斑马鱼TK1基因的克隆表达

目的:克隆斑马鱼TK1基因的cDNA序列,并在大肠杆菌中诱导表达,对其产物进行生物学活性鉴定。方法:采用RT-PCR和RACE方法,克隆TK1的cDNA全长序列。表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。表达蛋白利用镍离子柱纯化。结果:获得TK1基因的cDNA全长序列,编码一个分子量为26kD的蛋白。结论:TK1融合蛋白在28℃条件表现出比较高的生物学活性,达到0.45 U/mg。     

幽门螺杆菌肽脱甲酰基酶基因在大肠杆菌中的可溶性表达与活性检测

幽门螺杆菌肽脱甲酰基酶（PDF）的可溶性表达是基于PDF靶位新药筛选的前提。本研究在克隆肽脱甲酰基酶基因（螂后,构建了其融合表达载体pTrcHisB-def,并在不同宿主菌（大肠杆菌BL21、DH5a和JM109）中进行了诱导表达。结果显示,只有在BL21（DE3）中获可溶性表达,产物经纯化后具有肽脱甲酰基酶活性。以上研究为PDF特性分析及PDF抑制剂筛选奠定了基础。     

红球菌来源QsdA型N-酰基高丝氨酸内酯酶水产养殖饲用潜力分析

通过研究QsdA型N-酰基高丝氨酸内酯酶酶学性质来评估其饲用潜力。研究通过提取红球菌(Rhodococcus erythropolis)BLJF-1的基因组, 利用 PCR 技术克隆得到N-酰基高丝氨酸内酯酶基因qsdA-rh5。构建重组表达载体pET28a/qsdA-rh5转化大肠杆菌BL21(DE3), 筛选得到具有N-酰基高丝氨酸内酯酶活性的转化子即为重组菌株, 随后经Ni-NTA柱纯化得到的重组蛋白QsdA-RH5进行补充酶学性质的研究。结果表明, 克隆得到972 bp的目的基因。构建重组载体, 筛选得到重组菌株经诱导表达后得到具有N-酰基高丝氨酸内酯酶活性的目的蛋白即QsdA-RH5, 经分析表明, 该蛋白的理论分子量为36 kD, 属于金属依赖性水解酶PET超家族。酶学性质研究表明: 其最适作用 pH 为 8.0, 作用温度为 35℃, 在 pH 611内能够稳定的存在, 在1040℃, 酶活性能够维持在 80% 以上, 且该酶对多种金属离子、化合物具有很好的抗性。该融合蛋白具有较为专一的底物特异性, 只对没有取代基团的底物具有水解作用, 以C7-HSL 为底物时的Km值为0. 0125 mmol/L。实验经酶学性质研究表明, 该酶具有较为专一的底物特异性, 因此可具有针对性的控制外源性病原菌毒性效应对维护畜禽(水产)消化道健康方面具有一定的应用前景。       

拟南芥中柯浩体蛋白Atcoilin的克隆、表达及纯化

旨在制备柯浩体的标志蛋白——Atcoilin蛋白,利用pET-28a与目的基因构建重组表达质粒,经DNA测序证实插入序列与设计完全一致后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,产物用SDS-PAGE及Western blotting分析鉴定。通过分别改变IPTG的浓度、培养时间、培养温度等来优化Atcoilin蛋白的表达条件。表达出的重组蛋白经过镍柱、分子筛进行纯化。结果显示,原核表达载体pET28a-At1g13030成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,得到相应的重组蛋白经Western blotting鉴定正确。在IPTG浓度为0.7 mmol/L,18℃培养20 h的条件下,目的蛋白表达量最高。经过SDS-PAGE分析鉴定,过镍柱、分子筛后得到的重组蛋白纯度较高。     

