定位于5q31-5q32的DFNA52的20个候选基因的突变筛查

为了克隆定位于5号染色体微卫星标记D5S2056和D5S638之间约8.8 cM的区间内的非综合征性常染色体显性遗传性耳聋 DFNA52 (OMIM: 607683)的致病基因, 文章根据基因在耳蜗组织的表达情况, 筛选出20个候选基因, 设计合成了扩增20个基因外显子及外显子与内含子交界的引物, 用DNA直接测序法进行序列变异分析。结果显示, 在基因外显子及侧翼区共发现了45个单核苷酸多态, 其中42个变异在多态数据库已报道, 其余3个为新发现的单核苷酸多态, 序列变异与疾病表型无共分离现象, 排除了这些基因外显子突变导致遗传性耳聋的可能性。     

播散性浅表性光线性汗孔角化症DSAP1位点的精细定位和候选基因的突变检测

播散性浅表性光线性汗孔角化症(DSAP)是一种以多个浅表的角化性皮损,边缘轻微嵴状角化性隆起为特征的少见的慢性角化性皮肤病,呈常染色体显性遗传。以往的研究将该病基因定位于12q23．2—24．1区域(DSAP1)和15q25．1-26．1区域(DSAP2)。本研究对2个无关的六代DSAP家系进行了全基因组扫描和连锁分析,结果显示,这2个DSAP家系在D12窝4位点的最高累积LOD值为8．28(θ=0．00)。单倍型分析结果显示,这2个DSAP家系致病基因位于12q24．1-q24．2(D12S330和D12S354)之间8．0cM的区域内。该区域与DSAP1的致病区域部分重叠。对重叠区域内6个候选基因(CRY1,PWP1,ASCL4,PRDM4,KIAA0789和CMKLR1)的编码区进行序列分析,在DSAP病人中未发现突变位点。提示该6个候选基因可能与这2个DSAP家系的发病机理无关。     

PCR－SSCP检测肺癌细胞p53基因点突变

应用溴化乙锭(EB)染色的PCR-SSCP技术对10例非小细胞性肺癌组织标本p53基因外显子5～8进行分析,其中1例在外显子5～6;1例在外显子7;2例在外显子8发现异常电泳带.对1例经SSCP检测异常的p53基因进行核酸序列分析,发现第280位密码子由AGA变成ACA,其编码的氨基酸由丝氨酸变成半胱氨酸.结果证实:非小细胞性肺癌与p53基因突变有关;EB法PCR-SSCP技术是一种简便、可靠的点突变检测法.     

原发性肝癌染色体8p、16q 遗传变异的研究

目的:分析人肝癌(HCC)组织中染色体8p、16q部分基因及染色体片段的遗传变异及与临床病理关系,初步筛选HCC相关的抑癌基因。方法:应用聚合酶链反应-变性聚丙烯酰胺凝胶-银染法分析45例HCC组织标本中染色体8p和16q的杂合性丢失(LOH)及微卫星不稳定性(MSI)。结果:发生LOH的总频率为68.89%(31/45),其中D16S511位点的发生LOH率最高为53.33%(24/45),其次是D8S261(39.02%,16/41)和D8S499(34.88%,15/43)。MSI出现的总频率为11.11%(5/45),出现在三个微卫星位点(D8S261、D8S499及D16S511)上。结论:染色体16q23、8p22-21.3及8p12区域的LOH发生频率高,其可能存在与HCC发生发展相关的新的抑癌基因,特定位点的遗传变异可能与HBV感染、临床病理恶性程度等预后因素相关。     

候选抑癌基因 ING1的研究进展

人候选抑癌基因ING1定位于13q33-34,有3个外显子和2个内含子。ING1mRNA至少有3种变位剪接形式,分别编码3种不同的蛋白质：p47ING1a,p33ING1b和p24ING1。ING1与p53相互作用能够抑制细胞的生长,促进细胞凋亡。在一些肿瘤中还发现ING1表达下调或ING1突变。P33ING1b参与mSin3复合体的形成而介导转录抑制。     

