QCM 监测自组装膜上心肌细胞黏附及其与心血管药物作用

目的:本试验采用石英晶体微天平(QCM)实时监测大鼠心肌细胞(H9C2)在含有细胞黏附识别多肽RGD自组装膜上的动态黏附过程及随后与两种心血管药物(一种正性肌力、另一种负性肌力)相互作用。方法:在金电极表面自组装3-巯基丙酸(MPA)单层膜,并经酰胺化共价耦合细胞黏附分子KRGD,形成对大鼠心肌细胞有特异性黏附的致密分子自组装膜。QCM以动态持续的方式实时监测MPA/RGD自组装及其不同浓度梯度H9C2细胞在自组装膜金电极上的细胞黏附过程。此外,选用20,000个H9C2细胞和正性肌力药物异丙肾上腺素、负性肌力药物维拉帕米,用QCM评估了细胞-心血管药物的相互作用。结果:与裸金电极相比,MPA/RGD修饰金电极增大了H9C2细胞黏附所引起的QCM频移(△f)与动态电阻变化(△R)响应。在所试H9C2浓度范围(5×10~4-4×10~5 cells/m L),△f与H9C2浓度呈线性关系,△R与H9C2浓度呈幂函数关系。我们用细胞粘弹性指数(CVI=△R/△f)来表征细胞的粘弹性。H9C2在异丙肾上腺素作用下,△f与△R增加、细胞-QCM表面黏附加强,细胞变硬;在维拉帕米作用下,△f与△R降低、细胞QCM表面黏附减弱,细胞变软。结论:QCM可用于不同浓度大鼠心肌细胞的动态细胞黏附监测,并可基于其细胞黏附与细胞黏弹性测定能力区分正性与负性肌力药物而可望用于心血管药物的筛选。     

人β防御素3 融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化与活性分析

近年来由于抗生素的不规范使用等多种原因,细菌耐药问题日益严重,人们正努力从各个方面来解决,其中机体天然产生的肽抗生素(peptide antibiotics)由于其对耐药菌的强大抗菌作用而受到人们的关注。肽抗生素是一种阳离子小分子多肽,在天然免疫和获得性免疫中都发挥着重要作用。防御素(defensin)是肽抗生素中较为重要的一种,主要来源于皮肤、呼吸道等的上皮组织,是正常机体抵抗外界病原微生物入侵的重要防线。人β-防御素3(human beta-defensin 3,hβD-3)参与人体免疫屏障,并因具有广谱抗菌和抗菌活性不被盐离子浓度抑制等特点而具特别的研究开发价值：提取中国人扁桃体组织总RNA,以RT-PCR技术扩增编码hβD-3成熟肽的cDNA并构建于原核表达载体pQE-80L,IPTG诱导表达后利用SDS-PAGE、免疫印记等方法对重组蛋白进行分析。重组蛋白表达量达到细菌表达总量的40％。重组蛋白自表达菌包涵体中提取后,经亲和层析法纯化目的蛋白达到电泳纯,经多步透析法复性,在体外抗菌实验中表现出了对金黄色葡萄球菌、多重耐药金黄色葡萄球菌等的抗菌活性,为进一步的研究和开发奠定了基础。     

肽基载体蛋白结构功能的研究进展

肽基载体蛋白(peptidyl carrier protein,PCP)是非核糖体肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetase,NRPS)的核心结构域。根据NRPS的装配机制,每个模块都至少包含一个PCP,PCP对于非核糖体肽合成中氨基酸残基及多肽在不同催化结构域中的传递起着重要作用,并为氨基酸残基和多肽向模块内其他修饰酶的转移提供一个平台。本文主要对PCP的结构功能、与其他催化结构域的相互作用及重组模块活性降低的问题等方面进行了综述,期望为重组NRPS模块的构建提供理论依据。     

