HIV-1 Gag多表位嵌合基因的构建及表达蛋白的抗体制备

旨在通过构建Gag的抗原多表位融合基因及在原核系统的高表达,为HIV诊断及可能的疫苗制备提供试验基础。选定HIV-1 Gag基因中3个片段包含较多抗原表位的区域,设计带有酶切位点的引物,用PCR的方法从HIV-1HXB2全基因扩增编码这3个片段的基因序列,通过质粒提取、酶切、测序方法鉴定基因片段的正确性,SDS-PAGE和Western blotting测定融合蛋白的表达,并免疫动物制备相应抗体。结果显示,构建的HIV-1 Gag多表位嵌合基因的原核表达质粒,酶切和测序结果表明基因序列正确,基因全长576bp。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达的重组蛋白分子量为27kD,以包涵体的形式存在。纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体IgG。ELISA和免疫荧光方法检测显示制备的多克隆抗体能具有特异性反应。成功构建和高表达了HIV-1 Gag多表位融合蛋白,纯化蛋白制备的抗体与HIV-1Gag有特异性结合。为进一步研究HIV-1奠定了试验基础。     

EV71病毒中和表位和诺如病毒P结构域嵌合蛋白的原核表达

目的:构建肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)的线性中和抗原表位与诺如病毒P结构域融合基因的重组质粒,在大肠杆菌中表达诺如病毒P结构域与EV71中和抗原表位的嵌合蛋白。方法:根据已报道的3个EV71线性中和抗原表位的氨基酸序列,按大肠杆菌密码子表达使用的偏好性优化和设计各线性中和抗原表位的核苷酸序列,将这些表位以单个或不同的组合克隆至含诺如病毒P结构域和GST标签的质粒中,经测序确认后,分别转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,通过IPTG诱导融合蛋白表达。用GST融合蛋白纯化磁珠对融合蛋白进行纯化,最后通过免疫印迹法确认融合蛋白的表达及嵌合蛋白的抗原性。结果:测序结果表明,成功地构建了含EV71病毒3个单表位和4个串联中和抗原表位的诺如病毒P结构域重组质粒,而且这7个含线性中和抗原表位的嵌合蛋白在大肠杆菌中都以可溶形式得到了表达。免疫印迹分析表达蛋白的抗原性结果表明,表达的嵌合蛋白都能与抗诺如病毒P结构域抗血清反应。除了含单表位的SP55和SP28嵌合蛋白外,其它的嵌合蛋白均能与抗EV71病毒的抗血清反应。结论:成功地在大肠杆菌中表达了诺如病毒P结构域和EV71病毒中和抗原表位的嵌合蛋白,且具有抗原性,这为诺如病毒和EV71病毒的二价疫苗及检测方法的研发奠定了基础。     

重组B群脑膜炎球菌fHBP融合蛋白的表达和免疫原性研究

采用PCR构建编码B群脑膜炎球菌fHBP蛋白V<,1>变异型全长序列和V<,2>变异型C结构域抗原表位融合蛋白的基因片段.并克隆入pET30a<'(+)>载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),在其实现表达,表达量约占菌体蛋白总量的30%.表达产物经离子交换层析纯化后,获得了纯度达到90%以上的融合蛋白.将融合蛋白免疫小...     

HIV-1 gp160多表位嵌合基因的构建及表达蛋白的免疫原性分析

HIV感染引起的AIDS已经成为严重影响人类健康和社会发展的全球性疾病。酶联免疫吸附试验和免疫印迹检验组合则被认为是HIV检测的“金标准”。因此本实验构建gp160的抗原多表位融合基因及在原核系统的高表达, 为HIV抗体测定提供特异、价廉的抗原。选定HIV-1 gp160基因中三个片段包含较多抗原表位的区域, 设计带有酶切位点的引物,用PCR的方法从HIV-1HXB2全基因扩增编码这三个片段的基因序列,通过质粒提取、酶切、测序方法鉴定基因片段的正确性, SDS-PAGE和Western Blot测定融合蛋白的抗原特异性。构建的HIV-1 gp160多表位嵌合基因的原核表达质粒,酶切和测序结果表明基因序列正确,基因全长969bp。在大肠杆菌BL21(DE3) 中高效表达的重组蛋白分子量为37kDa,以包涵体的形式存在。应用western blot测定10例正常人和12例HIV/AIDS病人血浆显示HIV-1 gp160多表位融合蛋白具有良好的抗原特异性。成功构建了高表达 HIV-1 gp160多表位蛋白的原核表达系统,纯化的融合蛋白有较强的抗原特异性。     

