蛋白激酶C对胰岛素抵抗骨骼肌细胞的影响

目的探讨蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)在棕榈酸(Palmitic Acid,PA)诱导的骨骼肌细胞胰岛素抵抗(Isulin Resistance,IR)中的作用。方法免疫荧光鉴定原代大鼠骨骼肌细胞,氧化酶-过氧化物酶偶联法(GOD-POD法)检测培养液中葡萄糖浓度。设立对照组、棕榈酸组(PA组)、罗格列酮组(Rosiglitazone,Ros组),每组一分为二,分别加PKC抑制剂白屈莱红碱(Chelerythrine Chloride,CC)与正常培养液作用1h,Western Blot检测PKB及P-Ser473 PKB表达水平。结果 90%以上的细胞-αsarcometric actin免疫荧光染色呈阳性反应,表明培养的细胞为骨骼肌细胞;0.6mmol/L的PA作用24h可诱导骨骼肌细胞产生胰岛素抵抗;PA组与对照组相比P-Ser473 PKB水平显著降低,与本组未加CC相比显著升高。同时,罗格列酮组及本组加CC中P-Ser473PKB水平均高于PA组。结论在PA诱导的骨骼肌细胞IR方面PKC起重要作用,罗格列酮与PKC抑制剂CC均能改善PA引起的IR。     

有氧运动降低胰岛素抵抗小鼠海马细胞焦亡相关蛋白及炎症因子的表达

本研究通过观察高脂饮食及有氧运动干预后小鼠海马细胞焦亡及炎症相关蛋白的表达情况,探讨运动改善胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)的可能机制。选取6周龄C57BL/6J雄性小鼠38只,随机以正常饮食(n=12)或高脂饮食(n=26)喂养12周后进行葡萄糖和胰岛素耐量实验,根据结果将小鼠分为对照组(n=12)、IR组(n=10)和IR有氧运动组(n=10)。IR有氧运动组进行12周的渐增跑台训练。干预结束后麻醉处死小鼠并剥离海马组织,提取蛋白进行Western blot实验,检测细胞焦亡及炎症相关蛋白的表达情况。结果显示:(1)与对照组相比,IR小鼠海马NFκB,炎症小体相关蛋白Nod样受体蛋白3 (Nod-like receptor protein 3, NLRP3)、斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC),细胞焦亡相关蛋白proCaspase-1、gasdermin D (GSDMD)、GSDMD-N及炎症因子IL-1β、IL-18均显著升高,而炎症小体相关蛋白NIMA相关蛋白激酶7 (NIMA-related kinase 7, NEK7)及焦亡相关蛋白Caspase-1有升高趋势,但无显著差异。(2)与IR组相比,渐增跑台训练能够显著降低IR小鼠海马NFκB、NLRP3、NEK7、ASC、pro-Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N、IL-1β、IL-18的表达。以上结果提示,12周渐增跑台训练能够显著降低IR小鼠海马焦亡相关蛋白及炎症因子表达,抑制细胞焦亡。     

表没食子儿茶素没食子酸酯抑制肥胖大鼠肝中TLR4炎症通路及胰岛素抵抗

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)对肥胖大鼠肝组织中Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)炎症通路以及胰岛素抵抗的影响。方法将30只雄性SD大鼠随机分为普食组(NC)和高脂饮食组(HFD)。喂养16周后,将高脂饮食组随机分为HFD组与EGCG组继续喂养16周,检测相关代谢指标,测定肝组织甘油三酯含量,并进行油红染色评估肝脂质聚集情况;实时荧光定量PCR检测其肝脏中TLR4和TNF受体相关因子6(TNF receptor associated factor 6,TRAF6)mRNA水平;蛋白质印记检测其肝组织中TLR4信号通路及胰岛素信号通路相关蛋白水平。结果EGCG明显降低大鼠肝脏甘油三酯浓度及脂质聚集、TLR4和TRAF6 mRNA水平,TLR4信号通路相关蛋白水平及胰岛素信号通路相关蛋白水平。结论EGCG抑制肥胖大鼠肝组织中TLR4通路以及胰岛素抵抗。     

