剪切应力诱导血小板聚集

剪切应力诱导血小板聚集（shear-induced platelet aggregation, SIPA）是指在高剪切流场诱导下血小板表面的膜糖蛋白（GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ和GPⅡb/Ⅲa）与血浆中的von Willebrand因子（vWF）相结合,介导血小板的活化、黏附和聚集,是动脉血栓的重要成因.SIPA还需要Ca2+,ADP/ATP等生化因素的参与,因而SIPA现象是生化因素和力学因素偶合作用的结果.细胞外Ca2+是高剪切应力诱导血小板发生聚集的必需条件,Ca2+的跨膜内流引起细胞骨架结构的改变和GPⅡb/Ⅲa的活化.近来对ADP/ATP位于血小板膜上的P2受体的研究表明,P2受体与细胞内Ca2+协同作用通过多种生化途径调控血小板的活化过程在SIPA的信号传导中起着关键的作用.从力学环境与生化反应的偶合关系入手研究SIPA现象的触发机制,深入研究SIPA现象中的信号转导通路是今后的研究热点之一.     

烙铁头Trimeresurus Mucrosquamatus蛇毒对血小板的活化作用

烙铁头Trimeresurus Mucrosquamatus蛇毒(TMV)可引起人和多种动物(狗、家兔、豚鼠)血小板的活化,发生聚集。血小板聚集强度与加入TMV的量有关。豚鼠血小板对TMV最为敏感,TMV引起豚鼠、家兔、狗和人的血小板聚集的最低剂量分别为0.6、12.5、2.0、2.0μg/ml。EDTA抑制而肝素不影响TMV对血小板的聚集作用。TMV的血小板聚集反应伴有5羟色胺的释放,引起家兔血小板5羟色胺最大释放(72％)的TMV剂量为100μg/ml。TMV还可以诱导血小板血栓恶烷A_2的形成。阿斯匹林能阻断TMV诱导的血栓恶烷A_2的生成,但并不抑制TMV引起的血小板聚集反应,提示TMV可能通过不依赖于血栓恶烷A_2的途径活化。初步结果表明TMV是研究血小板生理机制的有用工具。     

钙调神经磷酸酶依赖的信号通路在大鼠心肌肥大中的作用及调节

本工作在大体动物模型、细胞及分子水平上,对钙调神经磷酸酶（CaN)依赖的信号通路在大鼠豳肥大中的作用及其调节机制进行了研究。结果发现;（１）ＣaN信号通路参与血流动力学超负荷、心肌纤维化、旁／自分泌因子等诱导的心肌细胞肥大;（２）ＣaN信号通道参与血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及碱性成纤维细胞因子(bFGF)诱导的心肌细胞肥大和AngⅡ及bFGF刺激的心脏成纤维细胞增殖;（３）ＣaN通路与丝裂素活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）及蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）信号途径可能存在相互关系;（４）ＣaN的活化依赖胞内Ｃa^2 浓度的持续升高,ＣaN的活化还受蛋白激酶磷酸化的调节,ＡngⅡ刺激心肌细胞ＣaNmRNA的表达显著增加,ＣaNmRNA本身的表达受Ｃa^2 信号及ＭＡＰＫ级联反应的调控。结论：Ｃa^2 -ＣaN信号通路介导心肌肥大的发生。     

G蛋白与整合素αⅡbβ3的双向信号转导

整合素是一类细胞表面受体家族分子,通过双向信号转导参与细胞与细胞外基质、细胞与细胞的粘附以及细胞的迁移.整合素αⅡbβ3(GPⅡb-Ⅲa)特异表达于巨核/血小板系,并且是其含量最多的膜糖蛋白,介导血小板的粘附、伸展、聚集等.G蛋白在整合素αⅡbβ3双向信号转导中发挥重要作用,其中较受关注的是:异源三聚体G蛋白和小G蛋白Rap1参与整合素αⅡbβ3的内向外信号转导;小G蛋白(Rho A、Rac等)和Gα13参与整合素αⅡbβ3的外向内信号转导.在蛋白质结构与功能关系的层面,本文总结了G蛋白的结构、分类、功能以及近年来G蛋白在整合素αⅡbβ3双向信号转导中作用的研究进展.     

