NDRG2 通过调控CD24 影响肝癌细胞侵袭能力的研究

目的：阐明NDRG2（N-Myc downstream-regulated gene 2）在肝癌细胞中对CD24 的调控及其对乳腺癌细胞侵袭能力的影响。 方法：Western blot 检测低转移性的肝癌细胞Huh7、高转移性的肝癌细胞系MHCC97h 及正常人肝细胞系L-02 中NDRG2 和 CD24 的表达;通过腺病毒载体上调MHCC97h 细胞中NDRG2 的水平,或利用siRNA 下调Huh7 细胞中NDRG2 的表达,检测 CD24 的变化以及细胞侵袭能力的改变。结果：MHCC97h 细胞中NDRG2 基因和蛋白的表达水平低于Huh7 细胞,而CD24 的表达 水平高于Huh7 细胞;在MHCC97h 细胞中上调NDRG2 可以抑制CD24 的表达并抑制其侵袭能力,而在Huh7 细胞中下调 NDRG2 的表达可以提高CD24 的水平及细胞的侵袭能力。结论：NDRG2 可能通过影响CD24 参与调控肝癌细胞的侵袭能力。     

NDRG2通过调控CD24影响肝癌细胞侵袭能力的研究

目的：阐明NDRG2（N-Myc downstream-regulated gene2）在肝癌细胞中对CD24的调控及其对乳腺癌细胞侵袭能力的影响。方法：Western blot检测低转移性的肝癌细胞Huh7、高转移性的肝癌细胞系MHCC97h及正常人肝细胞系L-02中NDRG2和CD24的表达;通过腺病毒载体上调MHCC97h细胞中NDRG2的水平,或利用siRNA下调Huh7细胞中NDRG2的表达,检测CD24的变化以及细胞侵袭能力的改变。结果：MHCC97h细胞中NDRG2基因和蛋白的表达水平低于Huh7细胞,而CD24的表达水平高于Huh7细胞;在MHCC97h细胞中上调NDRG2可以抑制CD24的表达并抑制其侵袭能力,而在Huh7细胞中下调NDRG2的表达可以提高CD24的水平及细胞的侵袭能力。结论：NDRG2可能通过影响CD24参与调控肝癌细胞的侵袭能力。     

NDRG2调控大鼠肝细胞周期的机制

目的:阐明NDRG2(N-Myc downstream-regulated gene2)在大鼠肝再生过程中时肝细胞周期的调控机制.方法:大鼠70%肝切除后收集0 h、8 h、24 h、48 h、72 h、7 d、10 d的再生肝组织,采用Real-time PCR和Western blot方法检测大鼠肝再生过程中NDRG2基因和蛋白的动态变化.流式细胞仪检测腺病毒介导的高表达NDRG2对大鼠正常肝细胞系(BRL)细胞周期的影响.Real.time PCR和Western blot方法检测高表达NDRG2对肝细胞周期调控的分子机制.结果:NDRG2基因和蛋白的表达水平在肝再生达到高峰时明显下降,在肝细胞进入分化期时显著上调;流式细胞仪检测显示BRL细胞中高表达NDRG2 48 h后,G0/G1期细胞百分比从对照组39.30+1.97上升至57.44±2.56,S期从37.66±1.73下降至13.27±2.01,差异有统计学意义(P＜0.05).对周期调控相关分子的检测显示高表达NDRG2对肝细胞周期的影响是通过上调p21,抑制Cyclin E实现的.结论:NDRG2通过影响细胞周期参与调控大鼠肝再生过程.     

