灵芝EIM-40漆酶的分离纯化及酶学性质

采用冻干浓缩、（NH4）2S04盐析、HiTrapphenyl（FF）疏水层析和QSepharose FastFlow离子交换层析对灵芝EIM-40发酵液进行分离纯化,获得纯化漆酶,纯化倍数为14．6,回收率为5．3％。SDS-PAGE银染的结果为单一条带,相对分子质量约为6．53×104。以愈创木酚和2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）为催化底物进行酶学性质研究,最适pH分别为4．8和4．5,最适温度分别为55和50℃,2种底物在pH4．0。5．0范围内,温度低于50℃时,酶的稳定性都很好。以愈创木酚为底物,Km=645．0umol／L;以ABTS为底物,Km=22．2txmol／L。Cu2＋对该酶起激活作用,Fe2＋、Ca2＋、Ba2＋则完全抑制酶的活性。     

担子菌漆酶的分离纯化及其性质研究

采用硫酸铵盐析、DEAE纤维素柱层析、Phenyl SepharoseTM6 Fast Flow疏水柱层析等方法,得到电泳纯的漆酶同工酶Lac1,纯化倍数为318.4,活力回收率为18.6％。用SDSPAGE测得该酶分子量为60.3kD,而经质谱分析为55.94kD。最适反应温度为65℃,最适反应pH值为2.2～2.8,酶的等电点pI（室温）为4.02,其N末端序列为AIGPVTDL,用硫酸酚法测得其含糖量为49.2％。25℃条件下,以ABTS(2,2'azinobis(3ethylbenzthiazoline6sulphonate)为底物的Km为17.5μmol/L。该酶在45℃,pH3.0～9.5较稳定。Cu^2＋对酶活有明显的促进作用,Fe^2＋完全抑制酶的活性,Mn^2＋和Ag^＋对酶活无明显影响。DTT（Dithiothreitol,二硫苏糖醇）和NaN3完全抑制酶的活性。Koshland试剂对漆酶的活力影响比较大,色氨酸可能是酶活力的必需基团。     

毛栓菌漆酶的分离纯化及酶学性质研究

对毛栓菌产漆酶的分离、纯化及酶学性质进行研究。粗酶液经硫酸铵盐析、透析、DEAE-Sepharose柱层析,得到2种漆酶同工酶LacA和LacB。LacA和LacB回收率分别为17.1%和2.74%。SDS-PAGE电泳测得2漆酶的分子量分别为54.6 ku和7.7 ku;LacA和LacB最适作用温度分别为50℃和60℃;最适反应pH值分别为4.5和4.0;Cu2＋、Mg2＋对LacA有激活作用,对LacB影响不大;Ag＋对LacA和LacB表现为完全抑制;Fe3＋对LacA和LacB有一定的抑制作用;Ca2＋、Mn2＋、K＋、Na＋、Zn2＋对LacA和LacB影响不大。DTT、EDTA、DMSO、SDS对酶均有不同程度的抑制作用,且随其浓度的升高抑制作用增强。     

黏细菌漆酶序列筛选及其重组酶酶学性质

漆酶是一种应用广泛的绿色环保的多酚氧化酶。漆酶过去被认为广泛存在于植物、昆虫和真菌中,而近年来,越来越多的细菌中也发现了漆酶的存在。黏细菌是一类重要的资源菌,但与一般细菌相比,较难分离和纯化。文中利用生物信息学的方法,综合应用Blast和隐马尔可夫模型方法对黏细菌蛋白质组数据库进行搜索,并根据多铜氧化酶的保守铜离子结合位点进行进一步筛选,获得30个候选黏细菌漆酶序列。挑选其中9个,在大肠杆菌中进行重组表达。利用2,6-甲氧基苯酚(DMP)等常用漆酶底物检测重组酶的催化氧化活性,其中7个重组蛋白具有漆酶催化活性。选择1个对2,6-甲氧基苯酚(DMP)具有较高氧化活性的重组酶(命名为rSC-2),通过Ni-NTA亲和层析柱纯化rSC-2,测试其酶学性质。纯化的rSC-2蛋白分子量约57 kDa,在最适反应条件下,rSC-2催化DMP反应的比酶活为0.27 U/mg。催化DMP反应的最适温度为60℃,最适pH为7.0。rSC-2在pH 7.0-8.0有较高酶活,在60℃孵育1 h保留50%以上剩余酶活。低浓度的Ca~(2+)对酶活有一定的促进作用,而较高浓度的Fe~(3+)、Co~(2+)、Ba~(2+)对酶活的抑制作用较明显。这是首次对黏细菌漆酶序列进行系统性的生物信息学分析,并实现纤维堆囊菌Sorangium cellulosum序列来源的漆酶活性蛋白在大肠杆菌细胞中重组表达。     