27例雄激素不敏感综合征患儿AR基因突变

雄激素受体(AR)基因突变是雄激素不敏感综合征(AIS)的主要直接原因,本研究是为了了解中国病人AR基因突变谱.本研究根据病史、查体、激素检测、染色体核型分析及影像学检查结果,确诊AIS患儿27例.收集患儿及其部分家属静脉抗凝血,提取DNA,合成外显子1~8及外显子和内含子剪切处引物, PCR扩增,扩增产物送公司测序,分析AR基因突变情况.结果提示, 27例AIS患儿共发现突变23个, 10例携带5个相同突变(p.R841H, p.P914S,p.S176R, p.Y572S和p.Y782N),未报道突变11个. 8/27例家族史阳性. 12个已知突变中,仅1个为内含子4的剪切突变:c.2173+1GT;余均为点突变,含1个已报道的第6外显子的新生突变:p.R775C. 2例病人具有相同第8外显子突变:p.P914S,患者均表现为CAIS,与报道的PAIS不符;其余临床分型与已经报道的分型一致.未报道突变中,点突变为8/11个,另有2个碱基缺失导致的移码突变:p.345fs和p.828_829del, 1个碱基插入导致的移码突变:p.885fs, 1例病人携带两个点突变:p.Y365C和p.E898D.突变由多至少在外显子的分布:外显子7有6例患儿5个不同突变;外显子8有5例患儿4个突变,外显子1和5各有3个突变;外显子2, 3, 4和6各有2个不同突变. 23个突变在功能区的分布情况:16个突变位于LBD, 4个位于DBD, 3个位于NTD.本研究报道了不同AIS表型AR的突变谱, 50%为未报道突变,进一步丰富了AR数据库.错义突变是主要形式,且大部分位于LBD区.携带相同突变的病人可呈现不同表型.     

KIF21A基因的p.Arg954Trp突变引起中国人先天性眼外肌纤维化

一型先天性眼外肌纤维化（Congenital fibrosis of the extraocular muscles, CFEOM）是一种罕见的常染色体显性遗传的眼肌疾病,临床上主要表现为动眼神经缺陷而引起的斜视。本研究鉴定了具有四代病人的一个呈常染色体显性遗传的CFEOM1家系,连锁分析表明致病基因与染色体12q处的微卫星标记D12S85紧密连锁,最大LOD值为2．1。对D12S85附近的CFEOM1基因K1F21A进行突变检测,在K1F21A基因第21个外显子发现有一C→T的碱基替换,该变化引起K1F21A基因的第954位密码子由精氨酸突变为色氨酸,SSCP结果表明该家系中的所有患者都具有这一突变,而在家系中的所有正常人以及150个正常汉人对照中则不能检测到这一改变。我们的研究表明,K1F21A的p．Arg954Trp突变是引起这一先天性眼外肌纤维化家系病人患病的致病原因。     

p16基因甲基化与表达在子宫内膜癌中的意义

肿瘤抑制基因p16定位于9号染色体短臂2区1带,编码细胞周期调节蛋白p16,p16基因失活将导致细胞增殖失控。研究证实肿瘤抑制基因启动子区域5CpG岛甲基化是导致转录水平上基因失活的重要机制。为了研究p16基因甲基化状态及其表达异常与子宫内膜癌发生的关系,采用甲基化特异性PCR(MSP)、免疫组化及PCR方法检测62例子宫内膜癌及相应癌旁组织、10例相应年龄正常子宫内膜中p16基因5′cpG岛甲基化状态、p16蛋白表达及p16基因外显子E,和E：表达缺失情况。结果表明癌旁及正常子宫内膜p16基因无甲基化,且无p16蛋白、外显子1和2的表达异常。62例子宫内膜癌中,15例甲基化,占24、2％;33例p16蛋白表达下降或无表达,占54．8％;p16基因外显子1缺失率16．1％(10／62),外显子2缺失率为30．6％(19／62),两者均缺失9．68％(6／62),至少其中1种缺失46、6％(29／62)。提示P16基因失活在子宫内膜癌中多见且与病理分级、临床分期密切相关。D16基因甲基化在子宫内膜癌的发生中起着重要作用。MSP法测定基因甲基化状态准确且简便可行。     

