多因素：诸如基因结构的特点、mRNA的转录效率、蛋白质的折叠、宿生蛋白酶对重组产物的水解作用、外源基因和E·COlt基因间所存在的差异以及表达产物对宿主细胞的毒性等;此外,在高效表达的同时,为了更好地获得人们所需要的重…     

ThioFusion表达系统：——大肠杆菌中表达可溶性蛋白的重大突破

ＴｈｉｏＦｕｓｉｏｎ表达系统──大肠杆菌中表达可溶性蛋白的重大突破马雪梅,黄秉仁,蔡良婉（中国医学科学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室,北京１００００５）在细菌中生产重组蛋白快速、简便,可以产生大量目的蛋白。然而,在大肠杆菌中表达异源蛋白...     

新生肽链的折叠与重组蛋白可溶性表达

新生肽链的折叠与重组蛋白可溶性表达.崔立斌＠马清钧.中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所新生肽链的折叠与重组蛋白可溶性表达崔立斌马清钧（中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所１００８５０）大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统［１］。大肠杆菌遗传背景清楚,容易培养,能大规模发酵,以及大量可供选择利用的克隆和高效表达载体,使之成为人们克隆和表达外源基因的首选菌株［２－５］...     

细菌异源表达抗菌肽的研究进展

抗菌肽是一类从动植物、微生物体内分离得到的阳离子小分子量肽,具有天然的抗菌活性。它作用迅速,广谱,不易产生耐药性,具有重要的应用价值,近年来成为研究热点。普遍认为异源表达是生产大量抗菌肽的最有效方法。大肠杆菌作为经典的表达宿主,具有生长速度快、遗传背景清晰、有大量可利用的商业表达载体、易操作等优势,现已成为抗菌肽表达的首选宿主。乳酸菌作为世界公认安全的食品级微生物,近年来广泛用于抗菌肽的异源表达。着重阐述了抗菌肽在大肠杆菌、乳酸菌中重组表达的研究进展。     

phoA基因的克隆和一种原核分泌表达筛选载体的构建

外源基因在原核细胞中的表达,是基因工程和分子生物学许多研究领域中应用最为广泛的技术,大肠杆菌已成为蛋白质表达的首选宿主和生产基因工程多肽药物的主要表达系统。发展通用的高表达、可溶性以及分泌性表达策略,是目前该领域研究中的重点发展方向。实现外源基因在大肠杆菌中的分泌表达,由于对蛋白质分泌机制的基础研究还不够深入,缺乏有力的理论指导,目前还存在许多问题,急需要发展新的研究技术和思路。研究表明,表达蛋白的性质是决定它能否有效分泌的重要性质,蛋白质中少数氨基酸的改变可显著的影响其分泌情况。为了能够方便的…     

外源基因在大肠杆菌中表达研究进展

近年来,基因工程技术的迅速发展,大量有价值的蛋白质大肠杆菌中获得了高表达。多种表达系统的完善与发展,及蛋白质分离纯化技术的提高,异源蛋白的产量与纯度已不再是困扰人们的主要问题,人们开始更多地关注异源蛋白的活性,比活性及异源蛋白的正确性,完整性。随着这些问题的解决,重组蛋白的应用才能真正走向成熟。     

大肠杆菌I型分泌表达系统研究进展及提高蛋白表达量的策略

大肠杆菌是表达重组蛋白最常用的宿主之一。利用大肠杆菌分泌途径胞外表达重组蛋白具有可促进蛋白正确折叠,有效减少包涵体形成,简化纯化工序等诸多优势,近年来备受关注。其中,大肠杆菌I型分泌途径具有分泌表达速度快,蛋白活性高,对宿主代谢无影响等特点,是目前应用最广泛的分泌途径之一。综述了大肠杆菌I型分泌系统的元件组成和分泌机理及提高I型分泌系统蛋白表达量的有效策略,为重组蛋白生产应用提供了理论依据。     

重组蛋白正确折叠与修饰的提高策略

随着分子生物学的研究和不断发展,基因表达技术有了很大的进步。到目前为止,人们已经研究出多种表达系统用以生产重组蛋白,但没有一种表达系统能够完全满足当前需要,各种活性肽和蛋白质类药物的需求逐年攀升,不仅对表达量有要求,更需要正确的翻译后折叠、修饰,使表达蛋白和天然构象更加接近,具有更高的活性和稳定性。结合目前的研究工作从表达系统与宿主、分泌表达、共表达、融合表达和培养条件等方面综述了其对重组蛋白正确折叠以及翻译后修饰的影响,并提出可能改进的策略。     