一色齿毛菌漆酶LacT-1的分离纯化与性质研究

漆酶可以与多种底物反应,具有广阔的应用前景,但不同漆酶其性质有一定差异.本文研究的漆酶,由一色齿毛菌(Cerrena unicolor)发酵上清经过(NH4)2SO4沉淀、疏水层析(phenyl sepharose)、离子交换层析(DEAE sepharose)和凝胶层析(TSK gel G2000SWxl)纯化得到,...     

白腐菌产漆酶的纯化及部分酶学性质

对白腐菌W 1产生的漆酶粗酶液通过超滤浓缩、分子筛和离子交换层析进行纯化 .用SDS PAGE证明该酶的分子量大约为 6 2 4kD .等电聚焦电泳显示该酶的等电点为 3 5 .酶反应的最适温度为 5 0℃ ,最适pH值为 4 5 .此酶氧化DMP的Km 值为 3 84× 10 -5mol L .金属离子对酶活的影响很大 ,其中K+ 、Mn2 + 、Ag+ 对酶活有促进作用 ,Fe2 + 、Fe3 + 、Hg2 + 、Co2 + 、Ba2 + 等对酶活有明显的抑制作用 .酶对部分染料也有一定的脱色效果     

白腐真菌SYBC-L2漆酶的分离纯化及其在毛纺染料脱色中的应用

经过硫酸铵分级盐析、DEAE-cellulose离子交换层析、SephacrylTMS-200柱层析,从白腐菌株Phellinus sp. SYBC-L2所产的漆酶中纯化得到电泳纯漆酶Lac3,其纯化倍数为28.27,回收率为14.76%.Lac3为一种糖蛋白,糖含量29.66%,SDS-PAGE表观分子量约为64.3 kD;其催化氧化DMP(2,6-Dimethoxyphenol)的表观Km值和Vmax分别为1.01 mmol/L和186.2 U/mg蛋白.Lac3的最适温度为60℃,最适pH为3.5;在30℃～50℃和pH 4.5～9.0范围内稳定.Cu2+、SO42-、CO32-对Lac3具有一定促进作用,而Fe3+、Fe2+、NO3-则具有抑制作用.色素的最佳脱色条件为(Lac3终浓度为2 U/ml):媒介元PV在温度50 ℃、pH值3.0的条件下反应2 h,脱色率可达95.10%;弱酸蓝在温度40 ℃、pH值4.0的条件下作用3 h,脱色率为75.09%.     

白腐真菌漆酶的纯化及性质

液体发酵培养白腐真菌F9,粗酶液经盐析、透析浓缩、葡聚糖G-100柱层析、DEAE-纤维素离子交换层析四步分离纯化,得电泳纯漆酶。经SDS-PAGE法测定酶的相对分子质量约为6×104,酶活回收率达46.47%,纯度提高了18.86倍。F9漆酶最适反应温度为40℃,最适反应pH为4.8,在35℃以下、pH 4.8～5.4的范围内稳定性较强。其催化愈创木酚的Km为4.61 mmol/L,vm为6.27 mmol/(L.min)。K+对其有激活作用,而Fe2+、Fe3+对其有明显抑制作用。     