轮状病毒VP4抗原表位在VP6载体蛋白同一位点表达比较研究

目的:评价轮状病毒(RV)VP4两个抗原表位插入VP6载体蛋白同一位点所表达的重组嵌合蛋白免疫学性质及在研制嵌合蛋白疫苗中的意义。方法:采用分子克隆和基因重组技术将RV VP4的两个抗原表位插入到VP6载体蛋白同一位点上,构建重组抗原表达质粒,表达携带不同抗原表位的重组嵌合蛋白,用Western blot和中和试验分析重组嵌合蛋白的抗原反应性和免疫原性。结果:成功构建了两个嵌合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达;表达的嵌合蛋白可与相应抗体特异性反应;可诱导豚鼠产生特异性血清抗体;抗嵌合蛋白血清抗体可特异性识别载体蛋白VP6F,Wa株病毒的VP6和VP4蛋白,可中和Wa株病毒在MA104细胞上的感染性;结果表明,所构建和表达的两个以VP6为载体的VP4抗原表位嵌合蛋白具有较高抗原反应性和免疫原性;嵌合蛋白携带的VP4抗原表位具有增强载体蛋白免疫原性作用;为研制新型RV重组蛋白疫苗的奠定了较好的基础。     

重组牛乳源金黄色葡萄球菌GapC蛋白优势B细胞抗原表位的预测和筛选

旨在表达牛乳源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)GapC蛋白并对其B细胞抗原表位进行预测与鉴定，本研究利用实验室分离鉴定的S. aureus分离株15119扩增GapC基因并构建重组表达质粒pET-28a-GapC，诱导纯化得到分子量为44 kD重组蛋白GapC，以此免疫新西兰大白兔，获得特异多克隆抗体。利用生物信息学方法，对GapC蛋白的二级及三级结构进行分析，预测其B细胞抗原表位，并利用特异性抗体对筛选的表位进行鉴定。结果表明，GapC蛋白具有良好的免疫原性，筛选出7个线性B细胞抗原表位，利用兔抗重组GapC蛋白多克隆抗体鉴定得到了PL 5(²²¹ IPEIDGKLDGGAQRVP²³⁶)多肽和PL 7(²⁶⁴KNASNESFGYTEDEIVSSDVVGM²⁸⁶)2个优势B细胞表位。本研究成功制备了GapC蛋白，预测并鉴定了2个优势抗原表位，为其嵌合表位疫苗的开发提供了技术支持。     

富亮氨酸重复超家族新成员LRRC4的IgC2结构域蛋白的原核表达和纯化

富亮氨酸重复超家族新成员LRRC4基因是新克隆的脑瘤相关基因,采用多聚酶链式反应（PCR）方法获得长约500bp含IgC2结构域的DNA序列,扩增产物克隆至pGEX-4T-2质粒中,构建GST融合表达质粒,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,经包涵体沉淀,溶解,Glutathione-Sepharose亲和层析纯化获得融合蛋白,并以Western blot鉴定证实,通过IgC2结构域蛋白的纯化分离该结构域,为进一步研究该结构域及LRRC4基因的结构和功能奠定了基础。     

