基孔肯雅病毒囊膜蛋白假病毒模型的构建

目的:以HIV为骨架构建单次复制性的含基孔肯雅病毒囊膜蛋白的假病毒模型,观察其对哺乳动物细胞的侵染性。方法:PCR合成基孔肯雅病毒囊膜蛋白基因,克隆到真核表达载体上,与HIV慢病毒包装系统质粒共转染293FT细胞,48 h后收培养上清,在8μg/mL Polybrene存在下感染293FT细胞,感染48 h后在荧光显微镜下观察结果。结果:PCR合成了基孔肯雅病毒囊膜蛋白基因并克隆到真核表达载体上,测序结果正确;共转染293FT细胞后,检测到基孔肯雅病毒囊膜蛋白的表达并包装成假病毒,感染新鲜293FT细胞后能够检测到绿色荧光蛋白。结论:合成的基孔肯雅病毒囊膜蛋白基因能正确表达并包装成假病毒,含基孔肯雅病毒囊膜蛋白的假病毒能感染293FT细胞并表达绿色荧光蛋白,可用该假病毒模型进一步研究基孔肯雅病毒的感染性,筛选评价抗基孔肯雅病毒药物。     

三种丙型肝炎包膜感染性假病毒颗粒的制备及初步应用研究

本研究构建携带HCV代表株H77(1a)、中国HeBei株(1b)以及JFH-1株(2a)丙型肝炎病毒完整的E1-E2包膜糖蛋白基因的表达质粒,间接免疫荧光法及Western blot验证了其在细胞膜(293细胞)上的正确表达.三种包膜质粒分别与慢病毒包装质粒pHR'CMV△8.2及携带EGFP报告基因的自灭活(Self-Inactivating,SIN)转移质粒pCS-CG共转染293FT细胞,产生三种不同基因型的丙型肝炎包膜感染性假型(pseudotyped)病毒颗粒,免疫荧光与Western blot分析验证了E1/E2包膜糖蛋白在假病毒颗粒上的表达与掺人,利用p24 ELISA法及感染性实验对HCV假病毒进行滴定.从上清中获得的HCV假病毒可以在体外感染肝癌细胞系Huh7及Huh7-CD81(且后者上的感染效率约为前者上的2～3倍);利用针对HCV E2蛋白的具有广谱交叉中和活性的单克隆抗体AP33建立了基于上述假病毒颗粒的丙肝病毒体外中和抗体滴定方法,并应用于丙型肝炎患者体内的中和抗体水平的研究.本研究成功包装了包括中国流行株在内的3种不同基因型的HCV包膜感染性假病毒颗粒并建立了基于假病毒颗粒的HCV体外中和抗体检测方法,为研究HCV感染早期特性及特异抗病毒药物的体外筛选提供了有效模型,并可用于HCV感染者体内及HCV基因工程疫苗免疫后中和抗体水平的分析.     

逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒E2基因的真核表达

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(Classical swine fever virus , CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro 中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒.用包装的假病毒感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明CSFV E2基因在PK-15细胞膜上成功表达.将表达E2蛋白的PK-15细胞腹腔免疫Balb/c小鼠,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体.     

麻疹病毒受体与病毒侵入

麻疹病毒是一种具囊膜的负链RNA病毒,两种主要的囊膜蛋白血凝素蛋白(H)和膜融合蛋白(F)表达在膜表面负责病毒侵入过程中与宿主受体的结合和膜融合过程.病毒囊膜蛋白与受体的相互作用是病毒侵入宿主的关键步骤,决定了病毒感染能力、种属和组织嗜性.因此,囊膜病毒与受体的结合位点往往成为重要的抗病毒药物的靶点.目前已发现的3种麻疹病毒受体包括CD46、SLAM和Nectin-4.以下综述了麻疹病毒受体的特征及在病毒侵入中的作用、麻疹病毒H蛋白与受体的相互作用机制,为抗病毒药物设计及麻疹病毒作为肿瘤治疗性载体的应用提供理论依据.     