运动干预对胰岛素抵抗大鼠骨骼肌IL-1β表达的影响

目的观察运动干预对高脂饲料诱导胰岛素抵抗（IR）大鼠白细胞介素1β（IL-1β）表达的影响,探讨运动减轻IR的可能机制。方法健康Wistar雄性大鼠分为基础饲料喂养组（normal chow group,NC）,高脂膳食喂养组（high-fat diet group,HF）。高脂膳食喂养Wistar雄性大鼠10周,构建IR动物模型。10周后,HF组再随机分为高脂喂养运动组和非运动组,游泳运动干预4周。游泳运动干预前后以正常血糖-高血浆胰岛素钳夹实验技术[hyperinsulinemic-euglycemic clamp（HEC）technique]评估IR大鼠胰岛素敏感性,ELISA法测定大鼠血清IL-1β水平,RT-PCR法测定大鼠骨骼肌IL-1βmRNA表达。结果HF组大鼠葡萄糖输注率（glucose infusion rate,GIR）显著低于NC组（P〈0.05）,HF组血清IL-1β水平及骨骼肌组织IL-1βmRNA表达明显高于NC组（P〈0.05,P〈0.01）;运动组大鼠血清IL-1β水平及骨骼肌组织IL-1βmRNA表达明显低于非运动组（P〈0.05）,与NC组差异无显著性（P〉0.05）。结论运动改善IR大鼠胰岛素敏感性,可能与降低IR大鼠IL-1β的表达有关。     

脂毒性-炎症反应与胰岛素抵抗的关系研究进展

胰岛素抵抗不仅是2型糖尿病的发病基础,更是贯穿多种代谢相关性疾病的主线.糖、脂代谢是生物最基本的能量代谢形式.近年来研究发现,许多胰岛素抵抗都伴随着某些炎性因子以及游离脂肪酸水平的升高,胰岛素抵抗不是机体糖脂代谢稳态失衡的唯一表现形式,胰岛素抵抗的概念不仅仅是狭义的胰岛素自身,而应是由多种脂源性激素参与的"胰岛素抵抗状态",这种状态实质上代表一种普遍意义的脂肪抵抗状态.因此,"脂毒性-炎症反应"与脂源性激素抵抗的关系正成为当前研究的热点,本文就二者关系作一综述.     

棕榈酸的组织吸收分布及对骨骼肌胰岛素抵抗的影响

脂肪酸代谢紊乱是Ⅱ型糖尿病的主要致病因素之一。棕榈酸是血液中含量最高的游离脂肪酸。我们建立了大鼠颈静脉置管输注棕榈酸的模型,发现血液中的大部分棕榈酸被骨骼肌组织所吸收。以棕榈酸处理的C2C12骨骼肌细胞为实验模型发现,棕榈酸进入骨骼肌细胞后的中间代谢产物(磷脂和甘油二酯)的累积,会造成内质网应激及胰岛素抵抗。提示血液中棕榈酸含量的升高可能通过骨骼肌的胰岛素抵抗机制,影响Ⅱ型糖尿病的发生和发展。     

原代培养骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型的建立

目的:观察高脂负荷在胰岛素抵抗形成中的意义.方法:用不同浓度椋榈酸、胰岛素分别培养骨骼肌细胞2h、6h、12h、24h,对棕榈酸诱导组的一部分细胞给予1× 10-7M胰岛素刺激2h,用血糖检测试剂盒(GOD-POD)检测各组培养液中的葡萄糖含量,研究不同浓度棕榈酸、胰岛素对骨骼肌细胞摄取葡萄糖的影响,观察胰岛素的生理功效的变化.结果:0.6mM棕榈酸诱导12h以上或者5×101-M胰岛素诱导24h后,培养液中的葡萄糖浓度比正常组高且有显著性差异,表明细胞的糖代谢能力降低.经1×10-7M胰岛素刺激2h后的棕榈酸诱导组,培养液中葡萄糖的浓度与未经胰岛素刺激的棕榈酸诱导组相比无显著差异,胰岛素的生理功效降低,证实棕榈酸诱导组细胞已对胰岛素产生耐受.结论:高脂或高胰岛素条件均可诱导原代骨骼肌细胞胰岛素抵抗模型.     