天麻醒脑胶囊对家兔血小板聚集和花生四烯酸诱导大鼠脑血栓形成的影响

采用比浊方法测定天麻醒脑胶囊在体内和体外对腺苷二磷酸（ADP）、花生四烯酸（arachidonic acid,AA）和血小板活化因子（platelet activating factor,PAF）诱导家兔血小板活化聚集的影响。采用从经大鼠颈内动脉注射诱发同侧大脑半球脑血栓形成方法评价天麻醒脑胶囊的抗脑血栓形成作用。天麻醒脑胶囊在体外呈浓度依赖性明显抑制从和ADP引起的血小板聚集,其半数抑制浓度（50％of inhibitory concentration,IC50）分别为1．83和3．25g/L。0．5和1g/kg的天麻醒脑胶囊于灌胃后明显抑制从诱导的家兔血小板聚集,本品1g/kg时显著阻抑ADP引起的血小板聚集。天麻醒脑胶囊在体内外对PAF诱导的血小板聚集均无明显影响。1、2g/kg天麻醒脑胶囊组的右侧与左侧脑重差值均显著减小,显著降低右脑伊文思蓝吸光度与右脑重的比值。结果提示,天麻醒脑胶囊具有较强的抗血小板和减轻脑血栓形成作用,有利于血小板聚集性增高的血栓栓塞性疾病的防治。     

血小板膜糖蛋白的研究

主要有五种人血小板膜糖蛋白:糖蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ,在血小板活化过程中起着膜受体的作用。糖蛋白Ⅰ在血小板粘附过程中起着因子Ⅷ(vWF)受体的作用,同时具有凝血酶受体和药物性抗体的受体功能,最近研究表明糖蛋白Ⅰ还可能与胶原受体相关。糖蛋白Ⅱ与糖蛋白Ⅲ形成钙依赖性复合物,在血小板聚集过程中起着纤维蛋白原受体的作用。在糖蛋白Ⅱ和Ⅲ分子上还具有血小板特异的抗原PL~(A1)、Lek 等。     

钙离子通道A23187对血小板聚集和蛋白质磷酸化的影响

以 ³²P-Na₂HPO₄标记猪血小板,在阿斯匹林阻断花生四烯酸代谢,Apyrase去除分泌的ADP情况下,以A23187和PMA为血小板激动剂,staurosporine为PKC抑制剂,研究Ca²⁺和蛋白激酶C在血小板聚集中的作用.结果表明,a.A23187在1～20 μmol/L引起血小板聚集,相应地,明显地引起40 ku、20 ku蛋白质磷酸化,且存在剂量和时间效应关系.b.A23187和PMA在血小板聚集和蛋白质磷酸化上都存在着协同效应.c.1 μmol/L staurosporine可大部分抑制20 μmol/L A23187诱导的血小板聚集和20 ku、40 ku蛋白质磷酸化.结果提示,Ca²⁺激活血小板是建立在激活PKC的基础上,Ca²⁺通过激活PKC诱导血小板聚集,这是Ca²⁺激活血小板的主要途径.     

人vWF-A1多肽的融合表达及生物学活性鉴定

血管性血友病因子 (vWF)通过与血小板膜糖蛋白结合介导血小板的粘附和聚集 ,在血栓形成过程中发挥重要作用 .通过阻断血小板与vWF的结合可抑制血栓形成 .应用RT PCR方法从人脐带内皮细胞中克隆vWF A1区基因并在原核细胞内进行表达 ,经过纯化、复性 ,获得重组蛋白(rvWF A1) .用流式细胞术检测rvWF A1与转染了糖蛋白Ib(GPⅠb)的CHO K1细胞和血小板GPⅠb的结合能力 ,血小板聚集仪测定rvWF A1对瑞斯托霉素 (ristocetin)诱导的血小板聚集作用的影响 .重组表达载体pET 2 0b(+ ) vWF A1在大肠杆菌BL2 1(DE3)plus中得到有效表达 ,表达的重组蛋白量占菌体总蛋白 30 % .次氮基三乙酸镍琼脂糖 (Ni NTAagarose)柱纯化后 ,其纯度为 95 % .经复性的rvWF A1蛋白具有良好的生物学活性 ,它可与转染了GPⅠb的CHO K1细胞和血小板结合 ,阳性率分别为 96 90 %与 78 6 0 % ,且可以抑制ristocetin诱导的血小板聚集 ,其抑制效应呈剂量依赖性 .IC50 的rvWF A1浓度为 0 5 6 μmol L ,当浓度为 1 4 μmol L时抑制率最高达 84 70 % .结果表明 ,在原核细胞中表达人rvWF A1区蛋白可抑制血浆中野生型vWF与血小板的结合 ,具有抗血栓形成的潜在应用前景     