逆转录病毒载体介导的猪瘟病毒配基因的真核表达

利用DNA重组技术将猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)石门株囊膜蛋白E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明CSFVE2基因在PK-15细胞膜上成功表达。将表达E2蛋白的PK-15细胞腹腔免疫Balb/c小鼠,成功诱导小鼠产生了抗E2蛋白的抗体。     

整合狂犬病病毒G蛋白的假病毒构建及应用

目的 构建表达狂犬病病毒(rabies virus, RABV)G蛋白的假病毒，为RABV中和抗体检测及疫苗的研发提供有效实验工具。方法 通过无缝克隆技术构建表达RABV G蛋白的假病毒p-RABV-G,通过抗体中和试验评估狂犬疫苗接种者体内的中和抗体水平。结果 成功在293T细胞内进行假病毒p-RABV-G的包装，p-RABV-G可以表达G蛋白，并能高效感染Huh7.5细胞。4位狂犬疫苗接种者21 d的血清对p-RABV-G的抑制效果处于最优水平，在1∶625倍数的稀释条件下对p-RABV-G的抑制率高达95.79%、98.26%、98.42%和98.88%。结论 成功构建表达RABV G蛋白的假病毒p-RABV-G可用于狂犬疫苗的开发与中和抗体的筛选。在狂犬疫苗接种后的111 d,本文调查的4位接种者中的其中3位体内血清仍可对p-RABV-G产生抑制效果。     

HIV-1假病毒应用的优势与弊端

HIV-1假病毒是携带一种外源性病毒包膜且仅能复制一代的病毒颗粒,其膜蛋白易于改造与检测,生物学过程易于量化、安全性高,不需要在BSL-3实验室进行研究,常用于研究HIV-1调节基因和功能、评估中和抗体、筛选抗病毒药物和疫苗以及HIV-1耐药性检测等。但HIV-1假病毒与野生型病毒之间存在必然的差异,在构建和表达过程中,HIV-1假病毒会存在复杂生物背景、质粒和转染试剂、细胞培养条件、产量和检测不均一等弊端,因此,有必要对HIV-1假病毒应用优势和弊端进行全面综述。     

整合禽流感病毒血凝素糖蛋白的假型鼠白血病病毒

本研究通过一个瞬时转染系统将H5N1亚型鹅源禽流感病毒囊膜表面的血凝素(HA)糖蛋白整合到鼠白血病病毒(MuLV)颗粒表面并进行了感染性测定。将包含HA基因的真核表达质粒pcDNA-HA与MuLV假病毒构建体系的两种质粒pHIT60(包括MuLV的结构蛋白基因,即gag和pol)和pHIT111(为MuLV的基因组,还包括一个报告基因LacZ)瞬时共转染转化了SV40大T抗原的人胚肾细胞293T,48小时后收集假病毒上清进行了一系列鉴定。将假病毒上清超速离心后用抗H5亚型禽流感病毒的多抗通过Western-blot证实HA 蛋白能够在此假病毒颗粒表面表达,表明HA能够整合到此病毒粒子表面。通过感染293T、COS 7和NIH3T3 三种不同的靶细胞,均能检测到LacZ基因的表达,证实所构建的假病毒粒子具有感染性。本研究成功构建了具有感染性的MuLV-HA假病毒,为研究鹅源禽流感病毒侵入细胞的机理及其组织嗜性的变异提供一种新方法。     

整合禽流感病毒血凝素糖蛋白的假型鼠白血病病毒

本研究通过一个瞬时转染系统将H5N1亚型鹅源禽流感病毒囊膜表面的血凝素(HA)糖蛋白整合到鼠白血病病毒(MuLV)颗粒表面并进行了感染性测定.将包含HA基因的真核表达质粒pcDNA-HA与MuLV假病毒构建体系的两种质粒pHIT60(包括MuLV的结构蛋白基因,即gag和pol)和pHIT111(为MuLV的基因组,还包括一个报告基因LacZ)瞬时共转染转化了SV40大T抗原的人胚肾细胞293T,48小时后收集假病毒上清进行了一系列鉴定.将假病毒上清超速离心后用抗H5亚型禽流感病毒的多抗通过Western-blot证实HA 蛋白能够在此假病毒颗粒表面表达,表明HA能够整合到此病毒粒子表面.通过感染293T、COS-7和NIH3T3三种不同的靶细胞,均能检测到LacZ基因的表达,证实所构建的假病毒粒子具有感染性.本研究成功构建了具有感染性的MuLV-HA假病毒,为研究鹅源禽流感病毒侵入细胞的机理及其组织嗜性的变异提供一种新方法.     

