酵母菌麦芽糖发酵等效异位基因系的遗传分析

用球形酵母或薛氏酵母为隐性菌株,对酵母属3个种的麦芽糖发酵基因进行了遗传分析。实验结果证明:(1)啤酒酵母2.982含有2个互不连锁的麦芽糖快发酵基因MALⅠ和MALⅡ。(2)卡尔斯伯酵母2.500仅含MAL6基因。(3)在葡萄汁酵母2.346与薛氏酵母杂种的一个后代中,发现葡萄汁酵母至少含有一个MALI基因。(4)球形酵母2.1161含有malI,malⅡ和mal6基因。本文对单倍体细胞间、单倍体细胞与孢子及孢子间三种杂交方法有所改进,提高了杂交频率。     

酵母菌杂交育种——Ⅰ.酵母菌麦芽糖基因对麦芽糖发酵力的效应

为了研究酵母菌麦芽糖基因对麦芽糖发酵力的效应,我们从酵母菌分离出4个不连锁的麦芽糖基因。MALA、MALB和MALC是从啤酒酵母分离出的,MAL6是从卡尔斯伯酵母分离出的。用显微操作技术共组成20种不同基因组合和65个杂种。用不同基因型的二倍体杂种测定麦芽糖基因对麦芽糖发酵力的效应,结果表明: (1)根据单因子杂种产生CO_2的量可分为两类杂种,含MALA和MALB单因子杂种比含MALC和MAL6单因子杂种产生的CO_2量多。 (2)含MALA与MALB基因的纯合子与杂合子麦芽糖发酵力一样,而含其余两个基因的纯合子比杂合子产生CO_2量多。 (3)双因子杂种产生CO_2的量变化很大(2.8—4.9克),值得注意的是双因子杂种(MALB×MALA)产生的CO_2量最高,同时发现凡由MALB与另一MAL基因组成的双因子杂种表现出麦芽糖发酵力的相加效应(杂种优势),而由其他三个MAL基因组成的双因子杂种发酵力和亲株一样。 (4)多因子杂种(三因子、四因子杂种)麦芽糖发酵力和其双因子杂种相同。 这些实验结果提示在MAL基因和麦芽糖发酵力间有明显的相关性。     

酵母菌杂交育种——Ⅲ.酵母菌新麦芽糖互补基因的鉴定

用显微操作技术对不同自然酵母菌株:小椭圆酵母(2.699-2-3)、球形酵母(2.1161.6,2.1153)、薛氏酵母(2.213-4C)以及少孢酵母(2.520)进行种间杂交。通过四分体分析发现一些杂种有两种互补基因系。这两种基因系是基因间互补,其中一组基因系带有互补基因MAL_(m-1)和一个非等位互补基因MAL_(g-1),而另一组基因系带有前一基因系中的MAL_(m-1)基因和MAL_(g-2)基因,后一个基因是MAL_(g-1)的非等位基因。用四分体分析测定麦芽糖互补基因,从酵母菌共分离出3个麦芽糖互补基因。本文首次证明小椭圆酵母中存在着MAL_(m-1)基因,其它两个基因是从球形酵母中分离出的。基因MAL_(m-1)在所有杂交组合中起着关键性的作用。 根据遗传分析,发现这三个基因间无连锁关系,基因MAL_(m-1)和MAL_(g-1)位于靠近其各自的着丝点,它们不同于以往所发现的麦芽糖互补基因,因而定为新麦芽糖互补基因,第三个基因MAL_(g-1)则远离其着丝点。     

啤酒酵母菌的细胞融合

啤酒多倍体酵母菌原生质体已成功地与单倍体原生质体进行融合。经细胞壁再生后,稳定的融合重组体被分离出来。这些融合体的基因分析表明,融合体中含有双亲的基因型。孢子形成良好,且每个子囊中含有四个孢子,每个孢子确实是二倍体。这样原生质体融合就提供了一个对啤酒酿造酵母进行遗传分析的方法。但是如果没有一个方便的杂交技术,这个方法将是很困难的。     

RIM21基因缺失对拉格啤酒酵母絮凝性能的影响

拉格啤酒酵母是我国啤酒酿造的主要菌种。细胞絮凝是啤酒酵母重要的生产性状,在不影响发酵性能的情况下适度提高酵母的絮凝能力,有助于发酵结束时细胞和产物的分离,有利于工业化啤酒生产,具有较高的经济价值。前期在对一株工业用拉格啤酒酵母G03及其絮凝突变株的研究中,挖掘到一个可能影响啤酒酵母絮凝性的候选基因RIM21。为了验证该基因的作用,文中在G03中对RIM21进行了敲除,发现RIM21敲除后,酵母在11 ℃发酵条件下的絮凝性能增强,基因FLO5、Lg-FLO1及细胞壁完整性途径中的部分基因表达上调。同时,CO2失重、酒精度、发酵度等发酵指标未有明显变化。另外,发现RIM21的缺失增强了啤酒酵母对细胞壁抑制剂的耐性。研究结果为阐释低温发酵条件下啤酒酵母的絮凝调控机理及菌株絮凝性的改善提供了基础。     

