姜黄素对脂多糖激活的小胶质细胞iNOS 表达的抑制及抗氧化作用

用姜黄素预处理小胶质细胞株BV,1 h后加用脂多糖(200 ng/ml)进行刺激,通过MTT检测细胞活性;硝酸还原酶法检测细胞上清液中一氧化氮(NO)的含量;Western 印迹、免疫细胞化学染色检测细胞活化后形态及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白的表达;瞬时转染和荧光素酶报告基因鉴定iNOS和NF-κB基因表达活性;SOD和GSH-Px检测姜黄素的抗氧化能力.结果证明,脂多糖可促使小胶质细胞活化,使iNOS和NF-κB基因表达活性显著增强;iNOS蛋白表达明显上调,NO释放增多;细胞内SOD和GSH-Px活性明显下降.而姜黄素(10 μmol/L)可以显著抑制活化后小胶质细胞NO的产生、iNOS蛋白的表达及iNOS-Luc、NF-κB-Luc的表达活性,其机制可能通过NF-κB的信号转导途径抑制iNOS的表达.姜黄素可通过提高细胞内SOD和GSH-Px的活性发挥抗氧化作用.     

核因子κB在精氨酸血管升压素诱导大鼠心肌成纤维细胞一氧化氮合成中的作用

本文探讨了精氨酸血管升压素(AVP)刺激下体外培养的大鼠心肌成纤维细胞(CFs)内一氧化氮(NO)含量、一氧化氮合酶(NOS)活性、诱导型一氧化氮合酶基因表达的变化及其与核因子κB(NF-κB)的关系。用胰酶消化法分离培养Sprague Dawley仔鼠的CFs,分别采用硝酸还原酶法、分光光度法、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、免疫荧光-共聚焦显微镜和蛋白质印迹检测AVP干预下CFs的NO含量、NOS活性、iNOS mRNA表达和NF-κB的活化。结果显示,AVP浓度依赖性(0．001—0．1μmol／L)地增加CFs的NO含量,提高NOS活性,增加iNOS mRNA表达;AVP能够活化NF—κB,使其由细胞浆转位于细胞核;NF-κB特异性抑制剂吡咯啉烷二甲基硫脲(PDTC)能够抑制AVP诱导的CFs NO含量增加、NOS活性提高和iNOS mRNA表达增加。上述结果提示,AVP干预下CFs iNOS mRNA表达增加、NOS活性增高、NO合成增多可能通过NF-κB激活途径,NF-κB激活参与心肌纤维化的发生和发展。     

黑色素及谷胱甘肽通过抑制NF-κB途径的激活可有效抑制H 5N1禽流感病毒感染

我国是H5N1高致病性禽流感频发区.为筛选天然药物用于H5N1禽流感的防治并研究其抗病毒感染的作用机制,本研究选取黑色素及谷胱甘肽（GSH）为候选药物,通过Hoechst 33258荧光染色,观察了禽流感病毒(AIV)感染后的细胞形态变化;细胞凋亡流式细胞术定量分析表明,H5N1 AIV感染可诱导宿主狗肾上皮细胞(MDCK)凋亡,而黑色素及GSH对其具有显著抑制作用(P<0.01);当20 μg/ml黑色素及10 mmol/LGSH共同作用时,抑制率高达89% (P <0.01);采用MTT法检测,黑色素及GSH可增强AIV感染后的宿主细胞存活率;病毒血凝素(Ｈa)基因的RT-PCR检测结果表明,黑色素及GSH可显著降低AIV在宿主细胞内的增殖(P<0.01);一氧化氮（NO）毛细管电泳（CE）激光诱导荧光检测显示,黑色素及GSH均可显著降低病毒感染诱导宿主细胞内的NO释放量(P<0.05);RT-PCR技术结合ELISA方法,分别分析了病毒感染后宿主细胞的诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）、环氧化酶(cyclooxygenase-2, COX-2)及核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB）在mRNA和蛋白水平表达的差异.结果表明,黑色素及GSH可抑制病毒感染诱导的iNOS与COX-2的基因及蛋白的表达 (P<0.05),并进而抑制NF-κB途径的激活(P<0.01),从而可有效抑制H5N1 AIV感染.     

