肺炎克雷伯菌研究进展

近年来由于各种抗菌药物的广泛使用,导致肺炎克雷伯菌多重耐药现象普遍存在,给临床治疗带来极大的困扰,造成医院获得性肺炎感染严重的现状。着重论述了肺炎克雷伯菌流行现状、耐药机制、致病因子及防治措施。     

高毒力肺炎克雷伯菌的分子致病机制

肺炎克雷伯菌是一种常见致病菌,根据毒力和致病特点不同,可分为毒力相对较弱的经典肺炎克雷伯菌和高毒力肺炎克雷伯菌。目前,关于肺炎克雷伯菌分子致病机制研究较多且较清楚的主要有荚膜、脂多糖、黏附素和铁载体。这四大类毒力因子在经典肺炎克雷伯菌中也存在,但在高毒力肺炎克雷伯菌中存在的频率更高,并引发不同的免疫应答,从而使高毒力肺炎克雷伯菌具有特征性表型。本文就此进行详细介绍和讨论。     

非产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯杆菌的耐药性分析

目的了解临床分离肺炎克雷伯杆菌中非产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）菌株对18种常见抗菌药物的耐药性。方法CLSI表型确证试验-纸片增强法检测非产ESBLs肺炎克雷伯菌,K-B法测定非产ESBLs肺炎克雷伯杆菌对18种常见抗菌药物的敏感性。结果非产ESBLs肺炎克雷伯杆菌株对头孢唑啉、头孢呋辛的耐药率〉50．0％,对其余抗生素的耐药率均低于25．0％,对亚胺培南、美罗培南非常敏感,耐药率分别为2．3％和2．0％;痰标本的分离株对头孢唑啉、头孢呋辛的耐药率明显高于血、尿液标本分离株,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论非产ESBLs肺炎克雷伯杆菌对第一、二代头孢菌素耐药显著,对第三代头孢菌素、亚胺培南、美罗培南等抗生素比较敏感。     

耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药机制研究

目的了解碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌及耐药机制。方法对2012-2013年临床分离的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌共计12株进行分析,药敏采用MIC方法检测,用WHONET 5.6软件进行分析,KPC表型检测采用改良Hodge试验,基因检测采用PCR方法。结果 12株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌改良Hodge试验阴性,基因测序为KPC-2型。结论 KPC-2基因是引起本院肺炎克雷伯菌耐药的主要原因。     

肺炎克雷伯菌血流感染的临床回顾性分析

目的 探讨肺炎克雷伯菌血流感染的临床特点、治疗方案和预后。方法 对诸暨市人民医院2014年3月-2015年9月诊断为肺炎克雷伯菌血流感染的住院患者临床资料进行回顾性分析。结果 66例肺炎克雷伯菌血流感染患者平均年龄64.6岁,检出前平均住院5.7 d。13例（19.7%）合并有其他细菌感染,49例（74.2%）合并其他系统感染。肺炎克雷伯菌血流感染多见于糖尿病（33.3%）、实体肿瘤（30.3%）等免疫力低下疾病,最常见于肝胆外科（24.2%）、内分泌科（16.7%）等科室。患者预后好转47例（71.2%）,APACHEⅡ评分为13.78±4.33;死亡19例（28.8%）,APACHEⅡ评分为21.10±7.45,两组评分差异有统计学意义（P<0.05）。合并其他感染状况与合并神经系统疾病状况病死率更高（P<0.05）。结论 肺炎克雷伯菌血流感染多见于糖尿病、实体肿瘤等免疫力低下的危重疾病患者,多发生在医院内环境的外科手术操作的科室,容易合并其他系统感染。APACHEⅡ评分可作为判断肺炎克雷伯菌血流感染预后的重要指标。控制其他感染情况可有助于临床防控肺炎克雷伯菌血流感染,改善其预后。     