花生四烯酸诱导肌球蛋白磷酸化被抑制的平滑肌细胞 迁移的信号传导途径

在应用肌球蛋白轻链激酶特异抑制剂ML-7抑制了肌球蛋白轻链磷酸化后,花生四烯酸(arachidonic acid,AA)仍可诱导兔血管平滑肌细胞（SM3）发生迁移.为了进一步阐明其信号传导途径,应用多种信号抑制剂,采用免疫印迹、Boyden小室和提取细胞膜蛋白等实验方法,对上述迁移作用的信号传导途径进行了深入的研究.结果显示,PTX（Gi蛋白抑制剂）、U73122（PLC抑制剂）、staurosporine (PKC抑制剂)、PD98059（ERK1/2抑制剂）和SB203580（p38抑制剂）分别可拮抗上述AA诱导的SM3细胞迁移作用,而SP600125（JNK抑制剂）的作用较弱.免疫印迹结果显示,AA可提高SM3细胞中PKC(ε)、ERK1/2、p38和JNK信号的磷酸化水平,呈时间依赖性, PTX或U73122可抑制上述作用;staurosporine可抑制由AA 引起的ERK1/2和JNK的磷酸化水平增强,但对p38的磷酸化水平无影响.还发现AA可促进PLCβ2的细胞膜移位, PTX可抑制其作用.上述结果表明,当肌球蛋白轻链的磷酸化被抑制后, AA可通过Gi蛋白的活化促进PLCβ2向细胞膜移位,进而通过激活PKC(ε)、ERK1/2、p38和JNK等信号转导途径而诱导SM3细胞发生迁移     

巨噬细胞的三种活化

IFN-γ诱导产生、经典活化的巨噬细胞参与Th1型免疫应答,对细胞内感染病原体如结核杆菌有很好杀伤作用。由IL-4、IL-13等所诱导的替代性活化的巨噬细胞,具有组织修复功能,是与经典活化的巨噬细胞不同的表现型。近来研究表明,FcγRs与其配体结合所诱导活化的巨噬细胞——Ⅱ型活化的巨噬细胞与上述两种活化的巨噬细胞不同,具有抗炎症并参与,Th2型免疫应答的作用。该主要讨论这三种类型活化的巨噬细胞的发现、活化的信号及其生物学功能。     

细胞骨架对凝血酶诱导人血小板分泌反应的调节(英文)

本文利用血小板表面外露的GMP-140为血小板分泌反应的特异性标志,通过放射免疫分析法定量测定血小板表面GMP-140分子数,研究了细胞骨架抑制剂对凝血酶诱导血小板分泌反应的影响。结果表明,凝血酶激活使血小板表面GMP-140的外露明显增加,反应迅速,并在一定范围内呈剂量和时间依赖性;而ADP刺激则几乎不引起GMP-140外露的增加。凝血酶激活前加入不同的细胞骨架抑制剂处理可产生不同的效应:细胞松驰素B(肌动蛋白微丝抑制剂)可明显上调凝血酶诱导的GMP-140外露;而秋水仙素(微管抑制剂)则下调GMP-140的外露;两者同时处理仍呈现明显的上调作用。提示凝血酶作为一种强激活剂,不仅可通过受体-G蛋白-第二信使的途径启动血小板分泌反应,而且可能经诱导肌动蛋白微丝的形成对分泌反应起反馈性负调节作用。微管的存在则可能对凝血酶诱导的分泌反应起促进作用。虽然两种细胞骨架的作用相反,但以微丝的作用为主,两者间无相互拮抗现象。     