PDT诱导的凋亡细胞对巨噬细胞NO合成的影响

NO作为细胞间信息传递的重要调节因子,在肿瘤的发生、发展以及转移过程中被广泛研究。一氧化氮合酶是合成NO的关键酶,诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)通常在应激、荷瘤等病理状态下被激活,产生大量NO。NO具有细胞毒性,与机体免疫反应及细胞凋亡有关,在许多致癌和抑癌机制中扮演着重要角色。实验探讨了光动力学疗法(photodynamic therapy,PDT)处理产生的小鼠乳腺癌凋亡细胞对巨噬细胞产生NO的影响,从而确定活化的巨噬细胞在肿瘤生长中的作用。     

脱氢弯孢霉菌素对脂多糖诱导的巨噬细胞炎症研究

研究脱氢弯孢酶菌素(Dehydrocurvularin,DCV)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠腹腔(peritoneal macrophages,PMs)和骨髓来源的巨噬细胞(bone-marrow-derived macrophages,BMDMs)的影响。MTT方法筛选最佳药物浓度处理不同来源的巨噬细胞,采用Western blot方法检测诱导型一氧化氮合酶(induceble nitric oxide synthase,iNOS)、环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)及炎性信号通路NF-κB和MAPK的相关蛋白的表达。结果显示,脱氢弯孢酶菌素可显著抑制LPS诱导的iNOS、COX-2的表达,且呈剂量依赖性。NF-κB和MAPK信号通路相关的蛋白激活也受到了明显的抑制。结果表明,脱氢弯孢酶菌素可显著抑制LPS诱导的不同来源的免疫细胞的炎症。     

植物体内一氧化氮合成途径研究进展

一氧化氮(NO)作为一种气体信号分子,在植物生理过程中发挥重要作用,它参与调节植物的生长、发育及对外界环境的应激反应.植物体内主要通过酶催化途径和非酶催化途径合成NO.酶催化途径合成NO的主要酶包括一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)和硝酸还原酶(nitrate reductase,NR),以及在某些植物的特定组织或器官或在特殊环境条件下存在的一氧化氮氧化还原酶(nitric oxide oxidoreductase,Ni-NOR)和黄嘌呤氧化还原酶(xanthine oxidoreductase,XOR).非酶催化合成途径主要是在酸性和还原剂存在条件下将亚硝酸盐还原成NO.该文主要结合研究方法,综述了植物体内NO合成途径的研究进展,为植物体内NO信号的作用机理的深入研究提供信息资料.     

β淀粉样蛋白1-42对BV-2细胞产生一氧化氮功能的刺激作用

目的应用β淀粉样蛋白1-42(β-Amyloid,Aβ1-42)作用于小胶质细胞(microglia,MG),对MG产生一氧化氮(nitric oxide,NO)的作用进行研究.方法应用高度纯化的BV-2小胶质细胞作为体外小胶质细胞模型,测定加入Aβ1-42后细胞上清NO含量及细胞iNOS酶活力;Western blot法测定Aβ对BV-2细胞iNOS蛋白表达的影响,免疫细胞化学方法对iNOS蛋白的表达情况进行观察.结果 Aβ1-42可以刺激BV-2细胞产生NO、提高细胞iNOS酶活性、增加iNOS蛋白质表达,以上作用均具有时间及浓度依赖性.结论 Aβ1-42在体外可通过提高细胞iNOS酶活性、增加iNOS蛋白质表达而增加NO的分泌,为NO发挥神经元毒性作用创造了条件.     

NF-κB介导哮喘过敏原刺激后支气管上皮细胞的凋亡

目的研究核转录因子κB(NF-κB)在哮喘过敏原刺激后支气管上皮细胞中的表达及对细胞凋亡的影响。方法以300U/L尘螨抗原提取物作为过敏原刺激支气管上皮细胞系16HBE细胞,应用RT-PCR和Western blot检测尘螨抗原提取物刺激对16HBE细胞NF-κB(p65)表达水平的影响;用NF-κB(p65)sh RNA沉默16HBE细胞内NF-κB表达后,应用流式细胞术和Western blot检测NF-κB(p65)在过敏原刺激诱导16HBE细胞凋亡中的作用。结果过敏原刺激后使16HBE细胞内NF-κB(p65)m RNA和蛋白水平明显上调,明显诱导16HBE细胞凋亡和活化型caspase-3水平上调,沉默NF-κB可使过敏原刺激诱导的16HBE细胞凋亡率降低和活化型caspase-3水平上调减少。结论 NF-κB可介导哮喘过敏原刺激后的支气管上皮细胞凋亡。     

