TRAF6-GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:在大肠杆菌中表达肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)与GST的融合蛋白并进行纯化。方法:采用PCR方法从肝文库中扩增编码TRAF6的DNA片段,将其插入原核表达载体pGEX-4T-2,构建GST-TRAF6原核表达载体,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达;用谷胱甘肽-琼脂糖珠亲和纯化表达的GST-TRAF6融合蛋白。结果:酶切鉴定和测序分析显示,长为1569 bp的TRAF6 DNA片段在pGEX-4T-2-TRAF6中的碱基序列、插入位点及读框正确,且位于表达载体的GST序列下游;经IPTG最佳浓度0.5 mmol/L诱导表达、亲和纯化后,获得了相对分子质量约85×103的GST-TRAF6融合蛋白。结论:构建了重组GST-TRAF6原核表达载体,获得了GST-TRAF6的大肠杆菌BL21表达菌株及GST-TRAF6融合蛋白,利于深入研究TRAF6的功能。     

背角无齿蚌σ-GST基因克隆与五氯酚胁迫表达分析

谷胱甘肽S-转移酶(GST)在机体抗击氧化应激中发挥重要作用。我们前期研究表明,五氯苯酚(PCP)处理对背角无齿蚌(Anodonta woodiana)具有显著的氧化应激和急性毒性效应。为了探讨PCP慢性胁迫效应,本研究将背角无齿蚌随机分为对照组和PCP处理组,PCP处理组和对照组分别用13.9 mg/L和相同体积二甲亚砜处理;同时,克隆出σ型谷胱甘肽S-转移酶并命名为σ-GST,分析PCP对σ-GST表达的影响。σ-GST全长cDNA包括132 bp的5'端非编码区,80 bp的3'端非编码区,609bp的开放阅读框(ORF)。开放阅读由203个氨基酸组成的多肽链。σ-GST具有GST的标签序列和保守氨基酸,与其他物种σ类GST序列具有高度同源性。σ-GST广泛表达于斧足、外套膜、闭壳肌、心脏、肝胰腺、血淋巴和鳃。PCP处理后,肝胰腺、鳃和血淋巴中σ-GST表达水平显著增加。与对照组相比,PCP处理后肝胰腺σ-GST mRNA水平第1、3和第15天分别增加了28.73%、70.37%(P0.05)和6.64倍(P0.01)。与对照组相比,PCP处理后鳃中σ-GST mRNA水平在整个实验过程中增加了1.14倍。结果表明,背角无齿蚌ρ-GST表达水平上调有助于对抗PCP处理所产生的胁迫效应,提高动物环境耐受能力。     

斜纹夜蛾核多角体病毒VP39-GST融合蛋白的原核表达

用PCR的方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒（Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV）vp39全长基因。将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1上,构建重组表达质粒pGEX-4T-vp39,转化大肠杆菌BL21（DE3）,在1 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下超量表达了与理论预测值相符的一个约60 kD的VP39-GST融合蛋白。VP39-GST融合蛋白的成功表达为进一步研究VP39在病毒侵染过程中与宿主细胞成分或病毒粒子蛋白间的相互作用奠定了基础。