人β防御素3 融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化与活性分析

近年来由于抗生素的不规范使用等多种原因,细菌耐药问题日益严重,人们正努力从各个方面来解决,其中机体天然产生的肽抗生素(peptide antibiotics)由于其对耐药菌的强大抗菌作用而受到人们的关注。肽抗生素是一种阳离子小分子多肽,在天然免疫和获得性免疫中都发挥着重要作用。防御素(defensin)是肽抗生素中较为重要的一种,主要来源于皮肤、呼吸道等的上皮组织,是正常机体抵抗外界病原微生物入侵的重要防线。人β防御素3(human betadefensin 3,hβD-3)参与人体免疫屏障,并因具有广谱抗菌和抗菌活性不被盐离子浓度抑制等特点而具特别的研究开发价值。提取中国人扁桃体组织总RNA,以RT-PCR技术扩增编码hβD-3成熟肽的cDNA并构建于原核表达载体pQE-80L,IPTG诱导表达后利用SDS-PAGE、免疫印记等方法对重组蛋白进行分析。重组蛋白表达量达到细菌表达总量的40%。重组蛋白自表达菌包涵体中提取后,经亲和层析法纯化目的蛋白达到电泳纯,经多步透析法复性,在体外抗菌实验中表现出了对金黄色葡萄球菌、多重耐药金黄色葡萄球菌等的抗菌活性,为进一步的研究和开发奠定了基础。     

重组人骨形成蛋白-3成熟肽的表达、纯化及诱骨活性的研究*

推测人骨形成蛋白-3羧基端的127氨基酸的肽段为其成熟肽(hRMP 3m)。将编码此成熟肽的cDNA插入含PL启动子的表达质粒pDH中,构建表达质粒pDH-B-3m,转化大肠杆菌DH5α。42℃热诱导6h后表达量达到最高水平,约占菌体总蛋白28％;表达产物以包涵体形式存在。包涵体经分离和洗涤后．溶解于尿素,在变性溶解状态下经阳离子交换层析,目的蛋白纯度至少在95％以上。再经稀释复性。然后将纯化、复性的重组人骨形成蛋白3成熟肽(rhBMP－3m)植入小鼠肌肉间隙,于不同时间取材观察,在局部可见典型的软骨形成、软骨内成骨以及骨组织形成的过程,证实所制备的rhBMP－3m具有明显的异位诱骨活性。     

B型肉毒毒素重链抗原表位的预测及表位合成肽抗原性的检测

目的:预测B型肉毒毒素蛋白抗原表位,研究表位合成肽的生物学活性。方法:利用生物信息学,结合Anthwine分析软件及网络平台,预测B型肉毒毒素蛋白重链的B细胞抗原表位。人工合成4条(P1,P2,P3,P4)表位多肽,与抗B型肉毒毒素类毒素的马血清反应;采用腹腔注射的方式用合成肽免疫BALB/c小鼠,检测免疫血清与合成肽的结合;对免疫小鼠腹腔注射B型肉毒毒素。结果:合成的多肽能与抗B型肉毒毒素的类毒素的马血清结合;多肽免疫小鼠后能产生针对多肽的抗体,其中P1、P3、P4产生的抗体对受毒素攻击的小鼠具有保护作用。结论:成功预测了抗原表位,合成的表位多肽具有较好的抗原性。     

多肽向叶绿体的输入

绝大部分的叶绿体蛋白组份是在细胞器外合成后输入叶绿体的。它们是以含氨基端延长肽的前体形式合成的。近来的实验已证明,外源多肽与这些氨基端延长肽融合后也能被输入到叶绿体内,从而为利用遗传操作的方法改良重要的经济植物提供了令人兴奋的可能途径。 和线粒体一样,叶绿体也含有自己的遗传信息并足以进行蛋白质合成,但大多数的叶绿体蛋白是核DNA编码并在叶绿体外的细胞质核糖体上合成的(见参考文献1的综述)。实际上,叶细胞质蛋白合成的主要产物是叶绿体蛋白质的两种多肽组份即核糖-1,5-二磷酸羧化酶(rbe S)的小亚基和光捕获叶绿素a/b蛋白复合体(CAB)的组成多肽。在本篇综述中,我们将讨论目前已知的关于细胞质合成多肽输入叶绿体的机理以及最近一些证明外源多肽输入叶绿体的实验;另外还将讨论这种使外源多肽输入叶绿体能力的可能应用。     