质粒介导的AmpC β-内酰胺酶共有抗原表位的预测及原核表达

目的 应用生物信息学方法预测质粒介导的AmpC β-内酰胺酶(pAmpCs)共有抗原表位,并实现pAmpCs共有抗原表位-Trx融合蛋白的原核表达、纯化和鉴定。 方法 运用多序列比较工具找出各型质粒介导的AmpC β-内酰胺酶的共有相对保守区域,并利用分子生物学软件Biosun预测各亚型pAmpCs的可及性、抗原性、抗原表位、柔性、亲水性等参数,通过综合分析后找出其共有的抗原表位区域pAmpCs1。根据大肠杆菌的密码子偏好性,把氨基酸序列pAmpCs1转变为核苷酸序列pampcs1,采用重叠延伸PCR合成pampcs1片断,并构建原核表达载体pET32a(+)/pampcs1。通过测序验证,对含有该重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析后,用Ni-NTA亲和层析法纯化pAmpCs1-Trx融合蛋白,利用western blotting方法鉴定融合蛋白的抗原性。 结果 根据预测结果找到了一段各型pAmpCs共有的抗原表位区域pAmpCs1,成功构建了原核表达载体pET32a(+)/pampcs1,经IPTG诱导后得到了分子量约为23KD的融合蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,通过western blotting鉴定该蛋白能被抗AmpC β-lactamases多抗识别。 结论 成功构建了pAmpCs1-Trx融合蛋白原核表达载体,并获得了高纯度的pAmpCs1-Trx融合蛋白,初步证明它的抗原性,为制备特异性抗体及建立快速检测方法打下了良好的基础。     

人绒毛膜促性腺激素β亚基单一B-细胞表位(β5、β9或β8)融合蛋白的表达和纯化

作为开发新型实用性人绒毛膜促性腺激素(hCG)疫苗的一种尝试, 我们已构建若干组合靶抗原三个线性B- 细胞表位和外源强T- 细胞表位的基因工程hCG嵌合肽。为了检测用这些嵌合肽免疫的动物血清中是否能产生抗各表位的三种抗体,本研究选用能在大肠杆菌中高表达和与生物素亲和性强且特异(方便通过亲和层析纯化)的链霉亲和素为载体,分别构建了三种含β-hCG不同单一线性B_细胞表位(β5,β9和β8)的融合蛋白。在链霉亲和素基因下游多克隆区EcoRⅠ和Hind Ⅲ位点插入各表位编码基因片段(带TAA终止密码子)的pTSA-18重组质粒, 转化BL21(DE3)pLysS宿主菌后, 它们在IPTG诱导下均能以较高水平表达各自目的融合蛋白,而且它们的表达产物在Western blot鉴定中都能被抗各表位特异的多抗或单抗或抗报告表位单抗识别。用改良的制备性PAGE方法可以一步纯化电泳均一性高于95%的三个融合蛋白, 它们的收得率相对1L培养物约为5 mg。作为化学合成表位肽的替代物, β-hCG三个单一B- 细胞表位融合蛋白的可获得性将有助于所构建hCG基因工程嵌合肽以及其他hCG疫苗,也包括它的DNA疫苗的免疫原性分析。     

单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白G主要抗原表位的表达和抗原性检测

利用PCR拼接技术,合成含单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白G(gG2)抗原表位(氨基酸序列第561～578位)的片段,并进一步利用基因工程技术获得该表位的双拷贝片段,克隆入pET-KDO表达载体进行原核表达.经IPTG诱导后,高效表达出分子量大小约为39kDa的融合蛋白,经Western blot检测具有良好的抗原性.表达的融合蛋白经凝血酶切割和亲和层析纯化,得到双拷贝gG2(561～578aa)目的蛋白,经ELISA检测具有良好的灵敏度和特异性.该重组抗原的构建和表达可用于HSV-2特异性血清学诊断的研究.     

表达鸡白细胞介素2重组鸡痘病毒的构建及其体外表达产物生物活性的检测

从ConA刺激的鸡脾细胞中扩增出鸡白细胞介素2（ChIL-2）基因编码区。将该编码区Cdna序列和调控其转录的鸡痘病毒早晚期启动子（PE/L）的基因片段定向克隆到鸡痘病毒转移载体p1175中,获得重组转移载体P1175il2,然后转染已感染鸡痘病毒282E4疫苗株（wt-FPV）的鸡胚成纤维细胞（CEF）,质粒P1175il2与wt-FPV基因组DNA发生同源重组,产生了表达ChIL-2的重组鸡痘病毒Rfpv-IL2。通过在含X-gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑,获得并纯化重组鸡痘病毒Rfpv-IL2。应用XTT/PMS方法检测的Rfpv-IL2 （M.O.I 2.0）感染CEF 72小时后细胞上清中表达的重组ChIL-2生物活性,效价为3.6×105u/Ml,表明Rfpv-IL2能有效地表达ChIL-2。下一步将利用Rfpv-IL2在体内表达ChIL-2,研究ChIL-2的免疫增强作用及其作用机理。     