p38MAPK介导的胶质细胞iNOS的转录激活机制

丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)酶级联反应系统参与胶质细胞中iNOS的合成.通过瞬时转染p38MAPK途径中上游激酶,MAPK激酶3(MKK3)和MAPK激酶6 (MKK6 )表达质粒,进一步了解p38MAPK级联传导信号系统调节iNOS基因在胶质细胞中的转录激活机制.MKK3或MKK6表达质粒与接有荧光素酶(luciferase ,Luc)的大鼠iNOS启动基因质粒(iNOS Luc)联合转染C6星形胶质细胞株引起iNOS Luc的激活,并且使细胞因子诱导的iNOSmRNA的表达增强.这两种效应都能够被p38MAPK抑制剂SB2 0 35 80所抑制.MKK3 6也可以诱导核因子κB(NFκB Luc)依赖的转录活性.这些分子水平的研究结果为p38MAPK信号级联传导途径在调节大鼠胶质细胞中iNOS基因转录激活中的重要作用,包括转录因子NFκB的作用提供了证据.通过阻断iNOS表达或NO的生成,抑制细胞炎症发生,为防治神经细胞炎症反应性疾病提供实验依据.     

肉苁蓉苯乙醇苷对慢性高原病模型大鼠的治疗作用及机制研究CSCD

通过测定血液红细胞数、血红蛋白含量、红细胞比容、肺组织匀浆液中内皮素-1(endothelin-1,ET-1)、一氧化氮(nitric oxide,NO)含量、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)活力以及过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha,PPAR-α)、缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1α)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)mRNA水平和蛋白表达的变化,探究肉苁蓉苯乙醇苷(phenylethanoid glycosides from cistanche,PhGCs)对慢性高原病(chronic mountain sickness,CMS)模型大鼠的治疗作用及作用机制。结果显示,与模型组大鼠相比,PhGCs和大花红景天能降低CMS大鼠右心室肥厚和ET-1含量、升高NO含量和总一氧化氮合酶(total nitric oxide synthase,T-NOS)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)酶活力,下调肺组织HIF-1α及VEGF蛋白的表达,上调PPAR-α蛋白的表达,同时降低肺组织中HIF-1α的mRNA水平;此外,大鼠血液红细胞数、血红蛋白含量及红细胞比容无明显变化。该研究表明PhGCs可能是通过抑制HIF通路、激活NO通路发挥作用。     

结核分枝杆菌低氧反应蛋白的原核表达及对巨噬细胞ANA-1功能的影响

目的原核表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)Rv2626c基因编码的低氧反应蛋白(hypoxic response protein 1, HRP1),并分析该蛋白对小鼠巨噬细胞ANA-1(简称ANA-1细胞)功能的影响及作用机理。方法将Rv2626c基因克隆至表达载体pET-28a,构建重组表达质粒pET-28a-Rv2626c,转入表达菌株BL21,诱导表达HRP1,经亲和层析法纯化和Western blot鉴定。使其作用于ANA-1细胞,用CCK8法检测ANA-1细胞的增殖活力,流式细胞术检测ANA-1细胞凋亡情况,Griess法及ELISA法分别检测一氧化氮(nitric oxide, NO)产生水平和肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)的分泌情况,同时采用核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)抑制剂Bay 11-7082、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)抑制剂U0126、SB 203580预处理ANA-1细胞后,检测NO、TNF-α、IL-1β变化情况。结果成功构建重组表达质粒pET-28a-Rv2626c,获得目的蛋白HRP1。与空白组相比,不同浓度的HRP1作用于ANA-1细胞后,细胞增殖活力未受抑制(P0.05),凋亡率无明显差异,但培养细胞上清液中的NO、TNF-α及IL-1β含量均显著增加(P0.05);若用Bay 11-7082及U0126预处理的ANA-1细胞,其NO及TNF-α的分泌量明显减少(P0.001)。结论 HRP1对ANA-1细胞无细胞毒性,并可通过激活ANA-1细胞内NF-κB及MAPK信号通路促进其分泌具有抗菌效应的NO及TNF-α,增强其固有免疫效应,可作为结核疫苗候选优势抗原。     