抑癌蛋白PTEN的原核表达、抑癌活性研究和抗体制备

PTEN是具有蛋白质和酯类双重特异性磷酸酶活性的抑癌蛋白,在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。鉴于原核表达PTEN蛋白并用于抑癌实验的研究尚未见报道,因此尝试利用大肠杆菌表达有活性的PTEN蛋白,检测其抑癌效果。利用本室克隆的PTEN基因cDNA和原核表达载体pET44a( )分别构建带6×His和Nus标签的两种诱导型原核融合表达载体pETPTEN和pETNusPTEN,在不同的大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)(简写为BL)和Rosettagami(DE3)pLysS(简写为RG)中诱导表达。SDSPAGE和Westernblot检测表明:在可溶性组分和包涵体中均含有目的蛋白,在BL中目的蛋白的表达量较高(18.7%)而在RG中可溶性蛋白的比例较高(6.6%)。经纯化和包涵体蛋白复性处理后,重组融合蛋白经Chariot转运入小鼠实体瘤及人前列腺癌DU145细胞。抑癌实验表明:与对照组相比,重组PTEN蛋白对小鼠实体瘤的生长抑制率为58.76%;对癌细胞DU145的生长抑制率可达46.16%;并可导致明显的G0G1期阻滞,其中在宿主RG中表达的重组蛋白抑癌效果明显高于BL宿主中表达的目的蛋白。证实在原核系统中表达的重组PTEN蛋白具有抑癌活性,同时制备了PTEN的高效价腹水多抗,为深入研究PTEN蛋白在癌症治疗中的应用打下了良好的基础。     

优化大肠杆菌表达外源蛋白的研究进展

大肠杆菌表达系统是目前表达外源蛋白的首选,利用该表达系统表达重组蛋白有许多优越性,但表达的外源蛋白容易被宿主蛋白酶攻击或未能正确折叠形成包涵体,其表达受到了限制。综述了国内外利用大肠杆菌表达外源蛋白过程中采用的一些优化策略,主要包括表达稀有密码子、应用融合标签,改变表达菌株、降低包涵体形成、单一蛋白技术、自诱导、流加培养以及高密度细胞培养等,以期探索外源蛋白表达的最优策略。     

抗病毒蛋白RC28在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达及活性比较

RC28蛋白是从野生蕈类皱盖罗鳞伞中分离得到的新型抗病毒蛋白。前期通过3'-RACE方法,从皱盖罗鳞伞总RNA中克隆获得包含RC28编码区的c DNA,并通过TA克隆获得质粒p MD18-T-RC28。以该质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增RC28片段,分别插入大肠杆菌表达载体p ET28a(+)和毕赤酵母表达载体p PIC9K中,形成在N端表达组氨酸标签的重组RC28表达粒体。将这两种RC28表达质粒转化各自的宿主菌后,筛选阳性克隆,构建稳定表达体系。诱导表达后,用SDS-PAGE电泳和Western blot分析RC28的表达情况。放大表达体系后用Ni-NTA柱纯化获得RC28蛋白,并用MTT法测试重组表达蛋白质的抗病毒活性。在实验条件下,大肠杆菌和毕赤酵母中均能表达可溶性重组RC28,纯化后蛋白质得率分别是3.5mg/L发酵液及0.2mg/L发酵液。但抗病毒活性实验表明,大肠杆菌体系表达的RC28蛋白活性较差,而毕赤酵母系统表达的RC28蛋白的抗病毒活性与天然蛋白接近。     

重组蛋白在大肠杆菌周间腔的分泌表达

大肠杆菌是用于生产重组蛋白的重要工程宿主菌。但是,要获得足够的正确折叠的蛋白还存在一定的缺陷,其中一种解决此问题的方法就是使重组蛋白分泌到大肠杆菌的周间腔里。在这篇综述中,主要讨论了使重组蛋白分泌表达至大肠杆菌周间腔的近期的研究进展。     