抑制NDRG2基因表达对宫颈癌Hela细胞紫杉醇化疗敏感性的影响

目的:NDRG2是N-Myc downstream regulated gene家族的成员之一,与细胞增殖和分化相关.前期研究发现,抑制NDRG2表达可以提高宫颈癌Hela细胞对于顺铂的化疗敏感性,本研究采用RNA干扰技术抑制人宫颈癌Hela细胞中NDRG2基因的表达研究其对Hela细胞紫杉醇化疗敏感性的影响.方法:利用化学合成的针对NDRG2特异性siRNA瞬时转染Hela细胞株,采用RT-PCR和Western Blot检测NDRG2 mRNA和蛋白表达情况,通过MTT法检测其与对照细胞在顺铂作用下的体外存活率差异.SPSSll.0统计包处理,采用t检验,P＜0.05为差异有统计学意义.结果:在mRNA和蛋白水平,化学合成的NDRG2特异性siRNA oligomer可使Hela细胞的NDRG2表达水平明显降低.在0.1、1、10、100、500、1000 μg/mL紫杉醇浓度组,Negative-control和NDRG2siRNA细胞的相应细胞存活率分别为97.21±2.38、90.09±2.42、83.35±3.86、62.93±3.75、18.22±5.46、1.14± 0.67和99.62±3.15、94.91±3.83、85.71±2.93、58.59± 3.36、17.99±3.40、0.73±0.34,组间比较P值均大于0.05,差异无统计学意义.结论:抑制NDRG2表达不影响宫颈癌Hela细胞在紫杉醇作用下的细胞存活率,不能提高其对紫杉醇的化疗敏感性.进一步拓展了对该基因的功能认知.     

整合素β2促进人乳腺癌细胞MCF-7的迁移,侵袭与粘附

本研究主要目标为探讨整合素β2 (ITGB2)的高表达对人乳腺癌细胞MCF-7迁移,侵袭与粘附能力的影响。本研究首先构建了ITGB2过表达质粒,实验设阴性对照组(pcDNA-3.1+)与ITGB2基因过表达组(pcDNA-3.1+/ITGB2)。ITGB2过表达质粒转染MCF-7细胞后,采用逆转录PCR与Western blotting方法分别检测ITGB2 mRNA转录水平与蛋白翻译水平;流式细胞术检测细胞周期的改变;划痕实验检测细胞横向迁移能力;Transwell小室实验检测细胞纵向迁移能力及侵袭能力;人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)粘附实验检测癌症细胞与血管内皮细胞之间的粘附能力,Western blotting实验检测侵袭相关指标MMP9,整合素经典通路中FAK蛋白磷酸化水平的改变。研究结果表明:转染ITGB2过表达质粒后,MCF-7细胞中ITGB2的m RNA水平(p<0.01)与蛋白水平(p<0.05)均显著增高;流式细胞术实验中,实验组S期的细胞所占比例与对照组无明显差异;划痕实验与Transwell小室实验中,实验组的迁移侵袭能力显著性增强;人脐静脉血管内皮细胞粘附实验中,实验组乳腺癌细胞与血管内皮细胞的粘附能力强于对照组(p<0.05);且Western blotting结果显示MMP9和p-FAK蛋白水平明显上升。由以上结果可得出结论,过表达ITGB2后会增强人乳腺癌细胞MCF-7的迁移、侵袭与粘附能力,而对其增殖能力无明显影响。     

抑癌候选基因NDRG2 对结肠癌细胞SW620 的迁移和侵袭力的影响

目的:观察NDRG2对结肠癌SW620细胞侵袭、转移等生物学行为的影响,探讨其可能的调节机制。方法:用阳离子脂质体转染方法分别转染pcDNA3.1-Ndrg2和SiRNA-Ndrg2于SW620细胞内48h,上调/下调NDRG2的表达;检测NDRG2基因mRNA及蛋白表达水平的变化;通过划痕试验及transwell细胞侵袭试验进一步对上调/下调NDRG2表达水平后的结肠癌细胞迁移和侵袭能力进行分析。结果:pcDNA3.1-Ndrg2转染SW620后,NDRG2的mRNA和蛋白表达水平明显升高,细胞的迁移和侵袭能力下降;SiRNA-Ndrg2转染SW620后,NDRG2的mRNA和蛋白表达水平明显降低,细胞的迁移和侵袭能力上升,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:NDRG2作为抑癌候选基因能够降低结肠癌细胞转移和侵袭能力。     