B型肉毒毒素轻链的高效制备及活性鉴定

目的:在大肠杆菌中高效表达B型肉毒毒素轻链(BoNT/BLC)并纯化,研究其生物学活性。方法:根据报道的BoNT/B LC基因序列设计引物,从肉毒梭菌中扩增BoNT/BLC基因片段,将其克隆至原核表达载体pET-22b中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)Rosetta感受态细胞,构建重组大肠杆菌pET-22b BoNT/BLC/BL21(DE3)Rosetta,在20℃条件下用IPTG诱导目的蛋白表达,表达产物经His Trap FF柱纯化,用SDS-PAGE对目的蛋白进行鉴定,并利用相应底物对纯化产物进行生物活性分析。结果与结论:构建了重组大肠杆菌pET-22b BoNT/BLC/BL21(DE3)Rosetta,BoNT/BLC表达量达到了细菌总蛋白的30%左右,通过一步亲和纯化目的蛋白后经SDS-PAGE检测其纯度在95%以上,制备的重组LC的酶活略高于B型肉毒毒素全毒素,可作为试剂用于BoNT/BLC抑制剂高通量体外检测方法的研究。     

鸡γ干扰素的可溶性表达及纯化产物的抗病毒活性

【目的】克隆鸡γ-干扰素（chIFN-γ）基因,大肠杆菌表达及产物纯化与活性检测。【方法】通过RT-PCR方法用ConA刺激的20日龄SPF鸡的脾脏淋巴细胞中扩增出chIFN-γ成熟蛋白基因cDNA,克隆至原核表达载体pET-32a (+),构建重组表达质粒pET-32a (+)-chIFN-γ,在大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导表达,利用镍柱亲和层析法纯化可溶性蛋白,并进行SDS-PAGE、Western blot鉴定。利用MDCK-VSV系统测定抗病毒活性。【结果】克隆得到456 bp 的chIFN-γ成熟蛋白编码基因,大肠杆菌中成功表达chIFN-γ蛋白,分子量约为31.0 kDa,能与抗His的单克隆抗体和兔源多抗血清发生特异性反应。表达蛋白一部分形成包涵体,另一部分以可溶形式存在,可溶性蛋白经镍柱在天然条件下的纯化得率为3.0 mg/mL。生物学活性试验表明,1:32 稀释纯化的重组chIFN-γ （rchIFN-γ）孵育MDCK细胞后能抵抗100TCID50的VSV攻击。【结论】通过镍柱天然纯化获得的rchIFN-γ具有较好的抗病毒活性,为研制新型抗病毒干扰素制剂奠定基础。     

嗜热古菌S.solfataricus小热激蛋白基因的克隆及表达

目的:从嗜热古菌Sulfolobus solfataricus中克隆一种新的小热激蛋白SsHsp14.1的基因,并研究其表达和生物活性。方法:用PCR技术以S.solfataricus基因组为模板扩增得到目的基因序列片段,并将其克隆到pET-28a(+)中,转化到E coli BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,纯化后对产物进行生物活性测定。结果:从菌株S.solfataricus中克隆出目的基因,该基因的编码框由375个碱基组成,编码的蛋白质由124个氨基酸组成。含该质粒的大肠杆菌经诱导表达了一个与预期理论值相符的约14kDa的蛋白,利用亲和层析和凝胶柱分离纯化了重组蛋白。试验证明纯化后的重组SsHsp14.1具有分子伴侣活性,重组蛋白在体内表达时能提高E.coli细胞的耐热性。结论:成功克隆SsHsp14.1基因并表达出蛋白,并明确了其分子伴侣活性,为该热激蛋白的研究和应用奠定基础。     

CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶的表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 将肺炎克雷伯菌所产CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)进行表达、纯化及其多克隆抗体的制备.方法 将保存的重组质粒pET-28a(+)/CTX-M-3在大肠埃希菌BL21( DE3)中原核表达.IPTG诱导CTX-M-3融合蛋白表达,利用镍琼脂糖凝胶亲和柱层析纯化蛋白,用纯化的CTX-M-3型ESBLs酶蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体.结果 可溶性检测表明表达产物以可溶性形式(上清中)和包涵体形式(沉淀中)两种形式存在.通过蛋白表达条件的优化实验,SDS-PAGE电泳结果显示18℃,0.8 mmol/L IPTG诱导24 h的CTX-M-3重组蛋白的可溶性表达最佳.SDS-PAGE电泳和Western-blot检测表明获得纯化的重组32 kD蛋白.免疫获得的CTX-M-3型ESBLs酶蛋白抗血清的效价为1∶32.结论 pET-28a(+)/CTX-M-3表达载体在大肠埃希菌BL21( DE3)中表达,用His亲和层析柱纯化可获得高纯度可溶性的重组蛋白,成功制备了效价较高的抗CTX-M-3型ESBLs酶蛋白多克隆抗体.     