体外模拟脑缺血再灌注条件下BV-2细胞TLR4信号途径对TLR2表达的影响

研究证实,TLR4和TLR2有可能作为重要炎性受体介导脑缺血再灌注炎性损伤.然而目前还不清楚在此过程中TLR2和TLR4受体之间是否存在着交叉对话可能.本研究首先利用针对TLR4基因的RNA干扰技术阻断体外模拟脑I/R条件下BV-2细胞TLR4信号传导途径,观察此时TLR2受体表达变化,初步探讨TLR4信号途径对TLR2表达的影响.然后利用NF-κB抑制剂PDTC阻断NF-κB活性来观察体外模拟脑I/R条件下BV-2细胞TLR2和TLR4受体表达变化,进一步阐明NF-κB在TLR2和TLR4交叉对话中的作用.结果表明：（1）体外模拟脑I/R条件下阻断BV-2细胞TLR4信号传导途径可以明显抑制TLR2和NF-κB表达的上调;（2）PDTC预处理后在体外模拟脑I/R条件下BV-2细胞TLR2和TLR4的表达均下调.结果提示,脑I/R损伤中TLR4受体激活后有可能通过NF-κB的介导,进一步影响TLR2的表达,从而导致炎症反应的链式放大,两者协同加重了脑损伤的过程.     

启动子CMV和EF1α对人胰岛素基因在BHK细胞中表达的影响

目的　构建人胰岛素基因真核高效表达载体 ,为胰岛素转基因研究奠定基础。方法　用限制性内切酶SpeⅠ和HindⅢ消化pEF1α GFP ,回收 1 2kbEF1α启动子 ,插入到pCMV mINS的NruⅠ和HindⅢ位点中 ,获得重组质粒pEF1α mINS ;将pCMV mINS和pEF1α mINS分别转染BHK细胞 ,用G418筛选 ,阳性克隆传至 2 0代后 ,分别用放免方法和免疫组化法分析胰岛素和 或胰岛素原在BHK细胞中的表达情况。结果　经放免测定 ,pCMV mINS和pEF1α mINS在BHK细胞中胰岛素和 或胰岛素原的表达量分别为 4 0 77μIU ml和 6 897μIU ml。经免疫组化分析 ,pCMV mINS在BHK细胞质中胰岛素表达水平的灰度值为 190 0± 19 5 6 ;pEF1α mINS在BHK细胞质中胰岛素表达水平的灰度值为 181 4± 18 45 ,在BHK细胞核中表达水平的灰度值为 15 5 4± 11 6 6。结论　在BHK细胞中启动子EF1α启动胰岛素基因表达的活性比启动子CMV高。     

PAF对BV2细胞炎症因子分泌的影响及转录组学分析

探究血小板活化因子（Platelet activating factor,PAF）对BV2细胞炎症因子分泌的影响及初步推测其调控机制。外源PAF(2×10^-5M)作用于BV2细胞24 h,36 h,48 h后,（1）CCK8实验检测空白对照组,Mock组和PAF处理组细胞活性;（2）ELISA实验测炎症因子TNFα、IL-6、Cxcl2、IL-1a的分泌;（3）Western Blot检测炎症介质COX-2蛋白水平;（4）对PAF处理24h的BV2细胞以及对应的Mock组细胞进行RNA测序得到转录组测序结果;（5）GO和KEGG富集分析后,运用String数据库配合Cytoscape软件找出炎症相关的Hub基因并挑选出以下基因（Ccl4、Ccl3、Ccl7、IL-1a、Cxcl2、IL1f9、IL34、COX-2、Serpinb1a）进行qPCR验证。实验结果表明,PAF作用时间为24 h,36 h,48 h后,相比对照组：（1）BV2细胞活性降低;（2）上清液中的炎症因子TNFα,IL-6,IL-1a,Cxcl2分泌增加;（3）炎症介质COX-2蛋白表达水平上调...     