黑木耳漆酶纯化的研究

目的:研究黑木耳(Auricularia auricula)“黑29”的漆酶纯化,为进一步酶学性质的开展、酶应用和酶基因克隆提供理论基础。方法:采用硫酸铵分级沉淀和柱层析技术分离蛋白,通过PAGE和SDS-PAGE电泳检测蛋白。结果:SDS-PAGE电泳检测发现粗酶液含三种漆酶,分子量大小分别为LacA(60kD)、LacB(34kD)、LacC(19kD);纯化后获得纯化的单一漆酶LacA、LacC组分。结论:得漆酶两个单一组分,为进一步漆酶研究奠定基础。     

多孔菌Polyporus W38漆酶的纯化及性质研究

对多孔菌 (PolyporusW 38)漆酶进行了硫酸铵盐析、半透膜透析、SephadexG75及SephadexG2 5柱层析纯化 ,并研究了漆酶的产酶曲线及酶作用最适条件。结果表明在该培养条件下 ,多孔菌第 9d达产酶高峰 ,峰值酶活为 412u/mL ,酶作用的最适pH值为 4.2 ,最适酶解温度为 2 5℃ ,Mg2 +,Mn2 +对漆酶有激活作用 ,而Ag+,Fe3 +和Cl-则能明显抑制漆酶活性。     

白灵侧耳栽培种质对高温胁迫的反应研究

本文以“中农一号”、“华杂13”、“中农翅鲍”和“CCMSSC 00488”4个白灵侧耳菌株为材料,通过测定高温胁迫下菌丝体内硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid-reactive substances,TBARS）和蛋白质羰基（protein carbonyl,PCO）含量,观察适温培养和高温胁迫后恢复培养时菌落的生长速率、生长势和菌丝形态特征,研究不同白灵侧耳栽培种质对高温胁迫的反应。研究表明,白灵侧耳不同栽培种质对高温胁迫的反应在氧化损伤程度、菌落形态和菌丝形态特征上都有变化,不同材料的高温伤害程度有着较显著的差异。4个材料高温胁迫条件下TBARS和PCO含量均显著升高,但是升高程度不同,按照TBARS和PCO含量多少排序,依次为CCMSSC 00488>华杂13>中农翅鲍>中农一号。高温胁迫处理后恢复生长需要的时间依次为：CCMSSC 00488>华杂13>中农翅鲍、中农一号;菌落生长势：中农一号>中农翅鲍=华杂13>CCMSSC 00488;菌丝形态特征：菌丝表面增长率、菌丝顶端细胞表面积、菌丝直径和菌丝体分支频率均显著降低,但降低程度以中农一号为最大。菌丝体分支频率与菌落生长势相对应。     

刺芹侧耳产漆酶条件优化及对偶氮染料甲基橙的脱色

漆酶是一种含铜的单电子多酚氧化酶,能够催化氧化各种酚类及多种染料,在处理染料废水方面具有巨大的潜力。刺芹侧耳Pleurotus eryngii具有较强的产漆酶能力,但漆酶产量在较大程度上受环境条件限制。本文研究了氮源含量、pH、温度、金属离子等环境条件对刺芹侧耳产漆酶能力的影响,优化了其产漆酶条件,并用其粗酶液对典型偶氮类染料甲基橙进行脱色,结果表明,在氮源0.5%（W/W）、pH 5.5、温度28℃、添加5.0mmol/L Mg ²⁺的培养条件下,刺芹侧耳产漆酶能力最强,培养6d时,漆酶酶活可达78.0U/L。用优化培养的刺芹侧耳粗酶液对偶氮染料甲基橙进行脱色,28h后脱色率可达90%,脱色反应为准一级动力学反应,甲基橙并未完全矿化,而是生成小分子中间产物。     