TRBP2基因过表达对肺腺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭的影响及可能机制

该文探讨了TAR RNA结合蛋白2(TAR RNA binding protein 2,TRBP2)基因对肺腺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭的影响及可能机制。构建TRBP2慢病毒过表达载体,以不同感染复数(MOI)感染A549细胞,根据绿色荧光强度选择最适MOI值。荧光定量PCR(FQ-PCR)检测TRBP2、MMP-2(matrix metalloproteinase-2)、PKR(double-stranded RNA-dependent protein kinase)m RNA的表达量。免疫蛋白印记(Western blot)法检测TRBP2、MMP-2、PKR、p-PKR的表达。采用MTT法、平板克隆实验检测TRBP2基因对A549细胞增殖的影响,Transwell迁移及侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力,黏附实验检测同种细胞和异种细胞间黏附情况。结果发现,成功构建了TRBP2基因过表达的A549细胞株,与空载体组和对照组比较,TRBP2基因过表达组细胞侵袭、迁移能力明显增强(P0.05),同种细胞间黏附力减弱(P0.05)而异种细胞间黏附力增强(P0.05),增殖速度加快(P0.05)及克隆形成率增加(P0.05)。此外,MMP-2、TRBP2蛋白及m RNA表达量明显升高(P0.05);p-PKR蛋白表达量降低(P0.05);PKR蛋白及m RNA表达量无差异。对照组与空载体组之间比较,以上各项指标均没有明显差异(P0.05)。该研究表明,过表达TRBP2基因可能通过促进MMP-2的表达同时抑制PKR磷酸化来促进肺腺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭。     

丙型肝炎病毒核壳蛋白抗原的化学合成及其在血清学诊断中的应用

选取丙型肝炎病毒(HCV)核壳蛋白区两个可能含有优势抗原表位的19和16氨基酸的肽殴(C-19肽和C-16肽),利用固相多肽合成技术进行了化学合成。经用反相高压液相层析(HPLC)及脉冲液相多肽测序技术检定合成肽产品的纯度及序列后,以C-19和C-16肽作为包被抗原组装成检测HCV血清抗体的ELISA诊断试剂。用所组装的合成肽试剂检测中国药品生物制品检定所提供的HCV标准参比血清,并比较利用该试剂和美国Abbott实验室生产的HCV第二代EIA诊断试剂平行检测109份献血员血清的结果,表明C-19肽能够特异、重复、灵敏地检出HCV血清抗体,可以作为我国第一代HCV诊断试剂的合成肽抗原。     

类人胶原蛋白-丝素蛋白血管支架的制备及性能表征

为了提高血管支架的力学性能,将生物相容性良好的新型生物材料类人胶原蛋白(基因工程技术、高密度发酵生产)与丝素蛋白以质量比9:1、7:3、5:5复合,采用真空冷冻方法制备管状血管支架。研究了不同配比血管支架材料的表面结构、表面元素组成、力学性能、降解和生物相容性。结果表明:当类人胶原蛋白与丝素蛋白的质量比为7:3混合时,类人胶原蛋白-丝素蛋白管状支架具有均匀的多孔结构,孔径为(60±5)μm,孔隙率达到85%以上;获得了较理想的力学性能:应变为50%±5%,应力为(332±16)kPa;具有相对慢的降解速率;提高了细胞的黏附与增殖,具有良好的生物相容性。     

马尔堡病毒GP蛋白C肽的抑制活性及作用机理研究

目的:研究马尔堡病毒(MARV)包膜糖蛋白(GP)C肽的抗该病毒进入活性及初步作用机制。方法:选取MARV的GP2蛋白上CHR区域序列(611～637残基),合成该序列多肽(C肽)及突变体,利用pVAX1-MGP与pNL-4.3-Luc-R-E-质粒包装假病毒体系,测定各肽对马尔堡假病毒融合的抑制活性,利用圆二色谱、凝胶色谱分析C肽及其突变体对MARV的N肽的相互作用。结果:C肽对马尔堡假病毒融合抑制的IC_(50)为32.67μmol/L,C肽突变体的IC_(50)为9.61～33.47μmol/L,抑制活性高于C肽或与其相当;C肽与N肽形成双螺旋结构,在C肽的7元螺旋体的b、f、c、g位引入离子相互作用氨基酸可提高多肽本身的α螺旋结构含量,一些突变可提高复合物的α螺旋结构含量,但C肽与N肽混合后形成的复合物含量不高。结论:MARV的GP蛋白C肽与N肽相互作用较弱,C肽的抗病毒活性较弱,但改造后可提高活性。     

百日咳杆菌粘附素对猪源支气管败血波氏杆菌的保护性抗原的筛选

摘要：【目的】本研究通过百日咳杆菌黏附素(PRN)基因的分段克隆表达及其在BALB/c小鼠的主动和被动免疫保护试验筛选PRN中的保护性抗原肽。【方法和结果】利用大肠杆菌进行PRN的完整蛋白、N端和C端多肽及其RI和RII区域多肽（双拷贝）的表达,命名为GST-PRN、GST-PN、GST-PC、GST-2PRI和GST-2PRII。Western blot检测证实5种表达产物均具有良好的反应原性。在主动免疫保护试验中,5种表达产物均能诱导小鼠产生较高的PRN抗体水平;当使用3 LD50的支气管败血波氏杆菌     