碳青霉烯酶在碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯杆菌的分布及分子流行病学

目的了解碳青霉烯酶在碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯杆菌的分布及其分子流行病学。方法收集我院2010年1月至2012年12月分离的碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯杆菌120株,采用改良Hodge试验及EDTA协同试验进行碳青霉烯酶表型的确认,用PCR方法扩增碳青霉烯酶基因(KPC、IMP、NDM、VIM、OXA-48),经电泳检测扩增产物后纯化测序。通过MLST及ERIC-PCR进行分子流行病学分析。结果120株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯杆菌中,95株CRKP菌株改良Hodge试验阳性,64株菌株EDTA协同试验阳性。经PCR及测序确认,83株主要携带KPC-2型碳青霉烯酶,占69.2%;其次为IMP-4型金属酶,占28.3%(34/120),NDM-1型金属酶15株,占12.5%,未发现VIM和OXA-48碳青霉烯酶。ERICPCR及MLST分型显示出20个基因分型,其中ST395-A型和ST11-B型主要流行于产KPC-2型菌株中,占43.88%;ST263-B型和ST15-C型主要流行于产NDM-1菌株中,占13.27%;而ST11-B型主要分布于产IMP-4和KPC-2菌株中,占24.49%。结论我院碳青霉烯酶耐药肺炎克雷伯杆菌存在多种碳青霉烯酶,主要以KPC-2为主,产不同种类碳青霉烯酶菌株存在不同的流行基因型。     

致肝脓肿高毒力肺炎克雷伯菌的表型及分子特征

目的 探究导致肝脓肿高毒力肺炎克雷伯菌的分子特征。方法 用VITEK-2细菌鉴定仪鉴定2014年1月至2016年1月丽水市中心医院肝脓肿患者脓肿穿刺液中分离的细菌。应用拉丝试验鉴定菌株的高粘性,用多位点序列分型（MLST）和血清型分型（K分型）对菌株进行分子分型,并用S1核酸酶脉冲场凝胶电泳（S1-PFGE）对菌株质粒谱进行分析。结果 57例肝脓肿患者接受肝脏脓肿穿刺引流并做脓液培养。44例患者的脓液培养到不同的致病菌,培养阳性率为77.2%。在培养到的44株病原菌中,其中2株为大肠埃希菌,产酸克雷伯菌、金黄色葡萄球菌各1株,而肺炎克雷伯菌为40株,占肝脓肿致病菌的90.9%。40株肺炎克雷伯菌中,拉丝阳性率为67.5%（27/40）,K1为主要血清分型,占62.5%（25/40）,其次为K2型,占17.5%（7/40)。ST23为主要ST分型,占47.5%（19/40）,其次为ST86和ST65,各占7.5%（3/40）。同时发现一些未报道过的致肝脓肿肺炎克雷伯菌新ST分型,如ST218、ST1941、ST76、ST2159、ST660和ST485。40株致肝脓肿肺炎克雷伯菌中总共检测到12种质粒谱,包括带有一个质粒、多个质粒或不带质粒的谱型。其中带有一个近220 kb的质粒谱为主要谱型,共涉及19株菌,占47.5%,12株菌带有一个质粒,大小为140~250 kb。4株菌带有2个或3个质粒,5株菌不含有质粒。结论 拉丝试验和血清学分型不能鉴定所有的高毒力肺炎克雷伯菌;高毒力肺炎克雷伯菌很多为ST23型,但其进化整体上较为分散;高毒力肺炎克雷伯菌菌株可以不携带质粒。     

Structural Analysis of an Extracellular Polysaccharide Bioflocculant of Klebsiella pneumoniae

The glycoside composition and sequence of an extracellular polysaccharide flocculant of Klebsiella pneumoniae H12 was analyzed. GC and HPLC analysis of the acid-hydrolysate identified its constituent monosaccharides as D-Glc, D-Man, D-Gal, and D-GlcA in an approximate molar ratio of 3.9:1.0:2.3:3.6. To analyze the glycoside sequence, the polysaccharide was partially hydrolyzed by acid and enzyme treatment. GC, HPLC, TLC, MALDI-TOF/MS, and 1H- and 13C- NMR spectroscopy characterized the obtained oligosaccharides.

The results clarified the partial structure of H12 polysaccharide as a linear polymer of a unit of pentasaccharide with a side chain of one D-GlcA to D-Glc moiety (see below). Although the existence of other sequences or other constituent glycosides could not be fully excluded, H12 polysaccharide must be a novel types as such a complicated unit for a polymer has not so far been reported. The partial structure of a H12 polysaccharide flocculant is also discussed in this report.