用带有α-乙酰乳酸脱羧酶编码基因的固定化酵母生产啤酒

啤酒酵母VTT-A-88085(A-85)是含有α-乙酰乳酸脱羧酶(α-ALDC)基因的试验菌株。它是由深层发酵啤酒酵母VTT-A-63015(A-15)菌株构建的转化子。A-85是一株整合菌昧,即α-ald基因插入到酵母染色体DNA上,因此比用质粒转化得到的转化子更稳定。转化子产生的α-ALDC酶可直接把α-乙酰乳酸转化成乙偶姻而不形成双乙酰,因此可以免除或缩短常规啤酒发酵所需的冗长的后期发酵。     

原生质体融合构建耐温酵母菌株

耐温的克鲁维酵母与产酒率高的酿酒酵母进行属间原生质体融合构建耐温酵母蓖株,经ＤＴＴ分段预处理获得大量具再生活性原生质体对融合株ＡＹ０２３等进行了乙醇脱氢酶同工酶,麦芽糖同化,遗传稳定性及高温发酵分析,融合株ＡＹ０２３表达了双亲遗传特性,在４５℃高温发酵条件,乙醇产率高达７．４％,是目前已见文献报道的产酒率最高的耐温酵母菌株。     

重组酵母菌乙醇脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的:克隆产麻黄碱重组酵母菌乙醇脱氢酶基因片段,并对其进行序列分析,为研究该基因在重组酵母中与麻黄碱生物合成途径的关系提供参考.方法:根据一段利用抑制差减杂交技术获得的来源于重组酵母乙醇脱氢酶基因片段,采用RACE的方法扩增Adh基因,使用分子生物学软件对该基因进行生物信息学分析.结果:获得一段大小为1 245 bp的基因片段,编码375个氨基酸,含有两个催化域和两个锌结合域,与来源于Gandida boidinii ADH3基因的同源性为85％.结论:克隆的基因为乙醇脱氢酶基因,并在GenBank注册,登录号为JF293468.     

低双乙酰抗老化啤酒酵母工程菌的构建

用来源于啤酒酵母的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因（GSH1）和铜抗性基因（CUP1）取代质粒pLZ-2中α-乙酰乳酸合成酶基因（ILV2）内部约2.3kb的DNA片段,构建成重组质粒pICG。限制酶酶切质粒pICG后获得在基因GSH1和CUP1两端含有ILV2序列的6.0kb的DNA片段。用此片段转化啤酒酵母YSF31,得到铜抗性高的转化子。并通过PCR和α-乙酰乳酸合成酶（AHAS）活性测定筛选到酵母工程菌。小试实验结果表明酵母工程菌谷胱甘肽含量比受体高34％,而双乙酰含量是受体的75％。其他发酵指标并没有发生改变。中试实验表明酵母工程菌发酵周期缩短3d,而且成品啤酒的保鲜时间延长50％。由于DNA操作过程中没有外源基因介入,因此啤酒酵母工程菌为生物安全的自克隆菌株,具有重要的实际应用价值。     

酵母菌中质粒DNA的快速检测

随着基因工程研究的发展,近年来酵母质粒作为基因工程载体的研究已获得明显进展。因此,开展酵母质粒DNA快速检测方法的研究,将是很有意义的。目前质粒在啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中研究较多。1982年龚启蕙等报道了啤酒酵母7209—1A及1984     

几株啤酒酵母的筛选及发酵性能比较*

啤酒酵母是啤酒酿造的灵魂,可以直接影响啤酒品质。在啤酒酿造过程中,由于啤酒酵母被多次传代和保藏,造成优良菌种发酵性能衰退等问题,导致发酵不彻底,影响最后啤酒的风味质量。为此以8株Lager型啤酒酵母为出发菌株,通过平板分离纯化获得80株分离菌株,再经过三角瓶发酵初筛和复筛、发酵罐中试发酵实验最终获得了8株发酵性能优良的啤酒酵母。其中,6株酵母可应用于酿造双乙酰含量低于0.1 mg/L的啤酒;3株酵母发酵度高于70%,适合酿造干啤酒;1株酵母发酵度低于50%,适合酿造低醇啤酒。在风味方面:1株酵母酿造的啤酒醇酯比为3.3,啤酒酯香味较突出;另1株酵母酿造的啤酒醇酯比为4.5,啤酒高级醇含量较高。8株经过选育的啤酒酵母发酵特征明显,便于精酿啤酒厂实际应用。     