Nitric Oxide Inducing Function and Intracellular Movement of Chicken Interleukin-18 in Cultured Cells

To evaluate the characteristics of chicken interleukin-18 (ChIL-18) in different forms in vitro,the ChIL-18 full-length gene (ChIL-18-F) and the ChIL-18 presumed mature protein gene (ChIL-18-M) werecloned and inserted into the eukaryotic expression vector pCI,to construct recombinant pCI-ChIL-18-Fand pCI-ChIL-18-M.The recombinant plasmids were then transferred into chicken splenic lymphocytes(CSLs).Western blot showed that ChIL-18-F,with a molecular weight of 23.0 kDa,was produced in CSLstransfected by pCI-ChlL-18-F;ChIL-18-M,with a molecular weight of 19.5 kDa,was produced in CSLstransfected by pCI-ChIL-18-M.The nitric oxide (NO) level in the transfected CSLs and the culture mediumat different time points was further examined under confocal microscopy using 4.5-diaminofluoresceinstaining.The results showed that both pCI-ChIL-18-F and pCI-ChIL-18-M groups showed significantincrease in intracellular and extracellular NO production compared with pCI transfected control cells.Theseresults suggest that both ChIL-18-F and ChIL-18-M could stimulate NO secretion in CSLs.To characterizethe intracellular distribution of ChIL-18,ChIL-18-F and ChIL-18-M were each fused to the enhanced greenfluorescent protein gene,and expressed in Vero cells.The results showed that the ChIL-18-F tended to themembranous region in Vero cells,while ChIL-18-M did not.This indicates that the N-terminal 27 amino acidpeptide helped ChIL-18 target to Veto cell membranes.     

Nitric oxide inducing function and intracellular movement of chicken interleukin-18 in cultured cells

To evaluate the characteristics of chicken interleukin-18 （ChIL-18） in different forms in vitro, the ChIL-18 full-length gene （ChIL-18-F） and the ChIL-18 presumed mature protein gene （ChIL-18-M） were cloned and inserted into the eukaryotic expression vector pCI, to construct recombinant pCI-ChIL-18-F and pCI-ChIL-18-M. The recombinant plasmids were then transferred into chicken splenic lymphocytes （CSLs）. Western blot showed that ChIL-18-F, with a molecular weight of 23.0 kDa, was produced in CSLs transfected by pCI-ChIL-18-F; ChIL-18-M, with a molecular weight of 19.5 kDa, was produced in CSLs transfected by pCI-ChIL-18-M. The nitric oxide （NO） level in the transfected CSLs and the culture medium at different time points was further examined under confocal microscopy using 4,5-diaminofluorescein staining. The results showed that both pCI-ChIL-18-F and pCI-ChIL-18-M groups showed significant increase in intracellular and extracellular NO production compared with pCI transfected control cells. These results suggest that both ChIL- 18-F and ChIL- 18-M could stimulate NO secretion in CSLs. To characterize the intracellular distribution of ChIL-18, ChIL-18-F and ChIL-18-M were each fused to the enhanced green fluorescent protein gene, and expressed in Vero cells. The results showed that the ChIL-18-F tended to the membranous region in Veto cells, while ChIL- 18-M did not. This indicates that the N-terminal 27 amino acid peptide helped ChIL-18 target to Vero cell membranes.     

Expression of Chicken Interleukin-2 in Insect Cells

Full-length chicken interleukin-2 (ChIL-2) protein was successfully expressed using the recombinant baculovirus/Sf9 insect cell system. The expressed protein was soluble and reached approximately 12 microg/ml. Similarly to native ChIL-2, baculovirus expressed ChIL-2 revealed two main bands corresponding to molecular masses of 22 and 20 kD as detected by SDS-PAGE and Western blot. Treatment of the expressed protein with N-endoglycosidase F for 2 h caused the complete disappearance of the 22 kD band, while the 20 kD band (which is close to the molecular weight predicted from the cloned cDNA sequence) remained unchanged. Together with results on native ChIL-2, it can be concluded that ChIL-2 is an N-glycosylated protein.     