抑癌候选基因NDRG2对结肠癌细胞SW620的迁移和侵袭力的影响

目的：观察NDRG2对结肠癌SW620细胞侵袭、转移等生物学行为的影响,探讨其可能的调节机制。方法：用阳离子脂质体转染方法分别转染pcDNA3.1-Ndrg2和SiRNA-Ndrg2于SW620细胞内48h,上调/下调NDRG2的表达;检测NDRG2基因mRNA及蛋白表达水平的变化;通过划痕试验及transwell细胞侵袭试验进一步对上调/下调NDRG2表达水平后的结肠癌细胞迁移和侵袭能力进行分析。结果：pcDNA3.1-Ndrg2转染SW620后,NDRG2的mRNA和蛋白表达水平明显升高,细胞的迁移和侵袭能力下降;SiRNA-Ndrg2转染SW620后,NDRG2的mRNA和蛋白表达水平明显降低,细胞的迁移和侵袭能力上升,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论：NDRG2作为抑癌候选基因能够降低结肠癌细胞转移和侵袭能力。     

NUAK1增加乳腺癌细胞的趋化和粘附能力

本课题组先前已证明NUAK1/ARK5可通过影响F-actin的聚合从而促进乳腺癌细胞的侵袭和转移. 但是NUAK1是否还通过其它机制影响乳腺癌的侵袭和转移尚有待于探讨.本文证明NUAK1还可以影响乳腺癌细胞趋化、粘附能力从而在乳腺癌细胞侵袭转移中起重要作用. 应用化学合成的小RNA干扰质粒转染到乳腺癌细胞系MDA MB 231中,用免疫印迹技术检测NUAK1蛋白的表达情况. 结果显示,在敲除NUAK1的细胞（siNUAK1/MDA231）中, NUAK1蛋白表达水平明显降低;趋化运动实验结果显示, siNUAK1/MDA231细胞的趋化运动能力比未处理组（Scr/MDA231）细胞明显降低;细胞粘附实验结果显示, EGF刺激5 min、15 min后,siNUAK1/MDA231细胞比Scr/MDA231细胞粘附细胞数量均明显减少;免疫印迹技术检测integrin β1磷酸化验证NUAK1影响乳腺癌细胞粘附的机制. 结果显示,siNUAK1/MDA231细胞内integrin β1磷酸化比Scr/MDA231细胞不同程度降低. 上述结果表明, NUAK1通过磷酸化integrin β1促进乳腺癌细胞与纤维粘连蛋白的粘附,从而促进乳腺癌的侵袭和转移.     

CD44~+CD24~(-/low)与ALDH1~+作为乳腺癌干细胞标志物之异同

越来越多的研究表明,CD44+CD24-/low与ALDH1+都是乳腺癌干细胞标志物。CD44+CD24-/low细胞与ALDH1+细胞具有很多相同的性质,但又有不同的性质和特点。该文主要就CD44+CD24-/low与ALDH1+之间的相同点、两者在乳腺癌干细胞特性方面的差异及其与乳腺癌基因亚型、预后、转移和耐药之间的不同关系等方面作一综述。     