男性性腺功能减退症的致病基因分析

[目的]通过全外显子组测序(WES)技术筛选男性性腺功能减退症的致病基因,并对基因突变位点进行生物信息学分析。[方法]收集5例男性性腺功能减退症患者临床及遗传学检测资料。采用WES技术筛选相关致病基因,并通过PCR扩增、Sanger测序以及生物信息学分析等验证突变位点。[结果]先证者1为PROKR2基因c.533G>C(p.W178S)纯合突变,家系验证结果发现其父母均为PROKR2基因c.533G>C(p.W178S)杂合突变携带者,符合常染色体隐性遗传。先证者2为ZFPM2基因c.1498C>G(p.Q500E)杂合突变,生物信息学分析发现,该突变位点编码的氨基酸在不同物种中高度保守,并在人类外显子数据库、参考人群千人基因组1000G、SNP数据库及人群基因组突变频率数据库中未发现该突变位点,该突变经SIFT、Polyphen2和Mutation Taster软件预测结果均为有害。[结论]PROKR2基因c.533G>C(p.W178S)和ZFPM2基因c.1498C>G(p.Q500E)突变可能是男性性腺功能减退症的致病原因。     

孤独症研究新进展:新发突变及CHD8功能

孤独症(即自闭症谱系障碍)是最常见的儿童中枢神经系统发育紊乱疾病。目前尚无特效治疗药物。最新的突破性进展是通过外显子组测序发现了一批与孤独症相关的单基因新发突变(de novo mutation)。在筛查到的众多孤独症相关新突变基因中,染色体结构域解旋酶DNA结合蛋白8(chromodomain helicase DNA-binding protein 8,CHD8)突变频率最高,是一个重要的孤独症候选致病基因。CHD8与p53、β-catenin等转录因子结合,具有复杂的转录调控作用。孤独症致病基因的发现为孤独症的诊断和治疗提供了分子靶标。     

青鳉p53基因克隆、结构分析及同源重组载体构建

应用“Long PCR”技术 ,用 6对 p5 3引物从青胚胎干细胞基因组DNA中扩增出 6个相互重叠的片段 ,其中最大的片段长达 4 5kb ,这 6个PCR片段覆盖了整个 p5 3基因。序列分析表明青p5 3基因长约 8 7kb ,由 11个外显子和 10个内含子组成。结构比较表明 ,青 p5 3基因在大小上与人和小鼠 p5 3基因存在较大差异。青p5 3基因的内含子 1仅为 0 85kb ,而人和小鼠p5 3基因的内含子 1则分别长达 10kb和 6kb ;青 p5 3基因的外显子 3(86bp)明显大于人和小鼠 p5 3基因的外显子 3(2 2bp) ;外显子 4 (170bp)比人 (2 80bp)和小鼠 (2 6 0bp)的外显子 4小 ;内含子 10 (3 5kb)则比人和小鼠内含子 10 (0 7kb和 0 9kb)大得多。用SVTK neo基因作正选择标记基因 ,用SVTK tk基因作负选择标记基因 ,用青 p5 3基因组片段作同源序列 ,构建了鱼类 p5 3基因同源重组载体。将此载体转染青胚胎干细胞 ,并经G4 18和Ganc药物选择后证明上述正、负选择标记基因在干细胞中能够有效表达 ,并提供对G4 18的抗性和对Ganc的敏感性。     

应用全外显子测序和显微切割技术识别1 例肺癌患者高频突变基因的异质性探索

目的:通过对一例肺鳞癌患者全外显子测序来识别这例肺癌的可能致病基因,并通过显微切割初步探索这例肺癌肿瘤细胞的起源与演化。方法:利用全外显子测序技术对肺癌肿瘤组织和相应癌旁组织测序;用COSMIC肿瘤数据库比较分析统计出肺癌可能致病基因;用激光显微切割技术提取五个不同部位肿瘤细胞;巢式PCR扩增,一代测序验证基因分型。结果:发现了这例肺癌病人的7个高频突变基因:LPHN2、TP53、MYH2、TGM2、C10orf137、MS4A3和EP300;这些基因在10×镜下和20×镜下经显微切割的肺癌组织的5个不同部位上的基因分型不同。结论:我们通过全外显子测序发现了这例肺癌的7个可能致病基因,并初步探索了这例肺癌肿瘤细胞是多克隆起源的。     