人von Willebrand因子A1和A3功能结构域嵌合体的表达及生物学功能

vWF介导血小板粘附到细胞外基质 ,在血栓形成过程中发挥重要作用 ,可通过阻断vWF与细胞外基质的结合阻止血小板的粘附 .应用RT PCR方法从人脐静脉内皮细胞中克隆vWF分子A1、A3区基因并在大肠杆菌中表达 ,表达的重组蛋白量占菌体总蛋白 12 6 % ,包涵体经过变性剂溶解、纯化和复性 ,获得重组蛋白 (rvWF A1 A3) .应用流式细胞术检测rvWF A1 A3与血小板膜糖蛋白 (GPⅠb)的结合功能 ;血小板聚集实验观察rvWF A1 A3对瑞斯托霉素 (ristocetin)诱导的血小板聚集 (RIPA)的影响 ;ELISA胶原结合实验及竞争抑制实验分析rvWF A1 A3与胶原的结合活性 .结果显示 :rvWF A1 A3嵌合体与血小板的结合阳性率为 70 4 % .rvWF A1 A3嵌合体不能引起血小板的聚集 ,但rvWF A1 A3嵌合体与血小板温育后可以阻断ristocetin诱导人血浆vWF对血小板的聚集作用 ,而且呈剂量依赖性 ,IC50 的rvWF A1 A3浓度为 0 76 μmol L ,当浓度为 1 17μmol L时抑制率最高达 76 8% .rvWF A1 A3具有良好的胶原结合活性 ,同时它可以竞争性抑制vWF与Ⅲ型胶原的结合 ,抑制率为 76 % .表明rvWF A1 A3可作为阻断剂用于干预vWF介导的血小板粘附过程 ,同时又可以阻断血浆vWF与血小板GPIb结合抑制血小板聚集 ,具有良好的抗栓应用前景 .     

EGTA和La~(3 )对几种逆境诱导辣椒样半萜环化酶基因表达的影响

用钙离子螯合剂EGTA及细胞膜钙离子通道拮抗剂La3 预处理辣椒叶片 ,以破坏辣椒叶片中的钙信使系统 ,再用紫外线、CuCl2 、HgCl2 处理辣椒叶片 ,研究表明EGTA和La3 预处理未能降低CuCl2 、HgCl2 、UV诱导辣椒倍半萜环化酶活化的作用 ,EGTA预处理反而对CuCl2 、HgCl2 、UV的诱导辣椒倍半萜环化酶活性作用有一定的促进效应 .单独用EGTA处理也能诱导离体辣椒叶片表现出倍半萜环化酶活性 .NorthenBlot分析结果表明 ,EGTA能诱导辣椒倍半萜环化酶基因转录 .研究表明 ,在辣椒倍半萜环化酶基因表达过程中 ,还存在钙信使系统以外的信号传递途径 ;非生物诱发因子对倍半萜环化酶基因表达诱导作用与生物Elicitor的诱导作用在信号传递上有差异 .     

滇产胡椒属植物醇提物抗血小板活性研究

采用Born氏比浊法观察了12种滇产胡椒属植物的乙醇提取物对血小板活化因子(PAF)、花生四烯酸(AA)和二磷酸腺苷(ADP)引起血小板活化聚集的影响.结果表明,这12种醇提物均明显抑制PAF诱导的血小板聚集,其中部分醇提物对AA和ADP引起的聚集亦有显著拮抗作用.结果提示,该12种滇产胡椒属植物醇提物具有较高的抗血小板活性     

MAPK／JNK信号传导通路研究进展

JNK信号途径参与如胚胎发育、免疫反应、细胞分化等许多正常的生理过程。近年来研究表明,JNK信号途径也参与许多病理过程：JNK介导心脏肥大反应,与Ⅱ型糖尿病发病有关,介导胰腺b细胞凋亡;JNK信号途径的异常活化与多种人类肿瘤的发生发展密切相关,因此JNK是一个潜在的治疗分子靶,已引起人们的关注。对其功能及作用的分子机制的深入研究,有助于我们对JNK相关疾病的了解和寻找可能的干预和治疗途径。     