酵母渗透敏感性状的遗传学分析

通过对高渗敏感的酵母菌株H516-18(a)的遗传分析,证明啤酒酵母中存在着除som1,osm2以外的另一个渗透敏感基因,暂定名为Osm3,它引起酵母在乙二醇(2M)高渗培养基和其它高渗培养基中的生长敏感。经osm3-MAT双因子杂交分析表明,osm3和MAT不连锁,它不位于第三条染色体,而是一个与着丝粒连锁的基因,与着丝粒距离约为2.6分摩(cM)。本工作也比较测定了高糖浓度对不同菌株发酵力的影响。发现在高糖(40％)浓度下发酵力的增加受osm3基因的影响。本文对osm3基因作用机理也作了初步探讨。     

麦芽糖假丝酵母菌混合糖代谢的发酵特性

葡萄糖和木糖的混合糖共代谢是木质纤维素资源高效转化利用的关键环节。利用本实验室保藏的天然木糖利用酵母菌,麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)Xu316,本研究对该菌代谢利用不同比例的葡萄糖、木糖发酵特性进行了系统测试,总结了麦芽糖假丝酵母混合糖代谢的一般规律。研究结果表明麦芽糖假丝酵母菌具有较高的葡萄糖利用率和木糖醇积累能力。在糖浓度低于20%时,该菌可以共同利用葡萄糖和木糖,最大乙醇产量和木糖醇产量分别为0.43g·g-1和0.58g·g-1,具有工业应用生产生物基产品的潜力。     

利用人工锌指文库选育高乙醇耐受性工业酵母菌株

选育高乙醇耐性的酿酒酵母菌株对提高燃料乙醇的发酵效率具有重要意义.锌指蛋白广泛存在于多种生物中,对基因的转录和翻译起重要的调节作用.利用人工设计的锌指蛋白可定向设计锌指序列及其排列顺序,实现对细胞内多个基因的全局调控.由于与环境胁迫反应相关的基因很多,因此可利用人工锌指蛋白技术获得耐受性提高的微生物重组菌.文中将人工锌指文库转入到酿酒酵母模式菌株S288c,选育了具有高乙醇耐受性的重组菌株M01,并分离了与乙醇耐受性提高相关的人工锌指蛋白表达载体pRS316ZFP-M01,转入工业酿酒酵母Sc4126,在含有不同浓度乙醇的平板上,工业酵母Sc4126的重组菌株表现出显著的耐受性提高.在高糖培养基(250 g/L)条件下进行乙醇发酵,发现重组菌的乙醇发酵效率明显快于野生型,发酵时间提前24 h,且发酵终点乙醇浓度提高6.3％.结果表明人工锌指文库能够提高酵母的乙醇耐受性,为构建发酵性能优良的酵母菌种奠定了基础.     

重组酵母菌的高密度发酵表达

酵母作为一类外源基因的表达系统具有很多优点 ,有许多外源基因在工程酵母菌表达生产重要的外源蛋白[1] 。从生理学角度看 ,作为外源基因的受体细胞 ,酵母的生理和遗传特性影响着外源基因的表达。同时 ,外源基因的表达 ,特别是高表达的外源蛋白对宿主细胞有抑制作用甚至会导致细胞中毒或死亡。再加上工程菌的培养过程中的不稳定性问题的存在 ,因此 ,菌体细胞的高浓度和目的基因的高表达是一对矛盾 ,它们互相制约 ,构成生物工程研究的重要工作之一。1 .工程酵母菌的高密度发酵酵母的高密度发酵是一个相对概念 ,一般指发酵液中酵母浓度在 30 …     

原生质体融合构建耐温酵母菌株#

耐温的克鲁维酵母(Y₀₃₄)与产酒率高的酿酒酵母(A₀₀₁。)进行属间原生质体融合构建耐温酵母菌株,经DTT分段预处理获得大量具再生活性原生质体对融合株AY₀₂₃等进行了乙醇脱氢酶同工酶,麦芽糖同化,遗传稳定性及高温发酵分析,融合株AY₀₂₃表达了双亲遗传特性。在45℃高温发酵条件,乙醇产率高达7.4％,是目前已见文献报道的产酒率最高的耐温(45℃)酵母菌株。     