SARS-CoV假病毒中和试验技术的建立及评价

为避免传统的SARS病毒中和试验需要操作活毒而存在的生物安全隐患,建立了基于假病毒系统、操作较安全的SARS中和试验技术平台。本研究应用高效表达SARS-CoV S(密码子优化的全长S蛋白,简称S)的真核表达载体(pVRC8304),与HIV慢病毒包装质粒(p CMV△8.2)及转移质粒(pHR′CMV EGFP)3个质粒载体系统共同转染人胚肾细胞293T,包装了SARS假病毒;通过SARS假病毒感染的RD-A细胞中标记基因EGFP表达的分析,确定SARS假病毒能有效进入细胞,建立了可在BSL-2级实验室操作的SARS病毒中和试验技术平台。用该技术平台对不同免疫血清进行了中和抗体分析,并比较了基于假病毒和基于SARS活病毒的中和试验效果。结果显示:SARS假病毒和SARS活病毒两个中和试验系统获得中和抗体滴度变化趋势一致,表明本研究构建的SARS假病毒可替代SARS活病毒用于建立操作上安全的SARS病毒中和试验技术平台。     

埃博拉假病毒小鼠攻毒模型的建立与评估

埃博拉病毒具有极大的危险性,对其活病毒相关的操作必须严格限制在生物安全四级实验室（BSL-4）中,阻碍了疫苗和治疗药物的研发进程。本研究将扎伊尔埃博拉病毒（EBOV）膜表面糖蛋白（GP）表达质粒与携带荧光素酶报告基因的pNL4-3.Luc.R-E-慢病毒载体共转染至HEK293T细胞,包装HIV骨架的EBOV GP-Fluc假病毒颗粒,建立了BSL-2条件下基于假病毒和生物发光成像（BLI）技术的BALB/c小鼠EBOV感染模型,并通过不同给药时间、途径和抗体种类的系统评估对其可靠性进行了验证。腹腔注射包含GP全长的假病毒在第4d可检测到集中于胸腺部位的最大发光信号,测试抗体在预防性静脉给药时可完全阻断假病毒的感染,在暴露后腹腔给药时表现出与其在活病毒小鼠模型中一致的保护效力。该模型为埃博拉病毒以及类似烈性病原体防治药物研发提供了一种简单有效的前期筛选方案。     

逆转录病毒载体介导的HCV囊膜蛋白基因的表达及动物免疫试验

利用DNA重组技术将丙型肝炎病毒(HCV)H77株E1E2囊膜蛋白基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E1E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293T细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染SP2／0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明HCV ele2基因在SP2／0细胞膜上成功表达。将表达E1E2蛋白的SP2／0细胞腹腔免疫BALB／c小鼠,经FACS分析免疫鼠血清,成功诱导小鼠产生了抗HCV E1E2蛋白的抗体,Western blot表明该抗体能与原核系统表达的E2蛋白结合。     

逆转录病毒载体介导的HCV囊膜蛋白基因的表达及动物免疫试验

利用DNA重组技术将丙型肝炎病毒(HCV)H77株E1E2囊膜蛋白基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E1E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染法将其转入293T细胞中包装逆转录病毒假病毒.用包装的假病毒感染SP2/0细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析,结果表明HCV ele2基因在SP2/0细胞膜上成功表达.将表达E1E2蛋白的SP2/0细胞腹腔免疫BALB/c小鼠,经FACS分析免疫鼠血清,成功诱导小鼠产生了抗HCVE1E2蛋白的抗体,Western blot表明该抗体能与原核系统表达的E2蛋白结合.     