→4)- α-D-Glcp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-4,6-Pyr-β-D- 3 Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→ ↓

1 β-D-GlcpA     

聚羟基丁酸路径在克雷伯氏菌中的构建

以生物柴油的副产物甘油生产高附加值的1,3-丙二醇,现已成为提升生物柴油产业链经济性的重要途径,而中间代谢产物3-羟基丙醛积累造成细胞死亡,发酵异常终止是生物法生产1,3-丙二醇过程中的关键问题。不同于传统的降低3-羟基丙醛积累的思路,本文从增强克雷伯氏菌对3-羟基丙醛的抗逆性出发,改善克雷伯氏菌1,3-丙二醇的生产性能,首次将聚羟基丁酸路径引入克雷伯氏菌中,构建了新型基因工程菌,并对其1,3-丙二醇发酵性能及聚羟基丁酸代谢进行了初步的研究。经IPTG诱导,工程菌中检测到聚羟基丁酸,其含量随IPTG浓度增加而增大。优化的IPTG浓度为0.5 mmol/L。初始甘油50 g/L时,野生菌可正常发酵生产1,3-丙二醇,1,3-丙二醇浓度达到22.1 g/L,其质量得率为46.4%。当初始甘油达到70 g/L时,由于高浓度3-HPA积累,野生菌发酵终止,而工程菌可正常发酵生产1,3-丙二醇,PDO产量可达31.3 g/L,其质量得率为43.9%。同时检测到聚羟基丁酸积累。研究结果有助于加深对克雷伯氏菌1,3-丙二醇代谢机理的认识,为克雷伯氏菌的进一步优化提供了新的思路。     

A Dam methylation mutant of Klebsiella pneumoniae is partially attenuated

In Klebsiella pneumoniae, a chromosomal insertion mutation was constructed in the dam gene, which encodes DNA adenine methylase (Dam), resulting in a mutant unable to methylate specific nucleotides. In some bacteria, the Dam methylase has been shown to play an important role in virulence gene regulation as well as in methyl-directed mismatch repair and the regulation of replication initiation. Disruption of the normal Dam function by either eliminating or greatly increasing expression in several organisms has been shown to cause attenuation of virulence in murine models of infection. In K. pneumoniae, a mutation-eliminating Dam function is shown here to result in only partial attenuation following intranasal and intraperitoneal infection of Balb/C mice.     

克雷伯杆菌甘油脱氢酶基因的克隆表达与纯化

以克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)基因组DNA为模板, 运用PCR扩增得到编码甘油脱氢酶(GDH)的基因(gldA), 并克隆到pMD-18T载体上, 构建克隆载体pMD-gldA。经测序正确后, 将gldA亚克隆至表达载体pET-32a(+)上构建表达质粒pET-32gldA。在乳糖诱导下, 携带pET-32gldA的E. coli BL21 (DE3)高效表达分子量约为54 kD的可溶性蛋白。表达产物带有His6-tag标记, 选用Ni柱对表达产物进行纯化, 纯化后酶液的比活为188 u/mg, 纯化倍数和回收率分别为3倍和67.5%。     

克雷伯杆菌甘油脱氢酶基因的克隆表达与纯化

以克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)基因组DNA为模板, 运用PCR扩增得到编码甘油脱氢酶(GDH)的基因(gldA), 并克隆到pMD-18T载体上, 构建克隆载体pMD-gldA。经测序正确后, 将gldA亚克隆至表达载体pET-32a(+)上构建表达质粒pET-32gldA。在乳糖诱导下, 携带pET-32gldA的E. coli BL21 (DE3)高效表达分子量约为54 kD的可溶性蛋白。表达产物带有His6-tag标记, 选用Ni柱对表达产物进行纯化, 纯化后酶液的比活为188 u/mg, 纯化倍数和回收率分别为3倍和67.5%。     

肺炎克雷伯菌基因组可移动遗传元件的研究进展

肺炎克雷伯菌是目前临床上最主要的耐药致病菌之一,对人类健康造成了很大威胁.近年来,细菌耐药成为治疗肺炎克雷伯菌感染的主要难题,尤其是高毒力、高耐药性肺炎克雷伯菌的出现对临床工作造成了巨大挑战,而研究表明其耐药基因和毒力基因主要由可移动遗传元件携带而传播.因此,为了更好地认识及防控肺炎克雷伯菌感染,本文对肺炎克雷伯菌基因...     