Chicken interleukin-6. cDNA structure and biological properties.

Suppression subtractive hybridization technology was used to identify differentially expressed genes in spleens of chickens that had been treated with the synthetic immune modifier S-28463. One induced chicken gene encoded a protein with about 35% sequence identity to human interleukin-6 (IL-6). It consists of 241 amino acids including a putative N-terminal signal peptide of 47 residues. Bacterially expressed chicken IL-6 (ChIL-6) carrying a histidine tag in place of the signal peptide was biologically active: it induced proliferation of the IL-6-dependent murine hybridoma cell line 7TD1. The concentration of ChIL-6 required for half-maximal proliferative response was approximately 60 pg.mL-1. When injected intravenously into adult chickens, purified recombinant ChIL-6 induced an increase in serum corticosterone levels. Supernatants of chicken LMH and monkey COS-7 cells transiently transfected with a ChIL-6 expression construct induced proliferation of 7TD1 cells, demonstrating that recombinant ChIL-6 from eukaryotic cells is also active.     

传染性法氏囊病病毒 VP2/4/3-ChIL-2融合基因DNA疫苗免疫原性研究

应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlapping extension,SOE),经3次PCR将传染性法氏囊病病毒(infectiousbursal disease virus,IBDV)多聚蛋白(VP2/4/3)基因和鸡白细胞介素2(Chicken IL-2,ChIL-2)基因进行融合,定向插入真核表达载体pCI的CMV启动子下游,获得重组质粒pCI-VP2/4/3-IL-2和pCI-IL-2-VP2/4/3。将其制备成DNA疫苗,肌肉注射14日龄非免疫鸡,2周后加强免疫,定期测定鸡抗IBDV血清ELISA抗体效价及病毒中和抗体效价。加强免疫后3周用IBDV标准强毒株攻击,连续观察3天后全部扑杀,计算保护率及囊体比,并进行组织病理学检查。结果表明:1)融合基因重组质粒pCI-VP2/4/3-IL-2、pCI-IL-2-VP2/4/3免疫后能明显增强IBDVDNA疫苗对强毒的攻击保护(保护率分别为83.3%、91.6%),显著高于pCI-VP2/4/3单独免疫对照组(58.3%);2)诱导产生的抗IBDV血清ELISA抗体效价明显增高(P<0.05),同时能提高DNA疫苗诱导产生的中和抗体效价(P<0.05);3)能显著促进鸡外周血液T淋巴细胞增殖反应。上述结果提示:IBDV VP2/4/3与ChIL-2基因融合后发挥了相互协同作用,ChIL-2产生了分子免疫佐剂效应;融合基因DNA疫苗能增强IBDV DNA疫苗的免疫原性,促进了机体特异性免疫应答。     

鸡髓样分化因子88的原核表达及单克隆抗体制备

目的:克隆、表达、纯化鸡髓样分化因子88(MyD88),制备其单克隆抗体。方法:从脾脏cDNA中扩增857bp的MyD88基因片段,插入pMAL-c5X表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得表达菌株,IPTG诱导表达,用SDS-PAGE分析MBP(麦芽糖结合蛋白)-MyD88重组融合蛋白的表达,切胶纯化目的蛋白;免疫BALB/c小鼠,制备针对MyD88的单克隆抗体,Western印迹检测抗体特异性,制备腹水并进行抗体亚型鉴定和效价测定。结果:构建了鸡MyD88原核表达载体pMAL-MyD88,并在大肠杆菌中获得高表达,目的蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在;建立了3株抗鸡MyD88单克隆抗体细胞株,制备了腹水,亚型分别为IgG1、IgG1和IgG2a,轻链均为κ,腹水抗体的效价均为1∶2×105。结论:在原核表达系统中表达、纯化了重组鸡MyD88,制备了针对鸡MyD88的单克隆抗体,为后续的MyD88定量和功能研究奠定了基础。     