烟草曲茎病毒复制蛋白基因的原核表达和免疫定位

利用PCR方法从烟草曲茎病毒 (TbCSV)Y35分离物的病株中获得复制蛋白 (Rep)基因 ,将其克隆到原核表达载体pGEX 4T 1上获得重组质粒pGEX Y35Rep。重组质粒导入大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysS中 ,IPTG诱导表达后发现部分Rep融合蛋白以可溶性形式表达。利用GST Sepharose 4B亲和层析柱纯化了Rep的融合蛋白 ,免疫家兔获得Rep蛋白的抗体。对TbCSV侵染烟草中Rep蛋白的亚细胞分布研究发现 ,Rep蛋白主要分布于含有细胞核的组份中。利用免疫胶体金技术对感病烟草中Rep蛋白进行了定位 ,发现Rep蛋白存在于细胞核内     

金黄色葡萄球菌肠毒素 C2 的基因克隆、 表达及其生物学活性

利用 PCR 技术从金黄色葡萄球菌的基因组 DNA 中克隆 SEC2 全长基因, PCR 产物与 pGEM-T 载体连接,经测序证实后进行亚克隆,构建其表达载体 pET-28a-SEC2 ,在大肠杆菌 BL21(DE3) 中表达成熟重组蛋白 (rSEC2) , 纯化 rSEC2 蛋白并对其生物学活性进行研究 . 结果表明：成功克隆了 SEC2 全长基因,测序证实该基因共 717 bp ,编码 239 个氨基酸,与 GenBank 中收录的 SEC2 成熟蛋白质序列完全一致, SEC2 基因登录 GenBank(Accession number ： AY450554) ; 构建了 SEC2 的表达载体 pET-28a-SEC2 ,并在大肠杆菌 BL21(DE3) 中得到高效可溶性表达,可溶性的 rSEC2 经 Ni²⁺ 亲和层析纯化达到电泳纯,纯化的 rSEC2 蛋白经蛋白质印迹检测,并能有效刺激人外周血单个核细胞的增殖,被 rSEC2 刺激的外周血单个核细胞在体外对肿瘤细胞的生长有显著的抑制作用 .     

转录因子CTCF的克隆、表达及其抗体制备

用RT-PCR方法从HeLa细胞总RNA中扩增转录因子CTCF的cDNA序列,克隆至pGEM-TEasy载体上。将CTCF蛋白N段的编码序列亚克隆至pET22b( )载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并用镍柱进行亲和纯化。用纯化后的CTCFN段蛋白免疫家兔,获得CTCF的多克隆抗体,进而用于细胞内CTCF蛋白的免疫印迹检测。     

鲍曼不动杆菌铁蛋白的抗氧化功能研究

【目的】克隆鲍曼不动杆菌铁蛋白(Abferritin)基因,并研究其抗氧化功能。【方法】荧光定量PCR检测氧化应激下Abferritin基因的表达量,并将其基因克隆到表达载体p ET28a以构建重组质粒p ET28a-Abferritin,转化大肠杆菌BL21(DE3)得到重组菌BL/p ET28aAbferritin,IPTG诱导目的蛋白表达并利用镍柱亲和层析纯化该蛋白。比色法测定Abferritin蛋白的Fe2+氧化酶活性,自由基清除实验测定其抗氧化功能。菌落计数法观察重组大肠杆菌在H2O2应激条件下的存活率。【结果】Abferritin基因在氧化应激下表达增高。重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,通过Ni2+亲和层析纯化获得了Abferritin蛋白。该蛋白具有Fe2+氧化酶活性,能有效减少氧自由基的形成及提高大肠杆菌抵抗氧化应激的能力。【结论】氧化应激能诱导Abferritin基因表达上调,且该蛋白具有亚铁氧化酶活性和抗氧化功能。     