紫锥菊提取物及酚酸化合物体外抗血小板聚集活性研究

为探究紫锥菊提取物及酚酸化合物体外抗血小板聚集活性,体外抗血小板聚集实验采用Born比浊法,以聚集抑制率和半数抑制浓度为指标评价。同时采用分子对接方法,选择凝血因子V(F5)、凝血因子VIII(F8)及凝血因子XI(F11)与酚酸类化合物进行虚拟对接,研究其抗血小板聚集的分子作用靶点。结果表明化合物S-1～S-10及其提取物对体外ADP诱导的血小板聚集有抑制作用,抑制率呈浓度依赖性,S-6与靶点的结合位点更多,选择性更强。紫锥菊中酚酸类化合物及其提取物在体外均显现出抗ADP诱导的血小板聚集活性,为紫锥菊体内研究提供依据。     

SA-hirudin-RGD融合蛋白的原核表达及其抗凝血酶与抗血小板聚集功能的研究

目的:构建SA-hirudin-RGD重组载体,表达和纯化融合蛋白,并对其抗凝血酶、抗血小板聚集功能进行初步验证。方法:利用基因重组技术将链霉亲和素(SA)核心区与hirudin-RGD序列连接,并克隆到原核表达载体PET-44b中,Westernblotting鉴定经IPTG诱导后纯化的融合蛋白。抗凝血酶和抗血小板聚集作用分析证明该融合蛋白既有抗凝血酶又有抗血小板聚集的功能。结果:重组载体p ET44b-SA-hirudin-RGD经限制性酶切鉴定和基因测序证实构建成功;经IPTG诱导后SA-hirudin-RGD融合蛋白在大肠杆菌中高效表达;纯化得到该目的蛋白,相对分子质量经Westernblotting鉴定约为70000。抗凝血酶和抗血小板聚集的实验证明,融合蛋白SA-hirudin-RGD既有抗凝血酶又有抗血小板聚集的功能。结论:具有抗凝血酶和抗血小板聚集双重功能的SA-hirudin-RGD融合蛋白被成功表达和纯化,为下一步SA-hirudin-RGD的功能研究及临床应用确立了基础。     

L—精氨酸L—门冬氨酸盐对血小板功能的抑制

用血小板聚集、粘附、释放实验和出血时间测定观察L-精氨酸*L-门冬氨酸盐(DR)对血小板功能的作用。实验结果显示DR15mg/kg静脉给药,可明显抑制腺苷二磷酸(ADP)诱导的大鼠血小板聚集(P<0.01);15mg/kg单次口服给药可明显抑制ADP诱导的家兔血小板聚集;其药效可持续8h以上(P<0.01);DR7.5、15、30mg/kg灌胃给药(Bid×3.5d),可明显抑制ADP、胶原或凝血酶诱导的大鼠血小板聚集(P<0.01),并延长出血时间(P<0.05)。DR30mg/kg可明显抑制大鼠血小板粘附,并促进血管内皮释放前列环素(PGI2),但对活化的血小板释放血拴素(TXA2)无明显影响。本研究发现,DR可抑制血小板聚集和粘附功能,其作用机制不同于阿司匹林。这些作用部分是由于DR增加了血管内皮PGI2的释放。此结果为血小板功能的调节提供了新线索。     

钙拮抗剂对血小板功能的影响

Ca~(2+)参与血小板激活的许多重要环节,血小板聚集剂通过诱导胞浆内游离 Ca~(2+)浓度升高以激活血小板;钙拮抗剂可抑制血小板激活,其机理主要与钙拮抗作用有关。     

胞浆型磷脂酶A2介导弱氧化修饰低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡

探讨弱氧化修饰低密度脂蛋白(MM-LDL)能否诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡以及胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)在此过程中的作用.MTT法测定细胞存活率;相差显微镜、荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞凋亡;3H-花生四烯酸(3H-AA)预标法测定PLA2活性;蛋白质印迹检测cPLA2磷酸化;激光共聚焦显微镜检测单个细胞内钙离子浓度的变化.结果表明,MM-LDL(100～300 mg/L)作用后的HUVECs呈现凋亡典型的形态特征,凋亡率随MM-LDL浓度的增加而上升.MM-LDL能引起胞内钙离子浓度增加,cPLA2的活化及磷酸化.15 μmol/L AACOCF3和5 mmol/L EGTA在抑制cPLA2活性的同时,部分抑制MM-LDL诱导的HUVECs凋亡.加入外源性AA(50 μmol/L)能逆转AACOCF3引起的凋亡抑制.结果提示,cPLA2参与了MM-LDL诱导HUVECs凋亡的信号传递.