根瘤菌基因组结构的多样性及其与系统发育的关系*

研究探讨依据基因组结构对根瘤菌进行系统发育分类的可行性。采用I-CeuI酶切及脉冲场电泳分析确定25株根瘤菌模式菌株的基因组结构,据此对根瘤菌进行聚群,并与16S rRNA聚群结果相比较。依据基因组结构的近似或不同,25株根瘤菌共分为11个基因组型(genome type,GT)。这些基因组型与依据16S rRNA序列的聚群结果大体一致,其不同之处显示了两种方法各自的特点。因此,基因组的物理结构,即本研究中rm纵子的数量及其在基因组上的位置,可作为系统发育关系的标志而用于根瘤菌的分类。     

内蒙古根瘤菌的数值分类

对63株新分离的内蒙古根瘤菌与6株来自Rhizobiumleguminosarum及Sinorhizobiummililoti的参比菌株一起进行了数值分类。结果表明：所有测试菌株在67％的相似性水平上分为三个表观群,群Ⅰ包括3株Sinorhizobiummeliloti的参比菌和9株新分离的内蒙古根瘤菌;群Ⅱ包括3株RhizobiumLoguminosarum参比菌和37株新分离的内蒙古根瘤菌;群Ⅲ全部由20株新分离的内蒙古根瘤菌组成。在78％的相似     

两个根瘤菌新群的系统发育学分析

在数值分类、ＳＤＳＰＡＧＥ 全细胞蛋白分析、ＤＮＡＤＮＡ 杂交、１６ＳｒＤＮＡＰＣＲＲＦＬＰ 的基础上,测定了两个分离自干旱地区苜蓿、草木樨根瘤菌新群１ 、２ 的中心株ＸＪ９６０６０ 、ＸＪ９６４０８ 的１６ＳｒＤＮＡ 全序列,并进一步将中心株和３１ 株已知菌、３ 株分自黄土高原的根瘤菌进行了系统发育学分析。结果表明,供试菌株在系统发育树中基本分成Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ 、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ 、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＲｈｉｚｏｂｉｕｍ 、Ｒｈｉｚｏｂｉｕ ｍ 、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ 、Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ 六个分枝。群１ ,２ 落入Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕ ｍ 分枝。     

花生根瘤菌的数值分类*

从我国 １１个省、 １６种土壤类型、 ２０多个花生（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ Ｌ．）品种上分离到的花生根瘤菌［Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．（Ａｒａｃｈｉｓ）］中选取５０个代表菌株、并与从津巴布韦引进的４株花生根瘤菌及７株慢生根瘤菌常用的参比菌株共６１株菌进行了１２８项表型特征的测定。数值分类的结果表明,全部菌株在７５％水平上相聚,并在７６％和７７％的水平上分别聚成两大群（群Ⅰ、群Ⅱ）,每大群以较高的相似性（８５％- ９４％）各聚成６个亚群。所用数值     

根瘤菌数值分类

对56株根瘤菌及3株土壤杆菌进行了200个形态、生理、生化及生物学性状测定,根据Ssm相似性系数及最短距离聚类公式,用电子计算机进行数值分类。试验结果,将快生型根瘤菌、慢生型根瘤穗和土壤杆菌在届的水平上分开,豌豆根瘤菌、三叶草根瘤菌和菜豆根瘤菌三者的相似性很高,合并为一个种。以上结果与《伯杰系统细菌学手册》第一卷中Jordan的根瘤菌科分类系统相一致。此外,紫云英根瘤菌自成一群,包括在根瘤菌属(Rhizobium)中。柱花草根瘤菌独立成群,包括在慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)中。     

海南快生根瘤菌I66的部分16S rRNA序列测定

与豆科植物共生固氮的根瘤菌目前有4个属、10个种.包括Rhizobium(6个种),Sinorhizobium(2个种),Azorhizobium(1个种)和Bradyrhizobium(1个种).其中多数是近年来采用现代分类技术分析后建立的,而且新的类群还在不断被发现.在以前的根瘤菌数值分类及DNA-DNA杂交研究中,我们确定了海南慢生型根瘤菌属于大豆慢生根瘤菌种(B.japonicum).而海南快生型根瘤菌的分类地位则较为分散.其中一些菌株属于已知各根瘤菌种,另有4株银合欢根瘤菌和13株来自不同寄主的菌株分别构成具有独立的分类地位的两个菌群(第2群和第4群)(待发表).为了进一步明确它们的分类地位,我们依据国际系统细菌学委员会根瘤菌分委员会的建议,利用Young等建立的聚合酶链反应(PCR)及测序技术,对第4群的代表菌株166的部分16SrRNA基因片段进行了扩增和测序.     