肺炎克雷伯菌耐药性与I类整合子关系的研究

目的检测I类整合子在肺炎克雷伯菌临床分离株中的分布,分析整合子对细菌耐药性的影响。方法采用K—B纸片扩散法对127株肺炎克雷伯菌临床分离株进行药敏试验;并用WHONET5．6软件分析菌株药敏情况;采用聚合酶链反应（PCR）分析127株肺炎克雷伯菌株的I类整合子。并对I类整合子阳性株与阴性株的耐药性进行对比分析。结果127株菌中有53株（41．70％）含有I类整合子,I类整合子阳性菌株对氨基糖苷类、喹诺酮类及大多数B一内酰胺类的耐药率高于整合子阴性的菌株。结论I类整合子在肺炎克雷伯菌临床分离株存在较广,含有I类整合子的肺炎克雷伯菌更易获得耐药性。     

P1CMts lysogeny and P1 sensitivity on Klebsiella pneumoniae

Abstract The lipopolysaccharide (LPS) of Klebsiella pneumoniae was altered as a consequence of P1CM ts lysogeny by a reduction in size to a heptose-deficient form. P1CM ts lysogens were sensitive to P1 vir and K. pneumoniae phages. P1CM ts -cured strains were sensitive to P1CM ts and P1 vir and P1CM ts lysogens were likewise able to inactivate P1 vir . Concomitantly, the wild type showed a smooth LPS, while P1CM ts lysogens and P1CM ts -cured strains showed a rough LPS (heptose-deficient form).
It is suggested that P1CM ts and P1 vir , are only able to infect K. pneumoniae by selecting a LPS-deficient mutant (chemotype Re).     

肺炎克雷伯菌生物被膜的体外模型建立

目的研究临床分离的肺炎克雷伯菌在体外形成生物被膜的情况,为进一步研究生物被膜肺炎克雷伯菌的耐药机制奠定基础。方法采用改良平板法建立肺炎克雷伯菌生物被膜模型,用喷金法和扫描电镜观察鉴定,并对生物被膜的形成进行定量分析。结果23株临床分离的肺炎克雷伯菌菌株生物被膜形成能力不同,以强阳性生物被膜形成能力者为最多数。结论绝大多数临床分离的肺炎克雷伯菌菌株具有较强的生物被膜形成能力。应用改良平板法能够较好的在体外建立其生物被膜模型。     

A Klebsiella pneumoniae plasmid which codes for isocitrate dehydrogenase

Abstract A naturally occurring Klebsiella pneumoniae plasmid of 114 MDa was able to complement isocitrate dehydrogenase deficiencies in K. pneumoniae and Salmonella typhimurium . The plasmid encoded isocitrate dehydrogenase, which differed from that of S. typhimurium in the kinetic parameters for NADP and isocitrate, in its isoelectric point, and in its response to repression by cAMP. This is the first report of a naturally occurring plasmid encoding a Krebs cycle enzyme.     

多重耐药肺炎克雷伯菌肺部感染的抗感染治疗新策略

目的 尝试使用新的抗感染治疗策略治疗多重耐药肺炎克雷伯菌肺部感染。方法 选择10例转入ICU的院内获得性肺部感染患者,入选患者使用抗生素治疗效果不佳,多次痰培养结果提示多重耐药的肺炎克雷伯菌生长。患者先予以头孢美唑抗感染治疗,在48~72 h后痰培养结果均提示对亚胺培南等敏感的铜绿假单胞菌生长,然后根据患者肺部感染是否好转选择继续使用头孢美唑或调整为对铜绿假单胞菌有效的抗生素。结果 10例患者治疗7 d后C反应蛋白（CRP）、降钙素原（PCT）、临床肺部感染评分（CPIS）均显著下降（P＜0.05）,所有患者均顺利脱机拔管转出ICU。结论 根据肺部微生态特点,利用菌群之间存在的拮抗作用,可以使用抗生素来调节微生态失衡。对于合适的患者,这种新的抗感染策略可以有效治疗多重耐药肺炎克雷伯菌肺部感染,可作为临床抗感染策略之一。     

碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌基因型检测及同源性分析

目的了解福建医科大学附属第一医院耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（KPC）的耐药基因分型及同源性分布情况。方法收集临床分离的29株KPC,改良Hodge试验检测碳青霉烯酶表型。PCR检测碳青霉烯酶blaKPC、blaIMP-1、blaVIM-1、blaOXA-48及blaNDM-基因;阳性结果进行DNA测序,并进行BLAST比对确定其基因型。采用肠杆菌科基因间重复序列（ERIC—PCR）对KPC进行同源性分析。结果29株KPC中Hodge试验阳性27株,阳性率为93．1％（27／29）。PCR扩增和DNA测序显示28株为blaKPC-2,株为blaIMP-1,未检出blaVIM-2、blaOXA-48和blaNDM-1基因。同源性分析发现KPC主要存在两种型别：28株A1和1株A2。结论blaKPC-2型碳青霉烯酶是该院KPC的主要型别,A1型已在该院流行,应加强院感监测和预防。ERIC—PCR是一种简便、快捷的基因分型技术,适合同源性的初步分型筛查。