厚壳贻贝低分子量足丝蛋白的初步鉴定(英文)

足丝蛋白是贻贝科(Mytilidae)所特有一种在水环境中也能表现出强黏附功能的蛋白,也是目前开发新型生物黏附剂的主要候选分子。厚壳贻贝(Mytilus coruscus)广泛分布于我国东部沿海,是我国具有重要经济价值的贻贝,其足丝粗硬,黏附力强,关于厚壳贻贝的足丝蛋白的研究目前尚未见报道。通过醋酸抽提结合反相高效液相色谱分离,从厚壳贻贝足丝盘中分离纯化到数种低分子量足丝蛋白,经质谱鉴定和氨基酸序列测定,其中三种足丝蛋白(分子量6 kD左右)属于贻贝足丝蛋白-3(mytilus foot protein-3,mfp-3)家族,且序列中富含DOPA,另有三种足丝蛋白为未知新型足丝蛋白。石英晶体微天平分析表明,厚壳贻贝低分子量足丝蛋白在金表面有较强的吸附能力,这与其黏附功能是直接相关的。以上工作为深入了解厚壳贻贝低分子量足丝蛋白的分子多样性以及黏附机制奠定了基础。     

乳酸杆菌S-层蛋白对鼠伤寒沙门氏菌黏附及入侵Caco-2细胞的拮抗作用

【目的】对嗜酸乳杆菌的S-层蛋白(S-layer protein)进行提纯,研究嗜酸乳酸杆菌和S-层蛋白对鼠伤寒沙门氏菌黏附和入侵的拮抗作用。【方法】应用阴离子交换柱(DE52)对嗜酸乳酸杆菌的S-层蛋白进行提纯,然后分别研究了嗜酸乳酸杆菌和S-层蛋白对鼠伤寒沙门氏菌黏附及入侵Caco-2细胞的作用。【结果】S-层蛋白能显著地抑制鼠伤寒沙门氏菌的黏附及入侵;在竞争、排斥、置换3种黏附试验中,S-层蛋白可显著降低鼠伤寒沙门氏菌的黏附,其相对黏附力分别为1.17%±5.97%、8.71%±1.36%、10.56%±0.92%,差异极显著(p0.01),其中竞争试验效果最好;并且S-层蛋白对鼠伤寒沙门氏菌黏附抑制作用极显著高于嗜酸乳酸杆菌(p0.01);此外,S-层蛋白也能显著抑制鼠伤寒沙门氏菌入侵。【结论】乳酸杆菌S-层蛋白对鼠伤寒沙门氏菌可产生显著的拮抗作用,这可能与S-层蛋白和鼠伤寒沙门氏菌的宿主黏附受体存在竞争作用有关;提示乳酸杆菌S-层蛋白可用于预防和治疗鼠伤寒沙门氏菌感染,并有望成为抗生素的替代品。     

重组人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白的生物学活性检测

目的：评价原核表达、纯化的6×His-硫氧还蛋白（TRX）一人肿瘤坏死因子α（TNFα）抑制肽-C端抗炎酸性尾巴融合蛋白的生物学功能。方法：在大肠杆菌中分别表达带His标签的TRX对照蛋白及TRX蛋白融合的人TNFα抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白,并对2种蛋白进行N^2＋金属螯合层析纯化,采用MTT法检测纯化后的蛋白及化学合成多肽抑制TNFα标准品对L929细胞的细胞毒活性。结果：与对照蛋白相比,融合蛋白人TNFα抑制肽-C端抗炎酸性尾巴及合成多肽均能拮抗TNFα标准品对L929细胞的细胞毒作用。结论：融合蛋白人TNFα抑制肽-C端抗炎酸性尾巴及合成肽均能有效拮抗TNFα的生物学作用,为今后发展抑制TNFα为主的抗炎生物药物奠定了基础。     

HIV-1辅助蛋白Vpr多肽抗体的制备与鉴定

预测Vpr蛋白的B细胞抗原表位,并利用合成的B细胞表位肽制备Vpr特异性抗体。应用生物信息学技术获得Vpr蛋白共享氨基酸序列并预测其潜在B细胞抗原表位,与载体蛋白血蓝蛋白(KLH)偶联合成多肽并免疫家兔,鉴定及纯化获得的多肽特异性抗体。软件预测显示,Vpr蛋白N端的第3～19位(N)和C端的第82～95位(C)氨基酸序列为潜在B细胞抗原表位;ELISA检测抗血清中多肽特异性抗体的效价都达到1:105以上;Western-Blotting结果显示,无论对HIV-1B亚型还是CRF07_BC重组型的Vpr蛋白,其多肽N抗体和C抗体均能特异性识别;免疫沉淀结果显示,Vpr多肽N和C抗体也能特异性结合未变性的野生型Vpr或GFP-Vpr融合蛋白。利用生物信息学技术能成功预测Vpr蛋白B细胞抗原表位,免疫所获得的抗体具有较好的特异性和应用性。     