鸡贫血病毒凋亡素基因的可溶性融合表达及抗肿瘤活性分析

为获得高效可溶表达的鸡贫血病毒凋亡素基因(CAV-Apoptin),根据大肠杆菌密码子偏爱性优化CAV-Apoptin基因序列,将其连接到含msyB伴侣基因的pBCX载体上,转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,经SDS-PAGE鉴定后应用镍柱亲和层析纯化蛋白质,采用显微镜观察、CCK-8实验与DNA ladders测定其抗肿瘤细胞的活性。结果显示,成功构建大肠杆菌表达载体pBCX-CAV-Apoptin,在37℃正常培养条件下的大肠杆菌中得到大量可溶性表达产物,融合蛋白质分子量大小约为42 kDa,50 ml菌液即可获得1.5 mg左右的纯化重组蛋白,CCK-8实验结果显示纯化后的重组蛋白作用36 h后可对套氏淋巴瘤JEKO-1、REC-1细胞生长产生超过60%的抑制率;显微镜观察与DNA ladder实验证明重组蛋白可诱导JEKO-1、REC-1细胞的凋亡,对HUVEC没有诱导凋亡的作用。免疫印迹分析表明重组凋亡素对JEKO-1细胞诱导了Caspase-3的激活,而对Caspase-8的表达没有影响。研究表明融合蛋白msyB-CAV-Apoptin可达到高效可溶表达,且表达产物具有特异抗肿瘤活性。     

重组小鼠树突状细胞因子DCF1的原核表达和纯化

目的:克隆小鼠重组树突状细胞因子DCF1蛋白进行原核表达、纯化与鉴定.方法:采用PCR从小鼠脑cDNA克隆dcf1基因,构建DCF1原核表达重组质粒(pET30a-DCF1)并转化E.coli的BL21(DE3)菌株.IPTG诱导重组蛋白表达,并在变性条件下经Ni sepharose FF6亲和层析柱纯化,再通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定.结果:成功克隆到大小为972bp的小鼠源dcf1基因片段并准确插入表达载体pET30a,0.1 mmol/L IPTG诱导转化菌2h可表达大量的DCF1蛋白,并可经Ni Sepharose FF6柱亲和层析得到高度纯化.结论:成功获得纯化的42kDa重组小鼠DCF1蛋白,为后续进行DCF1蛋白功能研究奠定了基础.     

E.coli M15碱性磷酸酶的表达、纯化及活性分析

目的:克隆、表达并纯化大肠杆菌M15碱性磷酸酶(EAP)成熟肽(phoA),分析其活性.方法:采用PCR技术从M15基因组DNA中扩增出phoA编码基因;构建其原核表达载体pCold-TF-EAP;转入E.coli BL21(DE3)进行表达;IMAC Ni-NTA柱层析法纯化重组蛋白;重组蛋白与底物对硝基苯磷酸二钠显色反应分析其活性.结果:克隆得到了序列约1 400bp phoA编码基因,原核表达了分子量约为100 kDa的融合重组EAP(rEAP),纯化获得的rEAP具有催化磷酸单酯的活性,有效反应温度范围大,在27℃～67℃都具有较高的催化活性,在pH7.5 ～8.0间催化活性最高.结论:克隆了可正确表达EAP的phoA编码基因,为EAP的工业化生产及应用提供了生物材料.     

CD14蛋白表达、纯化及单克隆抗体制备

摘要 目的：制备CD14重组蛋白及抗CD14单克隆抗体。方法：从人外周血淋巴细胞中克隆CD14编码基因,将其连接至质粒pRSETC,构建表达质粒pRSETC/CD14,转染大肠杆菌表达菌株BL21(DE3),筛选阳性克隆、用IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测CD14蛋白表达水平,应用镍柱进行亲和纯化,SDS-PAGE及Western blot进行纯化产物鉴定。纯化后的CD14蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术筛选分泌单克隆抗体细胞株,制备单克隆抗体,利用Western blot鉴定抗体活性。结果：获得CD14编码基因,并成功进行了原核表达,SDS-PAGE显示CD14以包涵体形式表达,纯化产物的纯度超过95%。利用杂交瘤技术筛选出稳定分泌抗CD14抗体的细胞株,并制备了高纯度的单克隆抗体,抗体具有CD14蛋白结合活性。结论：成功表达纯化了CD14蛋白,并制备了抗CD14单克隆抗体,为后续开发CD14检测技术提供抗体。     