一氧化氮在乙烯诱导蚕豆气孔关闭中的作用

以蚕豆为材料研究了一氧化氮(nitric oxide,NO)和乙烯对气孔运动的影响。结果表明,10μmol/L的NO供体硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)以及0.04%的乙烯能明显诱导蚕豆气孔关闭,并且二者共同处理后,能够增强其促进气孔关闭的作用。乙烯合成抑制剂AVG可以减弱NO诱导气孔关闭的程度,NO清除剂c-PTIO和NR抑制剂NaN3也可减弱乙烯诱导气孔关闭的程度,而一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)抑制剂L-NAME对乙烯诱导气孔关闭的作用不明显。推测,在调控蚕豆气孔关闭过程中,NO可能主要通过NR途径参与乙烯调控气孔关闭过程。     

人羊膜上皮细胞对脂多糖刺激下的RAW264.7 细胞向M1 极化的预防作 用及其初步作用机制

目的:本实验探讨人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells,h AECs)预防RAW264.7细胞在脂多糖(LPS)刺激后向M1极化的作用以及可能机制。方法:采用流式细胞仪检测细胞凋亡,划痕实验检测细胞迁移,ELISA检测细胞释放NO浓度,Real-time PCR检测白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)、精氨酸酶1(arginase-1,Agr-1)及甘露糖受体(mannose receptor,MR又称CD206)等基因表达情况,Western blotting检测RAW264.7胞质蛋白p-IκBα以及胞核蛋白NF-κB的表达。结果:RAW264.7培养基组与h AECs条件培养基干预组的凋亡率分别为5.68%±2.3%、6.68%±2.1%(p0.05)。LPS刺激组与h AECs条件培养基干预组两组的迁移率分别为42.03±0.07%、14.71±0.04%(p0.05);LPS刺激组与h AECs干预组两组NO释放量分别为27.73±10μM、13.33±6.43μM(p0.05);Real Time-PCR结果显示,h AECs干预组M1型巨噬细胞相关基因如IL-1β、TNF-α、iNOS以及INF-β的表达显著下调,M2型巨噬细胞相关基因如Arg-1、CD206、CD36等表达上调(p0.01)。Western blotting结果显示,hAECs干预组RAW264.7中胞质蛋白p-IκBа以及胞核蛋白NF-κB的蛋白含量降低。结论:h AECs与RAW264.7预培养能有效预防LPS刺激下RAW264.7向M1极化,其机制可能是通过抑制IκBα蛋白磷酸化来降低核内NF-κB的含量,从而抑制了M1型相关基因的表达。     

白术提取物苍术酮对脂多糖诱导的BV2细胞神经炎性影响及相关机制研究

研究旨在白术提取物苍术酮(AT)对脂多糖(LPS)诱导的BV2细胞抗炎作用,并探讨其相关机制。提取苍术酮并进行结构鉴定;以LPS诱导BV2细胞建立炎症模型;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞存活率;Griess反应检测细胞上清液中NO水平;ELISA法检测细胞上清中PGE2、IL-6、TNF-α水平;Western Blot法检测COX-2、iNOS、MAPK、NF-κB蛋白表达。结果表明LPS诱导BV2细胞后NO、PGE_2、IL-6、TNF-α水平和COX-2及iNOS蛋白表达显著增高,苍术酮预处理后均显著降低。进一步研究表明苍术酮可显著降低LPS诱导BV2细胞ERK、JNK、NF-κB蛋白表达。说明苍术酮能够有效预防LPS诱导BV2细胞神经炎性反应,机制与抑制炎症通路相关。     

亚硝基化谷胱甘肽还原酶: 一个调控炎症反应的新分子

炎症因子的表达调控是炎症反应的关键步骤,与自身免疫疾病以及癌症等密切相关．一氧化氮(nitric oxide,NO)在炎症因子表达调控中具有重要作用,但已有的研究多关注于NO合成对炎症因子的调控作用,而对NO代谢的作用知之甚少．亚硝基化谷胱甘肽还原酶(S-nitrosoglutathione reductase,GSNOR)是体内NO信号通路代谢调控的关键蛋白．本研究发现脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)在RAW264.7细胞中上调诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的同时下调GSNOR的转录和蛋白质表达,该下调作用依赖MEK1/2、p38和PI3K信号通路．抑制GSNOR可促进LPS诱导的炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达,而过表达GSNOR作用相反．抗炎症药物曲古抑菌素A (trichostatin A,TSA)能够挽回LPS对GSNOR的下调作用,并且GSNOR抑制剂削弱了TSA对炎症因子IL-6和TNF-α转录的抑制效应．这些结果表明：GSNOR是一个新的重要炎症调控分子,它可能成为调控NO介导的炎症相关信号通路的新的潜在靶点,上调GSNOR可能是抑制炎症的新思路．本研究揭示了巨噬细胞通过上调iNOS和下调GSNOR共同增强免疫炎症反应的新机制,拓展了对NO代谢在炎症反应中作用机制的认识．     