花生根瘤菌在根瘤菌系统分类中的地位研究

用12株分类地位已知的代表菌为对照,采用现代细菌分类学方法,对从四川省4个花生产区的天府3号和地方品种上分离的花生根瘤菌,从系统发育方面,探索了花生根瘤菌在根瘤菌系统中的分类地位。多聚酶链反应(PCR)扩增的16S rRNA的4种限制性内切酶长度多态(PCR-RFLP)以及16S rRNA部分碱基序列测定结果同时表明:四川花生根瘤菌与慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)相似性极高。由此推论它们在系统发育及进化方向上是基本一致的。该结果为研究花生根瘤菌的确切分类地位打下了基础。     

根瘤菌新类群代表菌株的16S rDNA全序列测定及其系统发育地位

用双脱氧法测定了一个根瘤菌新类群代表菌株SH2672的16S rDNA全序列,将此全序列与根瘤菌各已知种及相关种的16S rDNA全序列进行了比较及聚类分析,得到系统发育树状图。在系统发育树状图中,菌株SH2672与百脉根中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti),华癸中慢生根瘤菌(M. huakuii)、天山中慢生根瘤菌(M. tianshanense)、地中海中慢生根瘤菌(M. mediterraneum)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(M. ciceri)共同构成一个分支,与各已知种的模式菌株16S rDNA相似性分别为:96.3％,96.4％,97.2％,95.1％,95.6％,均在95％以上,它们应归属于同一属。且分支内各种间DNA同源性低于70％,表明它们分别为不同的种,菌株SH2672代表着一个新的根瘤菌种。     

陕西太白尾矿废弃地豆科植物根瘤菌16S rDNA PCR-RFLP及全序列分析

应用16S rDNA-RFLP和16S rDNA全序列测定方法,对分离自陕西太白金矿尾矿废弃地的55株根瘤菌和12株参比菌株进行了遗传多样性和系统发育地位研究。采用平均连锁法(UPMGA)对16S rDNA PCR-RFLP聚类,结果显示所有菌株在72%的水平上聚到一起。根据参比菌株的种属关系,将供试菌株初步分成6个遗传发育群。群Ⅰ为根瘤菌属,群Ⅱ为中华根瘤菌属,群Ⅲ是中慢生根瘤菌属,群Ⅳ为土壤杆菌属,群V为一未知群,群Ⅵ为慢生根瘤菌属。分离自天蓝苜蓿的根瘤菌主要分布在群Ⅱ,截叶胡枝子根瘤菌在各个群内均有分布,表现出丰富的遗传多样性。选取群Ⅰ、Ⅱ的代表菌株TB17-1、TB50-1进行16S rDNA全序列测定分析,结果显示TB17-1与Rhizonbium leguminosarumUSDA2370的同源性高达99.7%,TB50-1与Sinorhizobium melilotiLMG6133的同源性为100%。全序列测定结果与RFLP分析结果基本一致。     

用rep-PCR技术研究中国花生根瘤菌的多样性

采用细菌基因组重复序列ＰＣＲ技术（简称ｒｅｐＰＣＲ）中常用的ＲＥＰＰＣＲ和ＥＲＩＣＰＣＲ,对从中国１１个省、市的２３个点、２４个花生品种采集的根瘤中分离的５９株花生根瘤菌Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｐ．（Ａｒａｃｈｉｓ）进行多样性研究,同时对来自国外的６株花生根瘤菌及１４株参比慢生根瘤菌也进行了比较。得到的低相似性结果表明中国花生根瘤菌基因组存在显著的多样性。ＲＥＰＰＣＲ揭示,在相似性５０％上分为１１个群,而ＥＲＩＣＰＣＲ却得到２４个分群。这两种结果对菌株的分群有差异,暗示这两种短重复序列在慢生根瘤菌基因组中的分布的不同。没有发现菌株间基因组的多样性分布与花生品种、地理来源之间的必然联系。将两者电泳图谱结合并分析,得到介于上述两者间的结果。此结果进一步反映了菌株基因组间存在的多样性。同时还表明ｒｅｐＰＣＲ不仅是研究生物多样性的快速简便方法,还可应用于菌株的鉴别和生态学研究。     