大鼠CRIP2蛋白的表达和分离纯化

目的:获得大鼠crip2基因片段,并在大肠杆菌中表达、纯化大鼠CRIP2(cysteine-rich intestinal protein 2)蛋白。方法:从大鼠主动脉组织中提取总DNA,RT-PCR扩增出相应大小的crip2 DNA片段,与pGEM-T-easy载体连接后测序;将测序正确的crip2按照BamHⅠ和HindⅢ酶切位点克隆入原核表达载体pRSET A,将连接产物转化大肠杆菌BL21,挑出阳性克隆,IPTG诱导表达重组的6×His融合蛋白,通过镍柱进行纯化。结果:PCR获得的crip2序列与GenBank报道的一致(为707 bp);重组融合蛋白在大肠杆菌BL21中以可溶形式高效表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析,在相对分子质量为27×103处有特异的蛋白条带,经镍柱纯化后,得到了高纯度的CRIP2融合蛋白。结论:克隆了大鼠crip2基因片段,并在大肠杆菌BL21中高效表达,亲和层析纯化后获得高纯度的CRIP2融合蛋白。     

A型肉毒毒素轻链的原核表达、纯化及活性鉴定

目的:在大肠杆菌中表达、纯化A型肉毒毒素轻链(Bo NT/A LC),研究其生物学活性。方法:根据Gen Bank中报道的Bo NT/A LC基因序列设计特异引物,从肉毒梭菌中扩增Bo NT/A LC基因片段,构建重组大肠杆菌p ET-32a Bo NT/A LC/BL21(DE3)Rosetta,IPTG诱导目的蛋白高效表达,表达产物经Ni螯合亲和层析纯化,SDS-PAGE鉴定目的蛋白,并利用相应底物对纯化产物进行生物活性分析和酶活动力学测定。结果与结论:构建了重组大肠杆菌p ET-32a Bo NT/A LC/BL21(DE3)Rosetta,原核表达获得高水平可溶性重组Bo NT/A LC,纯化得到纯度较高的蛋白质,重组Bo NT/A LC的酶活略高于A型肉毒毒素全毒素,可作为试剂用于Bo NT/A LC抑制剂高通量体外检测方法研究。     

人Hepassocin的原核可溶性表达与纯化

目的：构建人Hepassocin的原核表达载体,可溶性表达并纯化得到高纯度的重组人Hepassocino方法：将人Hepassocin基因克隆到原核表达载体pET40b（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,于28℃经0．1mmol／LIPTG诱导6h,表达Ds-bC-Hepassocin融合蛋白,经镍柱纯化可溶性融合蛋白,用肠激酶切除融合蛋白的DsbC-His标签,再用镍柱纯化分离酶切后的Hepassocin,通过超滤进一步纯化并浓缩,用Western blot验证纯化后的Hepassocin。结果：构建了pET40b-Hepassocin原核表达载体,经诱导表达、亲和层析和肠激酶切除融合标签,获得了相对分子质量约32000的可溶性高纯度蛋白,Western blot鉴定证实该蛋白为不含融合标签的重组人Hepassocin。结论：实现了人Hepassocin的原核可溶性表达,通过纯化获得了较高纯度的重组人Hepassocin,为制备其单克隆抗体,进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌B型肠毒素受体拮抗剂的原核表达、纯化及活性初步分析

目的:利用大肠杆菌表达葡萄球菌肠毒素B(SEB)的受体拮抗剂蛋白,检测其与SEB的结合能力,为今后利用其进行SEB快速检测奠定基础.方法:首先确定SEB受体拮抗荆的基因序列,然后将SEB受体拮抗剂质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导表达获得蛋白,产物经镍柱纯化后,ELISA鉴定其与SEB结合能力.结果:该质粒在大肠杆菌中获得表达,表达产物可与SEB特异性结合,两者结合能力可达ng/mL.结论:本研究成功对SEB受体拮抗剂进行了原核表达、纯化及初步活性分析.