PROM2通过β-catenin/HER2通路调控乳腺癌细胞SK-BR-3的迁移、侵袭、增殖和凋亡

乳腺癌是当今威胁女性健康最主要的恶性肿瘤之一。虽然当前在乳腺癌的诊治方面获得了一定的进展,但其发病率和死亡率仍然较高,寻找有效的乳腺癌预后标记和治疗靶点是当前研究的热点。本研究通过对高通量基因表达数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)分析发现,Prominin 2(PROM2)在诱导、增强和增殖成瘤能力的3组MCF7乳腺癌细胞中的表达,高于3组对照组MCF7细胞。且在诱导具有侵袭性的MCF10A细胞中的表达,高于未处理非侵袭性MCF10A细胞。研究选择了人乳腺癌细胞系SK-BR-3,成功地将过表达或敲减PROM2质粒转染到细胞中,并检测PROM2对SK-BR-3细胞的迁移、侵袭和增殖和凋亡的作用。划痕结果显示,敲减PROM2的SKBR-3细胞愈合面积更小(P<0.01),过表达PROM2的SK-BR-3细胞愈合面积更大(P<0.01);Transwell的结果显示,敲减PROM2的SK-BR-3细胞侵袭数量更少(P<0.01),过表达PROM2的SK-BR-3细胞侵袭数量更多(P<0.01);流式细胞术的结果显示,敲减PROM2的SK-BR-3细胞增殖能力减弱且凋亡比率增高(2.50%vs.0.93%),过表达PROM2的SK-BR-3细胞增殖能力增强且凋亡比率降低(0.43%vs.0.72%)。然后,探讨PROM2作用的可能机制。通过基因表达谱交互分析(gene expression profiling interactive analysis,GEPIA),对肿瘤基因图谱数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中的乳腺癌数据分析发现,PROM2与β-联蛋白(β-catenin)、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)之间表达正相关。通过定量实时聚合酶链反应、免疫荧光和蛋白质印迹也发现,PROM2促进了β-联蛋白和HER2的表达。证明PROM2可能通过激活β-catenin/HER2通路,促进乳腺癌细胞SK-BR-3的迁移、侵袭和增殖,并抑制其凋亡。     

CD44及CD24在乳腺癌组织中的表达及与临床病理特征的关系研究

目的:探讨肿瘤标志因子CD44及CD24在乳腺癌组织中的表达及与临床病理特征的关系。方法:选择从2015年1月到2017年1月在我院接受手术治疗的乳腺癌患者80例纳入本次研究,另选同期在我院治疗的导管原位癌患者30例,小叶增生患者20例及导管单纯增生患者20例的组织提取标本进行对照,分析CD44及CD24在乳腺癌组织和不同病变类型中的表达,并分析CD44~+/CD24~-细胞在癌症免疫分型中的表达以及CD44~+/CD24~-细胞与乳腺浸润导管癌相关病理特征的关系。结果:乳腺癌组织内的CD44阳性率为52.50%,CD24的阳性率为57.50%,均显著高于癌旁组织的11.25%和15.00%,差异均有统计学意义(均P0.05)。CD44及CD24在导管原位癌及乳腺浸润导管癌中的阳性率高于小叶增生和导管单纯增生,导管原位癌的阳性率高于乳腺浸润导管癌,差异均有统计学意义(均P0.05),且CD44在乳腺浸润导管癌不同分化类型中的阳性率差异有统计学意义(P0.05)。CD24在乳腺浸润导管癌不同分化类型中的阳性率差异不显著(P0.05)。CD44~+/CD24~-细胞在不同癌症免疫分型以及不同分化中的阳性率比较差异均有统计学意义(P0.05)。CD44~+/CD24~-细胞与乳腺浸润导管癌患者的年龄、月经状态、肿瘤直径、淋巴结转移以及远处转移之间均无明显关系(均P0.05)。结论:CD44及CD24在乳腺癌组织内存在较高的阳性率,且CD44~+/CD24~-在乳腺原位癌及低分化的乳腺癌组织内具有更高的阳性率,临床上可尝试通过监测CD44~+/CD24~-的阳性表达情况评价患者的病情及预后。     