利用报告基因比较悬浮细胞与贴壁细胞对HIV-1假病毒感染效率的差异

【目的】研究用人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)-1假病毒感染带有β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)报告基因和HIV受体CD4+CCR5+的Tzmbl细胞,分析悬浮状态与贴壁状态对HIV-1假病毒感染Tzmbl细胞的影响,为进一步进行HIV生物学研究与中和抗体实验室评价提供实验基础。【方法】通过将pNL43 R-E-与编码HIV膜蛋白的质粒共转染293T细胞,收集上清,获得HIV假病毒。该假病毒感染悬浮的和贴壁的Tzmbl细胞后可表达β-gal报告蛋白,通过X-gal染色和仪器分析可测定表达β-gal报告基因的细胞数与细胞感染率。【结果】HIV假病毒感染悬浮细胞的效率高于其对贴壁的Tzmbl细胞感染的效率,且细胞的感染率的改变与病毒的型相关。【结论】该研究结果可为进一步利用具有单轮感染活性的HIV假病毒进行生物研究和中和抗体实验提供研究方法。     

一种非洲猪瘟病毒假病毒细胞感染模型的建立及应用

目前国内外大多数针对非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的研究须在生物安全三级实验室(biosafety level 3 laboratories, BSL-3 labs)中进行,因此针对该病毒的感染过程、中和抗体逃逸机制、药物研发等研究受到了一定限制。鉴于此,本研究选择ASFV包膜蛋白中与其进入细胞紧密相关的蛋白p12、CD2v、p30、p54和pE248R,构建表达这5种包膜蛋白的真核表达质粒,利用水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)假病毒包装体系,制备多种ASFV假病毒。以荧光素酶报告基因实验(luciferase assay)检测假病毒感染水平;选择1个包膜蛋白为代表,使用蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测其在假病毒中的表达情况;采用芫花素检测其对所建立的ASFV假病毒(p30-pE248R-ASFV-PsV)的抑制活性。结果显示,VSV包装体系以及p30、pE248R包膜蛋白质粒的组合制备方法所包装出的假病毒具有较优的感染活性,适合用于建立细胞感染模型。ASFV的包膜蛋白pE248R被有效整合到VSV-ΔG rLuc颗粒中,并包装出ASFV假病毒。芫花素可浓度依赖性地抑制ASFV假病毒感染Vero细胞,其半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC50)为4.05±0.88 μmol/L。本研究通过建立基于ASFV假病毒的细胞感染模型,筛选获得了1种可感染已报道的一些ASFV敏感细胞的假病毒。该假病毒无复制性,可在生物安全级别较低的实验室中进行操作,并且带有海肾荧光素酶报告基因,有望用于ASFV入侵抑制剂的高通量筛选及中和活性的初步评价,为研发抗ASFV药物提供了一个安全、方便的研究模型。     

高滴度感染力H5N1亚型禽流感病毒假病毒颗粒的制备

利用一个瞬时共转染系统,将H5N1亚型禽流感病毒的血凝素（Hemagglutinin,HA）蛋白与神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）蛋白整合到鼠白血病病毒假病毒颗粒表面,包装成表达HA与NA的假病毒颗粒,通过透射电子显微镜形态学观察、感染滴度分析、血凝试验和中和试验研究其生物学特性。研究获得了高滴度感染力的H5N1假病毒颗粒（H5N1 Pseudotyped particle,H5N1Pp）,H5N1Pp的感染力滴度为1E8 Pp/mL,形态、血凝活性及中和特性均与野生H5N1病毒相似,结果为H5N1病毒受体、HA与NA的功能、中和抗体、抗病毒药物开发研究的开展建立了平台。     