肽类合成服务

中国人民解放军总医院 ( 3 0 1医院 )建立的肽类合成室为满足社会各单位、科研院所的科研和开发的需要 ,公开向全社会提供肽类合成服务。该肽类合成室位于北京市复兴路 2 8号中国人民解放军总医院内 (地铁五棵松站 ) ,该室由多位留美资深专业从事肽类合成的学者组成 ,并配备有国际最先进的ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ出品的Ｓｙｍｐｈｏｎｙ 1 2通道肽类自动合成仪、半制备型高效液相色谱、冷冻干燥仪等与多肽合成和检测相关的先进仪器和设备。可按照客户的需求合成多肽序列片段、肽库及肽类修饰产品 ,接受委托加工。每条…     

狂犬病病毒CVS-11核蛋白B细胞线性抗原表位研究

为阐明狂犬病病毒CVS-11核蛋白B细胞线性抗原表位,本研究通过合成肽模拟B细胞线性抗原表位,采用免疫学方法对生物信息学分析获得的狂犬病病毒CVS-11核蛋白潜在B细胞线性抗原表位进行验证。结果显示,狂犬病病毒CVS-11核蛋白355~369、385~400位氨基酸序列合成肽免疫小鼠血清经间接酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测抗多肽抗体效价达到1∶12 800以上;抗多肽抗体在免疫印迹试验(Western blot,WB)中识别变性狂犬病病毒CVS-11核蛋白抗原,在间接荧光抗体试验(Indirect fluorescent antibody,IFA)中识别感染BHK-21细胞的狂犬病病毒CVS-11核蛋白抗原。因此,狂犬病病毒CVS-11核蛋白355~369、385~400位氨基酸序列经证实为B细胞线性抗原表位。     

一种靶向性阳离子多肽载体的表达纯化

目的：原核表达靶向性阳离子多肽(KH)20-EGF,并对其DNA包装能力进行检验。方法：构建pET28a-(KH)20-EGF 原核表达载体。进行酶切和测序鉴定。转化BL21（DE3）后,经过IPTG诱导表达和NTA树脂纯化得到粗提蛋白产物,SDS-PAGE和Western blot鉴定后,将蛋白与质粒DNA混合,用于凝胶阻滞实验分析。结果：重组(KH)20-EGF的产量约为300μg/L。SDS-PAGE和Western blot表明该蛋白的凝胶迁移有些滞后;凝胶阻滞试验发现(KH)20-EGF对质粒DNA的迁移有阻滞作用。结论：成功表达非病毒载体(KH)20-EGF并确认其DNA包装能力。     

人呼吸道合胞病毒G蛋白在大肠杆菌中的表达及联合不同新型佐剂免疫效果的研究

人呼吸道合胞病毒（Human respiratory syncytial virus, hRSV）是导致5岁以下儿童和老人住院和死亡的主要原因。hRSV囊膜表面的融合蛋白F(Fusion protein, F)和吸附蛋白G(Attachment protein, G)均能诱导产生保护性中和抗体,但目前临床研究主要集中于F蛋白的亚单位疫苗及保护性单抗的研发,对G蛋白的研究较少。虽然G蛋白的高度糖基化导致其免疫原性较差,但使用佐剂能改善G蛋白的免疫效果。本研究利用大肠杆菌成功表达了hRSVA-Long株G蛋白膜外区67～298氨基酸（命名为REG）,并探索了REG与四种不同组合形式的新型佐剂联合免疫BALB/c小鼠的免疫效果：BFA03佐剂、B型CpG OND混合磷酸铝佐剂组合、C型CpG OND混合磷酸铝佐剂组合、BALB/c小鼠CD4+T细胞表位肽混合C型CpG OND和磷酸铝佐剂组合。对每只小鼠大腿肌肉多点注射100μL免疫原,初次免疫后第28天进行加强免疫。实验结果表明,接种REG联合新型BFA03佐剂的小鼠体内诱导产生结合抗体的能力最强,且其与接种REG蛋白联合B型CpG OND...