三阴性乳腺癌干细胞的富集及CD44+CD24-/low、CXCR4表达测定

目的:探讨MDA-MB-231细胞经无血清培养富集三阴性乳腺癌干细胞,观察再成球、集落形成及CD44+CD24-/low、CXCR4表达。方法:将MDA-MB-231乳腺癌细胞进行微球体培养,取培养第7-9天的微球体,判断干细胞富集的程度;比较不同细胞浓度对癌球细胞成球率影响;流式细胞仪测定CD44+CD24-/low含量;Western blot法分析CXCR4蛋白表达;单个癌球细胞再成球能力;观察癌球与贴壁细胞集落形成。结果:1).在含20 ng/m L EGF,10 ng/m L b FGF,2%b27无血清培养基中可培养三阴性乳腺癌癌球,1×104/m L、2×104/m L、3×104/m L、4×104/m L、5×104/m L细胞浓度癌球细胞成球率分别为(5.61±0.02)%、(3.23±0.54)%、(2.28±0.48)%、(1.05±0.13)%、(0.91±0.01)%,组间比较差异有统计学意义P值均0.05。2).贴壁MDA-MB-231细胞与癌球细胞CD44+CD24-/low含量分别为(38.54±2.00)%VS(66.35±2.06)%,差异有统计学意义P=0.003。3).癌球细胞CXCR4蛋白表达高于贴壁MDA-MB-231细胞,灰度扫描分析差异有统计学意义,P=0.03。4).单个癌球细胞具有再成球能力。5).软琼脂糖集落形成能力癌球需200个细胞即可见集落形成,而贴壁细胞需1 000个MDA-MB-231细胞。结论:1.通过无血清培养可以富集三阴性乳腺癌干细胞,低细胞密度有利于癌球形成。2.癌球中CD44+CD24-/low含量高于贴壁MDA-MB-231细胞。3.CXCR4在癌球中表达高于贴壁MDA-MB-231细胞。     

NDRG2基因启动子甲基化与肺腺癌细胞中mRNA表达相关性的实验研究

目的:探讨肺腺癌细胞中NDRG2基因启动子甲基化状态及其与基因表达的关系。方法:甲基化焦磷酸测序技术检测启动子区域甲基化状态,荧光定量PCR技术检测不同药物浓度下培养细胞中NDRG2基因mRNA的表达水平,分析启动子区域甲基化与基因表达之间的关系。结果:在体外培养细胞中检测到NDRG2基因启动子区域呈现不同程度的甲基化,甲基化频率分别为肺癌A549细胞71.8%、GLC-82细胞86.1%、人脐静脉内皮ECV-304细胞36.8%、胃上皮GES-1细胞42.9%。NDRG2基因mRNA表达与其启动子甲基化程度成反比,甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)作用于细胞后,A549和GLC-82细胞中NDRG2基因的mRNA转录明显上调,至72 h差异显著(P0.05)。结论:肺腺癌细胞中NDRG2基因启动子CpG岛存在高甲基化,甲基化程度与该基因的表达具有负相关性,5-Aza-CdR能在一定程度上提高NDRG2的转录水平。     

TGFβ Governs the Pleiotropic Activity of NDRG1 in Triple-Negative Breast Cancer Progression

In triple-negative breast cancer (TNBC), the pleiotropic NDRG1 (N-Myc downstream regulated gene 1) promotes progression and worse survival, yet contradictory results were documented, and the mechanisms remain unknown. Phosphorylation and localization could drive NDRG1 pleiotropy, nonetheless, their role in TNBC progression and clinical outcome was not investigated. We found enhanced p-NDRG1 (Thr346) by TGFβ1 and explored whether it drives NDRG1 pleiotropy and TNBC progression. In tissue microarrays of 81 TNBC patients, we identified that staining and localization of NDRG1 and p-NDRG1 (Thr346) are biomarkers and risk factors associated with shorter overall survival. We found that TGFβ1 leads NDRG1, downstream of GSK3β, and upstream of NF-κB, to differentially regulate migration, invasion, epithelial-mesenchymal transition, tumor initiation, and maintenance of different populations of cancer stem cells (CSCs), depending on the progression stage of tumor cells, and the combination of TGFβ and GSK3β inhibitors impaired CSCs. The present study revealed the striking importance to assess both total NDRG1 and p-NDRG1 (Thr346) positiveness and subcellular localization to evaluate patient prognosis and their stratification. NDRG1 pleiotropy is driven by TGFβ to differentially promote metastasis and/or maintenance of CSCs at different stages of tumor progression, which could be abrogated by the inhibition of TGFβ and GSK3β.