以杆状病毒为载体在鸡原代骨骼肌细胞中表达IBDV VP2基因

摘要：【目的】本研究旨在构建在鸡原代骨骼肌细胞中表达IBDV病毒VP2基因的重组杆状病毒。【方法】从IBDV适应细胞毒中提取RNA,用RT-PCR技术扩增VP2基因,将其克隆到自主构建的杆状病毒转移载体的CMV启动子之下,通过Bac-to-Bac系统获得VP2重组Bacmid,并将其转染Sf9昆虫 细胞,获得了VP2重组杆状病毒。重组病毒经扩增后以50个MOI感染鸡原代骨骼肌细胞,接种72h后裂解细胞收获蛋白。【结果】蛋白样品经SDS-PAGE和Western blot证实VP2蛋白获得表达,分子量约48kDa,与预测蛋白大小一致,且能被IBDV阳性血清所识别。【结论】重组杆状病毒可以有效地将VP2基因导入鸡原代细胞,并在CMV的启动下表达具有抗原性的VP2蛋白,本研究为研制IBDV及其他重要禽类传染病的杆状病毒载体疫苗奠定了基础。     

cDNA cloning and functional analysis of goose interleukin-2

cDNA encoding goose IL-2 (GoIL-2) was cloned from Con A-stimulated goose splenic mononuclear cells (SMC) using oligonucleotide primers based on the conserved sequence of duck (DuIL-2), chicken (ChIL-2) and turkey IL-2s (TuIL-2). The GoIL-2 cDNA is 718nt long, which contains an open reading frame (ORF) of 423 base pairs encoding a protein of 141 aa. The GoIL-2 shows, respectively, 79%, 82-85%, and 91-92% identities with TuIL-2, ChIL-2 and DuIL-2 in cDNA, and also shows, respectively, 63%, 63-64%, and 82-85% identities with TuIL-2, ChIL-2 and DuIL-2 in amino acid sequence. Recombinant GoIL-2 (rGoIL-2) protein expressed in Escherichia coli has an approximate molecular weight of 18kDa. The rGoIL-2 has biological effect on goose and duck as well as chicken lymphocytes in a dose-dependent manner, though the effect on duck and chicken lymphocytes has been found to be relatively weak. In addition, rGoIL-2 also strengthens goose immune responses induced by vaccinating the inactivated oil emulsion vaccine against avian influenza virus. The monoclonal antibodies (mAb) to rGoIL-2 recognized the binding epitopes of nature GoIL-2 protein expressed in vero cells. Antiserum and mAb 5B10 to rGoIL-2 can inhibit the biological activity of rGoIL-2 and endogenous GoIL-2. The results, at the first time, indicated that goose IL-2 reserves species-specialties in the biological functions and can be used as a potential immunoadjuvant for goose vaccination and immunotherapeutic purposes. Finally, the mAbs to rGoIL-2 also provide a useful tool for further immunobiological studies of IL-2 in avian immune systems.     

共表达新城疫病毒F基因和H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒

应用RT PCR扩增出新城疫病毒F4 8E8株融合蛋白 (F)基因 ,将其克隆入pGEM Teasyvector构建重组质粒pGEM TF并进行测序确证。分别从pGEM T和pUCHA切下F基因和H9亚型禽流感病毒F株 (A chicken china F 1 998)血凝素 (HA)基因 ,通过一系列分子生物学操作步骤插入到质粒pFPV7S中的鸡痘病毒基因组复制非必需片段构建重组质粒p7SHF ,其中F基因和HA基因分别由鸡痘病毒启动子PE L和合成启动子PS调控。最后将P1 1 LacZ报告基因表达盒插入质粒p7SHF获得转移载体pFPVHF ,用以转染已预先感染鸡痘病毒 2 82E4疫苗株的鸡胚成纤维细胞 (CEF)。通过在含有X Gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化重组病毒。PCR和Southernblot检测证实了F基因和HA基因已插入鸡痘病毒的基因组 ;间接免疫荧光试验结果表明重组病毒能够同时正确表达HA和F蛋白。