四川甘孜州高山葡萄酒产区酵母菌多样性分析

【背景】西南高山葡萄酒产区的甘孜州产区,具有生产优质葡萄酒的自然禀赋。【目的】研究四川甘孜州葡萄酒产区真核微生物种类多样性、本土酿酒酵母遗传多样性,以及商业酵母对本土酵母多样性的影响。【方法】利用ITS高通量测序技术对赤霞珠接种发酵和自然发酵过程中的微生物进行多样性分析,并利用Interdelta指纹图谱分析法,对经过26S rRNA基因鉴定的野生酿酒酵母基因型进行分类。【结果】ITS测序结果显示,接种发酵和自然发酵各时期均注释到7个科7个属的酵母,通过Interdelta指纹图谱分析发现甘孜州产区的酿酒酵母共有5种基因型。该产区酿酒酵母的6株代表菌株与我国其他产区109株酿酒酵母的进化树分析结果显示,均与来自北京产区的酿酒酵母菌株亲缘关系更近。【结论】甘孜州葡萄酒子产区酵母资源丰富,表现出较高的微生物多样性和中等程度的本土酿酒酵母基因型多样性,为后续优良本土酵母菌株的筛选奠定基础。     

Lager啤酒酵母RLM1基因调控对其抗自溶性能的影响

啤酒酵母的自溶会严重影响啤酒的品质,而酵母的质量也被认为是啤酒酿造的关键因素之一。前期在啤酒酵母自溶的研究中发现细胞完整性途径中重要的转录因子RLM1基因与酵母自溶有密切关系。本研究在啤酒酵母单倍体菌株中对RLM1进行敲除与过表达,发现RLM1敲除后,酵母菌抗自溶性能差,而RLM1过表达则有助于酵母的抗自溶。另外,发现RLM1基因的敲除影响了酵母的抗渗透压性能、细胞壁损伤的耐受性、抗氮饥饿性能和温度耐受性。研究发现细胞壁组装及DNA损伤应答相关基因GAS1的表达随RLM1的过表达与敲除而调整,而CWI途径中其他相关基因的调控方式并没有明显的规律,推测RLM1可能主要影响了CWI途径中GAS1基因的表达,进而提高啤酒酵母在恶劣环境中的抗逆性。此研究结果对于进一步选育抗自溶啤酒酵母以及了解啤酒酵母的自溶机制提供了基础。     

异柠檬酸脱氢酶基因调控对拉格酵母抗自溶性能的影响

啤酒酵母的自溶会影响啤酒的风味和品质,对酵母自溶的调控是工业啤酒生产的迫切需求。前期在啤酒酵母自溶的研究中发现柠檬酸循环相关基因对酵母自溶有较大影响。为探究柠檬酸循环中异柠檬酸脱氢酶基因调控对自溶的影响,在典型拉格啤酒酵母(Saccharomyces pastorianus H.)Pilsner中对IDP1和IDP2基因进行了破坏和过表达。结果发现IDP1基因的破坏能提高酵母的抗自溶能力,自溶96 h抗自溶指数为8.40,比原始菌提高了1.5倍。IDP1基因的破坏提高还原型辅酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)的供应,NADPH/NADP^(+)的比值为1.94,发酵结束时胞内ATP水平比原始菌提高1.8倍,活性氧(reactive oxygen species,ROS)相比原始菌减少10%。IDP2基因的缺失造成酵母快速自溶和NADPH供应的减少,自溶96 h抗自溶指数为4.03,NADPH/NADP^(+)的比值为0.89。发酵结束时胞内ATP水平相比原始菌减少8%,ROS是原始菌的1.3倍。本研究进一步阐释了柠檬酸循环相关基因对酵母自溶的调控机理,为选育自溶性能可控的优良酵母提供了理论基础。     

全小麦啤酒酵母菌株的诱变育种及应用研究

采用10 Kev低能N~+注入啤酒酵母,经筛选获得一菌株Lz37,再用150 MPa超高压处理菌株Lz37,经双乙酰平板筛选获得一菌株Gy3,其凝聚性很强,适合于在小麦汁中发酵啤酒,其发酵度为66%～68%,双乙酰含量低于口味阈值,遗传稳定性良好。将Gy3酵母定为全小麦啤酒生产应用酵母,命名为商啤3号(Sp-03)。SP-03啤酒酵母菌株的各项生理及生产性能都较优良,特别是在全小麦芽啤酒的酿造中适用性较强,经过对发酵工艺等的调整,用其酿制的啤酒口感纯正、淡爽、柔和。