一种低温表达型T载体及其应用

在现代生物学和生物技术研究中,通过基因重组表达获得目标蛋白已成为常规技术。因其培养简单、操作方便、遗传背景清楚、克隆表达技术成熟,大肠杆菌表达系统通常是人们表达重组蛋白的首选。但是在常规温度下进行基因的重组表达,动、植物和常温微生物的基因产物多数在数小时内变性沉淀;还有一些重组蛋白对宿主具有细胞毒性,难以得到重组表达。因此,我们构建了1种新型T载体——pEXC-T;它结合TA克隆技术和低温诱导表达功能,具有表达水平高、操作方便、目标蛋白得到分子伴侣保护和低温保存等特点。采用构建和优化的pEXC载体,P1抗原蛋白、溶血素PLO两种不稳定性蛋白在pEXC中都实现了高效的可溶性表达。低温表达系统p EXC的建立和发展为蛋白质的结构与功能的研究,以及抗原和药用蛋白的制备提供了便利的途径。     

大肠杆菌热激反应研究及其在重组蛋白表达中的应用

当大肠杆菌所处的环境温度忽然升高时, 细胞体内会激发热激反应, 体内会迅速合成多种热激蛋白, 由热激转录因子调控的热激蛋白主要包括一些分子伴侣、蛋白降解酶、折叠辅助蛋白等。热激蛋白可以促进蛋白正确折叠, 降解错误折叠的蛋白。主要介绍大肠杆菌热激蛋白的表达调控及其功能, 利用热激转录因子发展的新型温控分泌表达系统及其在蛋白可溶性表达中的应用, 以及热激分子伴侣与重组蛋白共表达的研究进展。     

人细胞色素P450在大肠杆菌中的功能表达

研究人细胞色素P450（P450,CYP）在大肠杆菌中的功能表达对新药研发,临床药物治疗和药物早期ADME/T性质研究均有重要意义。异源表达人P450使用最多的宿主是大肠杆菌E.coli,然而要获得足量的有催化活性的P450仍是一个难题。结合作者近年研究,对异源表达的研究意义,P450在E.coli中功能表达的策略,高效表达的影响因素和共表达等方面做一评述,指出今后的研究应用方向。     

促进原核表达蛋白可溶性的研究进展

以大肠杆菌为代表的原核表达蛋白系统具有操作简单、周期短、成本低、表达量高等优点而成为获得外源表达蛋白的首选方案.但外源蛋白在原核宿主中往往以无生物活性的包涵体形式存在,这限制了原核表达系统的广泛应用.随着对蛋白折叠动力学、参与蛋白折叠的酶和分子伴侣等认识的不断深入,科学家们通过诱导条件优化、宿主细胞改造以及使用融合标签...     

人乙醛脱氢酶2的原核表达及其条件优化

为实现人乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因在原核生物中高效表达,将含有6×His标签和SUMO融合蛋白标签的人乙醛脱氢酶2基因的表达载体转化至宿主菌BL21(DE3)中。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下,目的基因在大肠杆菌内高效表达。通过对表达条件的优化,37℃使用终浓度0.3mmol/L的IPTG诱导3h,重组大肠杆菌的表达量可占全菌蛋白的16%。SUMO融合蛋白标签的加入以及较低的诱导温度(16℃)有利于提高人乙醛脱氢酶2基因在大肠杆菌内的可溶性表达。     

分子伴侣对白喉毒素无毒突变体CRM197重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的促进作用

为了获得有活性的白喉毒素突变体蛋白 (Cross-reacting material 197,CRM197),本研究利用分子伴侣pG-KJE8与重组质粒pET28a-CRM197在大肠杆菌原核表达系统中进行共表达,来促进目的蛋白的正确折叠,进而提高CRM197蛋白的可溶性表达。将质粒转化至大肠杆菌后并诱导其表达目的蛋白,再通过SDS-PAGE胶染色、Western blotting等技术对所得蛋白进行检测分析。结果发现：利用体外重组技术成功得到了pET28a-CRM197重组蛋白原核表达质粒,且CRM197重组蛋白在原核表达系统中主要以包涵体形式表达;通过探索和优化,确定了诱导蛋白的最佳浓度和温度,当加入终浓度为1.0 mmol/L IPTG、0.5 mg/mL L-阿拉伯糖、5.0 ng/mL四环素,在20 ℃条件下诱导16 h时,目的蛋白的可溶性表达得到显著提高;可溶性表达的CRM197重组蛋白可以与CRM197一抗发生特异性结合,免疫反应性良好。因此,研究发现分子伴侣pG-KJE8可以促进CRM197重组蛋白在大肠杆菌中以可溶性形式表达,且能很好地与CRM197一抗发生特异性结合,证实CRM197重组蛋白具有良好的免疫反应性,为CRM197蛋白的工业化生产及应用奠定了一定的基础。