川中丘陵地区大豆根瘤菌遗传多样性与系统发育关系

【目的】研究分离自川中丘陵地区大豆根瘤菌的遗传多样性和系统发育。【方法】采用16S rDNA PCR-RFLP和16S rRNA基因、glnII、共生基因(nodC)系统发育分析的方法进行研究。【结果】供试未知菌的16S rDNA用4种限制性内切酶(HaeⅢ、HinfⅠ、MspⅠ及TaqⅠ)酶切后获得5种16S遗传图谱类型。16S rDNA PCR-RFLP结果表明,所有供试菌株在83%水平分为慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)和中华根瘤菌属(Sinonrhizobium)两大类群,而75%的菌株为中华根瘤菌。6个代表菌株的16S rDNA、glnII和nodC三个位点基因的系统发育结果基本一致,4株与S.fredii USDA205T相似度最高;有2株分别与B.yuanmingense CCBAU10071T、B.diazoefficiens USDA110T相似度最高。4个Sinonrhizobium代表菌株16S rDNA、glnII序列相似度分别为98.3%-99.9%、98.2%-100%,但它们的nodC基因序列完全相同。【结论】川中丘陵地区大豆根瘤菌具有较丰富的遗传多样性,S.fredii为优势种。     

兰坪铅锌尾矿区豆科根瘤菌遗传多样性ARDRA分析

通过16S rDNA扩增产物限制性片段长度多态性分析(ARDRA),对兰坪铅锌尾矿区豆科植物根瘤菌的遗传多样性进行了研究。采用限制性内切酶Hae Ⅲ、Hind Ⅲ、Hinf Ⅰ和Taq Ⅰ对16S rDNA扩增产物进行了酶切分型,根据ARDRA酶切图谱的不同,进行树状聚类。结果表明:49株根瘤菌在40%的相似水平上按氮含量不同及铅锌含量的采集地不同分别聚为OTU1、OTU2和OTU33个群,说明根瘤菌的遗传多样性及分布与土壤中的氮含量和铅锌含量有关。代表菌株的16S rDNA测序结果分析表明,它们在系统发育树上属于Rhizobium sp.、Sinorhizobium sp.和Bradyrhizobium sp.3个系统发育分支,进一步说明兰坪铅锌尾矿区豆科植物根瘤菌多样性较丰富。     

海南省根瘤菌资源考察及分类

对海南省各地区的豆科植物进行了根瘤菌共生情况调查和根瘤样品采集。经分离、纯化和回接试验后,选取了其中38株菌与Rhizobium、Bradyrhizobium、Sinoorhizobium和Agra-btcterium四属的18株参比菌进行了193个生理生化性状分析,使用简单匹配系数(ssm)和平均连锁法(UPGMA)进行了聚类分析,同时对部分菌株做了DNA—DNA杂交分析及交叉结瘤试验。结果表明,海南省根瘤菌被分为快慢两群,自同一寄主植物属既分离出快生根瘤菌又分离出慢生根瘤菌。海南省慢生根瘤菌全属于Bradyrhizobium群,该群在88％相似性水平分为三个亚群,相当于亚种水平。慢生菌在亚群中的分布与原寄主无相关性,即同一寄主的菌分布在不同亚群中。海南快生菌却独立成群,在碳氮源利用、抗生素抗性及其它生理生化特性上与海南慢生菌群和快生参比菌群均显著不同,值得进一步研究,以确定其分类地位。     

黄芪根瘤菌的分类研究

采用数值分类方法研究了分离自不同地区的黄氏属根瘤菌36株,发现在80％的相似性水平上,8株菌形成了亚群8,7株菌形成了亚群9。DNA同源性测定结果表明,这两个亚群是不同于已知根瘤菌种的新的DNA同源群。其中心菌株CA8561和JL84的部分16S rRNA基因序列分析发现,CA8561菌株与所有已知根瘤菌远缘,形成了一个独立的系统发育分支。JL84菌株在快生型根瘤菌属(Rhizobium)和土壤杆菌属(Agrobacterium)形成的系统发育分支中占据了一个独立的系统发育地位。     

天山根瘤菌（Rhizobium tianshanense）全细胞蛋白电泳和多位点酶电泳分析

用全细胞可溶性蛋白电泳和多位点酸电泳对１５株天山根瘤菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｔｉａｎｓｈａｎｅｎｓｅ）和其它１０株快慢生根瘤菌进行聚类分析,结果表明Ｒ．Ｔｉａｎｓｈａｎｅｎｓｅ种内菌株关系密切而与其它种不同。分析时将全细胞蛋白电泳图谱分为２５４等份,根据每等份内条带的有无进行聚类,结果与数值分类基本一致,说明用该方法对全细胞蛋白电泳结果进行聚类可以作为根瘤菌的分群手段;用所有出现的１０９种迁移率对１７种多位点酶的电泳结果作聚类分析,得到与全细胞蛋白电泳相似的结果。     