外源一氧化氮提高白灵侧耳菌丝耐热性生化途径分析

为了探索外源一氧化氮（NO）提高食用菌菌丝体耐热性的生化途径,以白灵侧耳Pleurotus eryngii var. tuoliensis菌株CCMSSC 00489为材料,通过测定高温胁迫下外源添加硝普钠（sodium nitroprusside,SNP,NO供体）后,菌丝体内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GR）和过氧化物酶（POD）等4个抗氧化酶活性的变化,研究外源NO在高温胁迫响应中对抗氧化酶的影响。试验表明,高温胁迫致使菌丝体内TBARS含量升高,膜脂过氧化加剧。在正常温度培养（CK）下,外源添加SNP无显著缓解膜脂过氧化的效果,而高温胁迫条件下缓解效果显著,高温胁迫6h和12h,TBARS含量较对照（未添加）分别下降31.5%和25%。研究表明,抗氧化酶类对外源NO的响应不同。在有外源添加SNP的高温胁迫条件下,菌丝体内的SOD、CAT和GR活性随处理时间的延长而显著增强,在处理72h达到最高,分别是对照（0h）的1.73、7.29和4.95倍。其中CAT是高温胁迫响应的主要抗氧化酶类,其活力可以mmol/L·min^-1·mg^-1 of protein计量,而其他种类的活力均仅以μmol/L·min^-1·mg^-1 of protein计量。在试验条件下,这些抗氧化酶类活性的提高与TBARS含量的降低相呼应,表明外源NO通过提高SOD、CAT、GR的活性降低高温胁迫下的活性氧水平,缓解其氧化损伤,提高菌丝体耐热性。POD活性在外源添加SNP的高温胁迫条件下显著降低。     

刺芹侧耳芳基醇氧化酶的分离纯化及其酶学性质

分离纯化刺芹侧耳Pleurotus eryngii芳基醇氧化酶,并探究其酶学性质。通过硫酸铵盐沉、DEAE-Sepharose Fast Flow弱阴离子交换层析、Sephacryl S-200 High Resolution凝胶过滤层析和Source 15Q强阴离子交换层析,得到纯化的单一酶。经肽指纹图谱鉴定,确定其为芳基醇氧化酶,酶活回收率25.5%,纯化倍数38.2。结合SDS-PAGE和IEF-PAGE分析,确定其分子量和等电点分别为70kDa和4.2。以藜芦醇为底物,该酶最适反应pH为6.0,最适反应温度为70℃,金属离子Zn²⁺、Fe²⁺和Cu²⁺对芳基醇氧化酶的活性抑制作用明显,K_m和V_max分别为0.921mmol/L和80U/mg。     

刺芹侧耳栽培料及菌体中漆酶介体分子的挖掘

虽然真菌能够分泌漆酶从木质素中获取碳源,然而纯化后真菌漆酶降解木质素的能力却极低。本文利用萃取方法提取刺芹侧耳栽培料及菌体中可溶性化合物,通过快速漆酶介体体系（LMS）动力学实验确定其对漆酶催化氧化反应的促进或抑制能力,进一步利用HPLC-MS和代谢组学差异分析的方法从最高活性萃取液的柱层析组分中挖掘潜在的活性成分。研究结果表明栽培料中可能含有活性介体成分,生物信息学XCMS代谢产物组分析揭示了CTE05分离组分中富含的木质素代谢产物,涉及到软木脂单体合成、香豆素合成、丁香油酚或异丁香油酚合成、质体醌醇合成、由苯丙氨酸合成硫代葡萄糖苷和安息香酸合成等代谢途径。最后讨论了其中11种潜在的天然介体分子物理化学性质,其中4种为已有文献报道的天然介体小分子。本研究暗示木质素降解与合成代谢在分子机制上存在有某种联系,相关的代谢产物可能参与了真菌降解木质素的代谢过程。     

新疆阿魏菇与杏鲍菇中氨基酸含量的分析研究

对新疆阿魏菇与杏鲍菇的氨基酸成分进行系统分析,结果显示新疆本地的阿魏菇和杏鲍菇中17种氨基酸含量丰富,种类齐全,阿魏菇中氨基酸总量为16.80%高于杏鲍菇中氨基酸总量(14.34%);两种菇中必需氨基酸含量(EAA)占总氨基酸含量的比例分别为34.72%和37.92%。新疆阿魏菇与杏鲍菇种富含人体必需的氨基酸,可作为饮食氨基酸来源的重要补充。     