人骨骼肌M蛋白的提取与纯化

依据Ｔｒｉｎｉｃｋ－Ｅｐｐｅｎｂｅｒｇｅｒ对鸡骨骼肌Ｍ蛋白的提取方法,由人骨骼肌中得到的Ｍ蛋白粗提物除含分子量为１６５０００的Ｍ蛋白外,还含有分子量为１８５０００和１４００００（Ｃ成分）的两组分。由于在粗提物中未发现分子量为９００００的磷酸化酶,我们将最终纯化步骤中的亲和层析改为制备电泳,同样获得了纯化的Ｍ蛋白。     

血液透析与血液灌流对终末期糖尿病肾病患者胰岛素抵抗及血清炎症因 子水平的影响

目的:探讨血液透析联合血液灌流治疗终末期糖尿病肾病的疗效以及对患者胰岛素抵抗及血清炎症因子水平的影响。方法:选择2013年7月-2015年7月在我院接受治疗的100例终末期糖尿病肾病患者作为研究对象。根据治疗方法不同,将所选研究对象分为研究组和对照组。研究组采用血液透析联合血液灌流治疗,对照组采用血液透析联合血液透析滤过治疗。观察并比较两组患者治疗前后胰岛素抵抗程度及血清C反应蛋白(CRP),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及白介素-6(IL-6)水平的变化情况。结果:治疗前,两组患者FBG、FINS、Homa-IR、CRP、TNF-α及IL-6水平比较差异均无统计学意义(P0.05);与治疗前比较,两组患者治疗后FBG、FINS、Homa-IR、CRP、TNF-α及IL-6水平均显著降低,差异具有统计学意义(P0.05),且研究组患者治疗后FBG、FINS、Homa-IR、CRP、TNF-α及IL-6水平均明显低于对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:与血液透析联合血液透析滤过方法比较,血液透析联合血液灌流治疗能够更有效的改善ESDN患者胰岛素抵抗程度,降低炎症因子水平,值得临床进一步推广应用。     

明日叶查尔酮对2型糖尿病大鼠骨骼肌细胞胰岛素抵抗的干预作用

目的:研究明日叶查尔酮对2型糖尿病大鼠骨骼肌胰岛素抵抗的干预作用.方法:将2型糖尿病大鼠随机分成四组,高、中、低剂量组分别每日经口灌胃给予明日叶查尔酮30、10和5mg/(kg·bw),糖尿病对照组给予等量生理盐水.各组均以高脂饲料喂养.四周后采用葡萄糖氧化酶法检测空腹血糖;放射免疫法检测血清胰岛素含量;免疫组化法检测葡萄糖转运体1和葡萄糖转运体4蛋白表达水平.结果:经图像分析,高剂量组骨骼肌细胞中葡萄糖转运体1和葡萄糖转运体4蛋白表达平均光密度值分别为0.054± 0.0064和0.063±0.0139,均较糖尿病对照组显著性升高(P＜0.05).高剂量组空腹血糖和胰岛素水平分别为(12.3± 1.64)mmol/L和(25.65±3.34) (μIU/mL),均较糖尿病对照病显著性降低(P＜0.05).结论:明日叶查尔酮可增加2型糖尿病大鼠骨骼肌葡萄糖转运体l和葡萄糖转运体4蛋白表达水平,降低空腹血糖和胰岛素水平,改善胰岛素抵抗状况.     