志贺氏菌属鲍氏(S. boydii)亚群基因组组成与进化分析

利用比较基因组杂交法(comparative genomic hybridization, CGH)对志贺氏菌属鲍氏(S. boydii)亚群共18个血清型代表菌株的基因组结构组成进行比较分析, 结果显示, 该亚群基因组的“共有骨架”包含2552个与非致病性大肠杆菌K12同源的ORFs. 比对K12基因组, 该亚群所有菌株基因组共同缺失ORFs为199个, 主要涉及外膜蛋白编码基因和O-抗原合成相关基因, 而属于亚群特异性的ORFs主要以噬菌体基因和未知功能ORFs为主, 一些参与铁离子代 谢、运输和Ⅱ型分泌系统基因在大多数的鲍氏菌株中存在. 以比较基因组杂交法得到的进化分析显示: 鲍氏亚群18个血清型代表菌株可分为4组, 其中13型与其他菌株有较大的差异. 这种分组结果与某些代谢相关的基因分布情况存在对应关系. 通过对该亚群“共有骨架”、缺失基因和株特异基因, 以及进化分类等方面的分析, 以期探索该亚群基因组的进化规律, 并为志贺氏菌属鲍氏亚群的致病机理、疫苗研制和药物开发等方面的研究提供重要线索.     

根瘤菌系统发育分类方法研究进展*

根瘤菌系统发育地位的判断在根瘤菌新属种的确认中起重要作用。其中,16S rRNA序列分析是关键技术。然而,新近的研究对采用16S rRNA全序列推测的系统发育关系的准确性提出质疑。本实验室的工作表明基因组物理结构分析将能更客观反映其系统发育关系。基因组序列分析在帮助澄清某些根瘤菌属种的系统发育地位中也起重要作用。     

几株细菌的重金属抗性水平和吸附量*

从堆积时间为80~100 a的铅锌矿渣中分离了6株细菌,通过测定部分16S rRNA基因序列确定了它们的系统发育地位。结果表明有3株细菌属于节杆菌属(Arthrobacter),同A.nicotinovorans和A.histidinolovorans两个种关系密切。另外3株属于壤霉菌属(Agromy-ces),同Ag.m ediolanus具有较近的亲缘关系。总体来看,这些菌株都对检测的5种重金属有高的最低抑菌浓度(minimal inhibitory conc     

金合欢根瘤菌的几种酶活特性

金合欢根瘤菌Rhizobium sp.(Acacia farnesiana)的氧化酶、过氧化氢酶、脲酶、青霉素酶和β-半乳糖苷酶均呈阳性。经过酶活性定量测定表明金合欢根瘤菌有葡萄糖酸-6-磷酸脱氢酶(6PGD)和β-半乳糖苷酶的酶活性,而慢生型大豆根瘤菌未测到上述两种酶活性。根据聚丙烯酰胺凝胶电泳酯酶图谱,6株金合欢根瘤菌可分成两群:酋株AF1、AF2和AF3的酯酶图谱中有A带,AF4、AF5和AF6的酯酶图谱中没有A带。     

分离自补骨脂等宿主根瘤的24株菌的数值分类和16S rDNA PCR-RFLP 研究

采用数值分类和16S rDNA PCR-RFLP对分离自云南省豆科植物补骨脂(Psoralea corylifolia)、葛藤(Pueraria lobata)、杭子梢(Campylotropis macrocarpa)等宿主的24株菌及10株根瘤菌参比菌株进行了研究.数值分类结果表明,在84%相似性水平上,所有的菌株可分为3群:群Ⅲ为未知菌群,群Ⅰ为慢生菌群,群Ⅱ为快生和中慢生菌群.从依据16S rDNA PCR-RFLP分析建立的树状图来看,在70%相似性水平上,所有的菌株可分为5个系统发育分支:分支Ⅰ和Ⅴ没有参比菌株,为未知分支;分支Ⅱ为Agrobacterium-Sinorhizobium-Rhizobium,分支Ⅲ为Mesorhizobium,分支Ⅳ为Bradyrhizobium.数值分类和16S rDNA PCR-RFLP的结果部分一致,有2株茵与A.tumefaciens IAM13129T聚在一起.