原发性肝癌染色体8p、16q遗传变异的研究

目的：分析人肝癌（HCC）组织中染色体8p、16q部分基因及染色体片段的遗传变异及与临床病理关系,初步筛选HCC相关的抑癌基因。方法：应用聚合酶链反应-变性聚丙烯酰胺凝胶-银染法分析45例HCC组织标本中染色体8p和16q的杂合性丢失（LOH）及微卫星不稳定性（MSI）。结果：发生LOH的总频率为68.89%（31/45）,其中D16S511位点的发生LOH率最高为53.33%（24/45）,其次是D8S261（39.02%,16/41）和D8S499（34.88%,15/43）。MSI出现的总频率为11.11%（5/45）,出现在三个微卫星位点（D8S261、D8S499及D16S511）上。结论：染色体16q23、8p22-21.3及8p12区域的LOH发生频率高,其可能存在与HCC发生发展相关的新的抑癌基因,特定位点的遗传变异可能与HBV感染、临床病理恶性程度等预后因素相关。     

GCK基因和HNF-1α基因突变的研究

目的:研究一典型的青少年发病的成人型糖尿病家系并研究其基因突变位点。方法:以1个典型MODY家系的7名成员为研究对象,同时以10名无糖尿病家族史的普通2型糖尿病患者和10名健康人员为2个对照组。抽取外周血,分离白细胞,用快速盐析法提取基因组DNA,以基因组DNA为模板对HNF-1α基因的4号、2号和6号外显子和GCK基因的1号外显子进行PCR扩增,扩增产物经纯化后直接进行序列测定,并分别和各自的正常序列进行比较。结果:7名MODY家系成员HNF-1α2号外显子上游的内含子均存在一碱基G→A置换,即IVS2nt-42 G-A;4例存在HNF-1α6号外显子P380fsinsG移码突变,其中1例合并P379S点突变和IVS6nt-4G-A突变;1例存在P379S点突变;2例未发现突变和多态性。GCK基因的1号外显子及其内含子均未发现有突变或多态性。20名对照组成员均未发现有GCK1号外显子和HNF-1α2、4、6号外显子及其内含子的突变。结论:本家系是HNF-1α基因的6号外显子及其上游内含子突变(移码突变和/或点突变)和2号外显子上游内含子的一个碱基突变,该家系MODY属于MODY3。     

miR-490-3p通过靶向调控TGFBR1抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭

目的:以非小细胞肺癌A549细胞为模型,探讨miR-490-3p在肺癌发生发展过程中的作用及其调控机制。方法:通过miRBase数据库获得miR-490-3p序列,设计miR-490-3pmimics并转染A549细胞,CCK8、细胞划痕及Transwell实验分别检测miR-490-3p过表达对A549细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;使用miRwalk在线工具预测miR-490-3p可能的调控基因,通过实时荧光定量PCR及Western印迹对候选调控基因进行筛选,最后通过双萤光素酶报告基因实验验证miR-490-3p与调控基因之间的靶向关系。结果:过表达miR-490-3p可显著抑制A549细胞的增殖、侵袭和迁移能力;在预测的miR-490-3p候选靶基因中,选择与细胞增殖、迁移等表型相关的RASAL2、TGFBR1、PAPPA、HMGA2、TGFA靶基因进行实时荧光定量PCR及Western印迹筛选,结果仅TGFBR1基因在mRNA和蛋白水平的表达与miR-490-3p水平呈负相关,且双萤光素酶报告实验证实miR-490-3p可直接与TGFBR1的3'-UTR结合并抑制其表达。结论:miR-490-3p通过靶向调控TGFBR1的表达抑制非小细胞肺癌A549细胞的增殖和侵袭。     

喉癌中p15、p16基因纯合缺失与EGFR基因扩增相关性研究

研究p15、p16基因缺失和EGFR基因扩增的相关性及其与喉癌发生、发展的关系。提取喉癌新鲜组织中基因组DNA,采用聚合酶链反应技术,分别对30例喉癌进行p15基因第2外显子(p15E2)和p16基因第2外显子(p16E2)进行纯合缺失研究;应用FISH方法进行喉癌实体瘤EGFR基因扩增研究。p15E2纯合缺失率为13．3％(4／30),p16E2纯合缺失率为16．7％(5／30),p15E2、p16E2共同缺失率为6．7％(2／30)。在30例喉癌实体瘤EGFR基因扩增频率为30％(9／30),扩增2～8倍。p15E2和p16E2纯合缺失以及二者共同缺失与EGFR基因扩增相关,可能引起细胞周期失控而导致细胞增殖紊乱,在喉癌的发生及恶性进展中发挥一定作用。     