NF-κB信号通路与炎症反应

核转录因子kappaB(NF-κB)是细胞中重要的转录调节因子,通常以p50-p65异二聚体的形式与其抑制性蛋白(inhibitor kappaB,IκB)结合而呈非活化状态。NF-κB通过刺激因子(病毒、肿瘤坏死因子、B细胞活化因子、淋巴毒素等)的活化进而诱导多种基因的表达,产生多种细胞因子参与炎症反应。NF-κB通过复杂的分子调节参与机体的慢性炎症反应并产生一定的生理变化。本文阐述了NF-κB介导炎症反应的过程及相关研究进展。     

炎症因子相关基因在创伤失血性休克中的研究进展

近年来研究认为在创伤失血性休克的发生发展及液体复苏、缺血再关注过程中均伴随着炎症因子的变化,现将与炎症因子密切相关基因环氧化酶-2(COX-2)、核因子κB(NF-κB)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)、低氧诱导因子1α(HIF1α)、血红素氧合酶-1(HO-1)、寒冷诱导的RNA结合蛋白(CIRBP)在创伤失血性休克中的作用机制方面的研究及进展作一综述,为创伤失血性休克临床救治提供思路。     

MyD88抑制乙型肝炎病毒复制依赖活化NF-κB信号通路

目的 研究髓样细胞分化蛋白(MyD88)抗乙型肝炎病毒(HBV)效应的作用机制。方法 构建MyD88的截短突变体,获得核因子kappa B(NF-κB)超抑制剂IkBa-SR或者NF-κB信号通路激活剂IKKα/IKKβ的表达质粒,分别与HBV复制型质粒瞬时转染Huh7细胞,检测细胞上清液中HBeAg,HBsAg的表达以及胞质中HBV复制中间体DNA的含量,并以NF-κB依赖的荧光素酶报道系统检测它们活化NF-κB的程度。结果 MyD88全长蛋白和2个截短突变体M(1-151)、M(151-296)活化NF-κB的程度与其抑制HBV蛋白以及复制中间体DNA合成的能力相一致。与空载相比,表达NF-κB信号通路激活剂IKKα/IKKβ的质粒共同瞬转细胞后,转染MyD88和HBV表达质粒的细胞中NF-κB的通路明显活化,同时HBV core蛋白的合成显著降低;而NF-κB的超抑制剂IκBα-SR共同瞬转的细胞中core蛋白的表达量显著增加,检测细胞培养上清液中HBeAg和HBsAg及胞质中HBV复制中间体DNA的合成,得到相似结果。结论 NF-κB信号通路的活化在MyD88抑制HBV复制中发挥了关键作用     

解脲脲原体脂质相关膜蛋白通过激活核因子κB调控诱导性一氧化氮合酶在小鼠巨噬细胞中的表达

为探讨解脲脲原体(Uu)的脂质相关膜蛋白(LAMPs)诱导小鼠巨噬细胞表达诱导性一氧化氮合酶(iNOS)的分子机制,从解脲脲原体提取的脂质相关膜蛋白,刺激小鼠巨噬细胞,以RT_PCR、Western blot等方法分析iNOS的表达及NO的产生;用细胞免疫化学、间接免疫荧光及Western blot等方法检测核因子κB(NF_κB)的激活,另外检测了NF_κB的特异性抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)和蛋白酶抑制剂放线菌酮(CHX)对iNOS的表达及NF_κB激活的影响。结果表明,解脲脲原体的LAMPs通过激活NF_κB诱导小鼠巨噬细胞表达iNOS的mRNA和蛋白,且能以时间和剂量依赖方式刺激小鼠巨噬细胞产生NO,NF_κB的抑制剂PDTC或蛋白酶抑制剂放线菌酮(CHX),可抑制NF_κB的激活及iNOS的表达。由于解脲脲原体的脂质相关膜蛋白通过激活NF_κB诱导小鼠巨噬细胞表达iNOS和产生NO,因而可能是一个重要的致病因素。