小鼠肌母细胞的增殖与分化

通过对小鼠肌母细胞C2C12的培养,研究C2C12细胞的增殖与分化的关系以及胰岛素在细胞分化过程中的作用。在对照组中,C2C12细胞增殖占了明显的优势,细胞形态几乎没有发生变化;而在实验组中,C2C12细胞在换为分化培养基24小时后,就出现了部分细胞衰亡和死亡的现象,尤其是在48小时细胞的死亡率达到最高,存活细胞开始从增殖期进入分化期,72小时出现了少量肌管,在96小时细胞分化效果达到最好。而在添加了胰岛素的分化培养基中的细胞分化效果明显好于没有添加胰岛素的分化培养基中的细胞,结果表明,胰岛素促进C2C12细胞的分化。     

Adipocyte Differentiation‐related Protein in Human Skeletal Muscle: Relationship to Insulin Sensitivity

Objective: To determine whether adipocyte differentiation‐related protein (ADRP), a lipid droplet—associated protein that binds to and sequesters intracellular fatty acids, is 1) expressed in human skeletal muscle and 2) differentially regulated in human skeletal muscle obtained from obese non‐diabetic (OND) and obese diabetic (OD) subjects. Research Methods and Procedures: Ten OND subjects and 15 OD subjects underwent a weight loss or pharmacological intervention program to improve insulin sensitivity. Anthropometric data, hemoglobin A_1C, fasting glucose, lipids, and glucose disposal rate were determined at baseline and at completion of studies. Biopsies of the vastus lateralis muscle (SkM) were obtained in the fasting state from OND and OD subjects. Protein expression was determined by Western blotting. Results: ADRP was highly expressed in SkM from OND (4.4 ± 1.54 AU/10 μg, protein, n = 10) and OD (5.02 ± 1.33 AU/10 μg, n = 12) subjects. OND subjects undergoing weight loss had decreased triglyceride levels and improved insulin action. SkM ADRP content increased with weight loss from 5.14 ± 2.15 AU/10 μg to 9.92 ± 1.57 AU/10 μg (p < 0.025). OD subjects were treated with either troglitazone or metformin, together with glyburide, for 3 to 4 months. Both treatments attained similar levels of glycemic control. OD subjects with lower baseline ADRP content (2.85 ± 1.07 AU/10 μg, n = 6) displayed up‐regulation of ADRP expression (to 9.27 ± 2.76 AU/10 μg, p < 0.025). Discussion: ADRP is the predominant lipid droplet—associated protein in SkM, and low ADRP expression is up‐regulated in circumstances of improved glucose tolerance. Up‐regulation of ADRP may act to sequester fatty acids as triglycerides in discrete lipid droplets that could protect muscle from the detrimental effects of fatty acids on insulin action and glucose tolerance.     

The JAK2/STAT3 Signal Pathway Regulates the Expression of Genes Related to Skeletal Muscle Development and Energy Metabolism in Mice and Mouse Skeletal Muscle Cells

The gene encoding a β-galactosidase from Entevobacter cloacae GAO was cloned and expressed in Escherichia coli. The nucleotide sequence of the insert of a positive clone had an open reading frame of 3084 bp that encoded a polypeptide of 1028 amino acid residues with a calculated molecular mass of 116,677 daltons. The amino acid sequence of β-galactosidase deduced from the nucleotide sequence, especially the sequence around the putative active site and of the fourteen regions, showed significant homology to β-galactosidases of other microorganisms, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Lactobacillus bulgaricus, and Clostridium acetobutylicum.     

CerS1-Derived C18:0 Ceramide in Skeletal Muscle Promotes Obesity-Induced Insulin Resistance

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EGF、bFGF和PHGF对大鼠骨骼肌卫星细胞增殖的影响

用MTT、流式细胞技术、溴脱氧核甘尿嘧啶(bromodeoxyuridine,BrdU)掺入法及免疫细胞化学检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的方法探讨了表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)及促肝细胞生长因子(hepatocyte growth-promoting factor,PHGF)对大鼠骨骼肌卫星细胞增殖的影响。结果表明bFGF、PHGF对骨骼肌卫星细胞有较强的促增殖作用,且两者之间无差别,bFGF最佳作用浓度为5μg／L,PHGF最佳作用浓度为10μg／ml。与其他生长因子相比,PHGF价格低廉易于获取,适宜推广。EGF增殖作用不明显。