一VHL 家系致病基因突变的检测与分析*

目的:研究中枢神经系统血管母细胞瘤(VHL)基因突变的主要类型和发生情况,探讨VHL疾病发生的原因、临床特点等。方法:以基因组DNA为模板,PCR扩增VHL基因3个外显子及5’UTR区域,结合DNA直接测序的方法,对一个有多个小脑血管母细胞瘤患者的家系进行VHL基因突变检测。结果:发现该家系VHL基因5’UTR区、外显子1和外显子2正常,外显子3存在c.499C>G的改变,为一个错意突变,氨基酸改变为Arg-Gln(p.R167Q),该突变是导致这个家系的患者发病的直接原因。结论:VHL疾病的突变主要集中在VHL蛋白的α、β结构域,位于α结构域的p.R167Q突变为该VHL家系致病的主要原因。     

人肝癌细胞p53基因的表达及其对细小病毒H-1的敏感性

本文利用单链构象多态性分析,17号染色体短臂等位基因杂合性分析,Northern印迹,免疫沉淀,p53基因第7外显子酶切等技术检测了两个中国人肝癌细胞系SMMC-7721,YY-8103和一个自发转化的人肝细胞系L-02的p53基因结构与表达。实验表明,这三个细胞系中没有出现17号染色体短臂等位基因杂合性缺失,第4—9外显子也没发生突变,但其mRNA和蛋白表达水平很低。利用MTT比色分析法研究了这三个细胞系和其他已知p53基因背景的八个人肝癌细胞系(QGY-7703、PLC/PRF/5、Huh-7、Hep3B、FOCUS、Tong/ HCC、SK-Hep-1、HepG2)对自主性细小病毒H-1的敏感性。除HepG2细胞外,其他十个细胞系p53基因的结构和/或表达都不正常。经H-1感染(moi=20)后,其敏感性均高于HepG2细胞。本研究初步表明了p53基因结构或表达的不正常可能导致人肝癌或转化细胞对H-1的敏感性的提高。     

磺酰脲受体1基因多态性与2型糖尿病的相关性

目的：研究磺酰脲受体1（sulfonylurea receptorl,SUR1）基因外显子16-3c／t多态性与湖北汉族人群2型糖尿病的相关性。方法：采用同胞对（2型糖尿病人及其正常同胞）和随机病例一对照两种实验设计,应用PCR-RFLP方法分析共405个样本的SUR1基因外显子16-3c／t多态性,并测定身高、体重、腰围、臀围、血压、空腹血糖等生理生化指标。结果：两种实验设计中病例组与对照组的基因型和等位基因频率均无显著性差异（P〉0．05）。结论：在湖北汉族人群中未发现SUR1基因外显子16-3c／t多态性与2型糖尿病之间存在关联,该基因座可能不是该人群的致病基因。     

冠状动脉粥样硬化性心脏病8号染色体基因扫描

冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronary heart disease,CHD)的全基因组扫描研究在世界各大研究中心展开,关于CHD易感基因位点的报道多集中于1号、3号、9号、11号、16号染色体,对8号染色体的研究报道甚少。在汉族人群中未见关于CHD的8号染色体的基因扫描研究。文章旨在查找汉族人群中CHD易感基因位点,选取8号染色体上间隔10 cM遗传距离的13个微卫星遗传位点,采用DNA混合池的方法对CHD患者组156例和正常对照组1 000例DNA样本进行基因扫描,经卡方检验分析患者组和对照组每个位点的等位基因频率差异。发现在患者组与对照组中D8S264位点(8p23.3-p23.2)及D8S285位点(8q12.1)的等位基因频率差异有统计学意义(P<0.05)。汉族人群中CHD患者8号染色体上8p23.3-p23.2、8q12.1区域可能存在CHD易感基因,需要进行候选基因突变筛查。