尼帕病毒融合蛋白和受体结合蛋白基因DNA免疫的研究

构建了表达哺乳动物密码子优化的NiV囊膜蛋白F和G基因的真核表达质粒pCAGG-NiV-F和pCAGG-NiV-G.细胞融合试验表明,重组NiV融合蛋白F和受体结合蛋白G在pCAGG-NiV-F、pCAGG-NiV-G共转染BHK细胞中获得表达,并具有良好生物学活性.真核表达质粒pCAGG-NiV-F、pCAGG-NiV-G和pCAGG-NiV-F pCAGG-NiV-G DNA分别按100μg/只的剂量肌肉注射免疫6周龄BALB/c小鼠,间隔4周加强免疫,第二次加强免疫3周后采血,分离血清备用.分别以重组杆状病毒感染Sf9细胞表达的重组NiV融合蛋白(rNF)和受体结合蛋白(rNG)为包被抗原,应用间接ELISA检测上述质粒DNA免疫血清中的特异性抗体,具有较高的敏感性和特异性.另外,中和试验结果表明,DNA免疫小鼠产生的特异抗体可有效中和NiV囊膜蛋白F和G介导的伪型VSV重组病毒侵入NiV易感宿主细胞的感染性,并且受体结合蛋白G基因DNA诱导中和抗体的滴度高于融合蛋白F基因DNA.结果表明,DNA疫苗具有防制尼帕病毒性脑炎的潜力.     

新型冠状病毒假病毒的制备及血浆中和抗体检测

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引发新型冠状病毒肺炎（COVID-19）全球大流行。由于SARS-CoV-2生物安全管理的要求,高效制备获得高滴度的新型冠状病毒假病毒对基于S蛋白研发疫苗、中和抗体、病毒入侵抑制剂药物以及人群血清学调查等十分重要。本研究基于慢病毒系统,对制备新型冠状病毒假病毒过程中的重要参数进行优化,用Western Blot检测假病毒S蛋白和p24蛋白的表达及假病毒包装情况,用荧光素酶报告系统检测假病毒感染入侵效率。利用制备好的假病毒对恢复期血浆的中和抗体水平进行检测。结果显示骨架质粒与野生型Spike质粒为2∶1比例,在转染后48h收集上清为SARS-CoV-2野生型假病毒包装的最佳条件。与野生型相比,恢复期血浆对四种突变株的中和抗体滴度均降低,对B.1.351株中和能力最弱,B.1.617.2株其次,重型患者恢复期血浆对野生型和突变株的中和抗体滴度高于轻型与普通型患者。本研究优化了新型冠状病毒假病毒包装的实验室条件,评估了COVID-19患者恢复期血浆对野生型及四种突变株的中和抗体水平,提示未来对突变株的免疫逃逸进一步加强监测的重要性。     

融合表达牛疱疹病毒1型VP22及猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5重组伪狂犬病毒TK-/gE-/VP22GP5+的构建

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive andrespiratory syndrome,PRRS)和伪狂犬病(pseudora-bies,PR)是两种严重危害养猪业的重要病毒性传染病。而引发PR的伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus,PRV)是构建基因工程疫苗优良的活病毒载体[1]。已有报道将表达猪瘟病毒(hog cholera virus,HCV)囊膜蛋白E1基因的重组PRV(rPRV)二价基因工程疫苗免疫猪后,能同时抵抗HCV和PRV的强毒攻击[2],显示了PRV作为活病毒载体的可行性和“一针防两病”的独特优点。由ORF5基因编码的囊膜糖蛋白GP5是猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive …     

基于流式细胞技术SARS-CoV-2假病毒中和试验方法的建立

严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)是新型冠状病毒肺炎感染（Coronavirus disease 2019, COVID-19）的致病病毒。面对此类高传播风险及高致病性病毒，常采用复制缺陷型假病毒替代活病毒用于疫苗及药物的抗病毒活性评估。本研究旨在建立了一种基于流式细胞技术（Flow cytometry, FCM）的高通量中和试验方法。使用HIV-1慢病毒骨架蛋白包装系统，将psPAX2、pLVXeGFP、SARS-CoV-2 S三质粒共转染HEK293T细胞，包装一种带增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein, eGFP）的假病毒。通过优化S蛋白密码子序列、采用S蛋白C-端氨基酸（Amino acids, AA）截短和包装时间的优化，确定了假病毒包装最适条件。包装假病毒的滴定采用293T-hACE2细胞作为感染靶细胞，经流式细胞仪测定eGFP荧光细胞比率即为感染假病毒细胞比率。采用包装的野生型（Wild type, WT...