中国栽培白灵菇学名的订正

采用形态学方法对采集于新疆野生的阿魏蘑标本进行分类鉴定,结果表明其形态学特征符合刺芹侧耳托里变种Pleurotus eryngii var. tuoliensis的特征范围,它与欧洲已报道的Pleurotus nebrodensis有明显的差异。此外本研究还采用分子生物学方法对从该野生样品分离的菌株CCMSSC 02514进行了rDNA ITS序列分析,结果表明它与我国栽培白灵菇菌种CCMSSC 00973、KH5和AFRL 6022完全相同,以此构建系统发育树,将我国栽培白灵菇种质与意大利的Pleurotus nebrodensis、Pleurotus eryngii var. ferulae以及来自荷兰的Pleurotus eryngii等截然分为两组。因此,形态学和rDNA ITS序列分析结果支持我国栽培的白灵菇与欧洲的Pleurotus nebrodensis为不同种,我国的白灵菇是刺芹侧耳独立进化的一个分支,其名称应该为刺芹侧耳托里变种Pleurotus eryngii var. tuoliensis。     

白灵侧耳(白灵菇)杂交育种研究进展

白灵菇是与杏鲍菇亲缘关系相近的侧耳属食用菌新品种,也是近年来开发栽培成功的集食用、药用、食疗于一体的大型珍稀食用菌品种。文中通过生物学特性、交配型基因、杂交育种技术3个方面综述了白灵侧耳杂交育种方面研究进展,讨论并分析了通过杂交育种综合优异性状,去除不利性状培育出更好的蘑菇新品种的可能性,为探讨及研发白灵菇杂交育种及其多倍化材料在生物学进化上的保守性提供理论参考,为解决我国食药用菌产业目前存在的瓶颈问题提供新的思路。     

刺芹侧耳菌渣对肺形侧耳（秀珍菇）生长和营养成分的影响

以常规棉籽壳培养料为对照,用刺芹侧耳Pleurotus eryngii工厂化生产的废料（简称菌渣）代替部分棉籽壳进行格氏侧耳Pleurotus geesterani栽培试验,并测定格氏侧耳的营养成分。结果表明,供试培养料中菌丝长势均良好,随着菌渣替代比例的增加,菌丝满袋时间、原基出现时间和转潮期缩短,生长周期变短;菌渣代替比例增加,产量呈降低趋势,其中替代比例33%（1:2）和55%（1.2:1）时培养料的生物学效率与对照无显著差异,替代比例55%和78%（3.5:1）时培养料对第四潮和第五潮菇产量影响明显,显著低于对照;供试菌渣培养料栽培格氏侧耳的粗蛋白和总氨基酸含量略高于或显著高于对照,说明添加适量的菌渣栽培格氏侧耳可提高子实体的营养成分。     

刺芹侧耳两种保护酶基因的克隆、分析及温度对其表达量的影响

为了探究温度胁迫下刺芹侧耳中过氧化氢酶和铜锌超氧化物歧化酶基因的作用,本研究通过RT-PCR方法对刺芹侧耳转录组数据库检索得到的过氧化氢酶（CAT）和铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）基因进行克隆,并利用荧光定量PCR分析在高低温胁迫下CAT和Cu/Zn-SOD基因的表达量,以探讨刺芹侧耳中这两种保护酶基因在高、低温胁迫下的响应特征。结果表明,克隆得到的CAT和Cu/Zn-SOD基因开放阅读框长度分别为1 581bp和582bp,分别编码526个和193个氨基酸,分子量分别为59.6kDa、19.62kDa,等电点分别为6.35、6.31。在高温（35℃）和低温（4℃）两组处理中,CAT和Cu/Zn-SOD基因的表达量及酶活均在处理48h时达到最高且与对照组呈现显著差异,说明两种基因在刺芹侧耳抵御高低温胁迫的过程中具有重要作用。本研究结果初步研究了温度胁迫下刺芹侧耳中CAT与Cu/Zn-SOD基因的生物学功能,为进一步解析刺芹侧耳抵抗温度胁迫的机理奠定基础。