非核糖体肽合成酶装配机制研究进展

非核糖体多肽(nonribosomal peptide,NRP)是天然生物活性产物一大类群,组成结构多样,具有多种重要的药用价值。在微生物中催化非核糖体多肽生物合成的是非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase,NRPS),NRPS是一类模块酶系,模块的组装在非核糖体多肽合成及其环化中起着关键作用。本文主要对非核糖体肽合成酶常规模块组装模式及3种非常规合成模式进行综述,为深入了解和应用非核糖体肽合成酶在抗生素类生物活性物质中的作用提供理论依据。     

非核糖体肽的生物合成研究进展

非核糖体肽(nonribosomal peptide, NRP)是由多种微生物通过非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase, NRPS)等催化合成的一类小分子多肽类次级代谢产物,具有抗菌、抗肿瘤、免疫抑制等多种生物活性,是一类重要的微生物药物,具有很高的临床应用价值。从目前已发现的小分子多肽类天然药物出发,综述了该类物质的生物功能、合成组装机制以及近年来在工程改造方面的进展,并提出了未来研究发展方向,对进一步通过组合生物合成等方式高效合成更多种类的小分子多肽类活性物质具有借鉴意义。     

非核糖体肽合成酶催化模块的重构与多肽合成

天然次级代谢产物是重要的药物来源,非核糖体肽(non-ribosomal peptide, NRP)是自然界中广泛存在的次级代谢产物,其多样的化学结构使其具有多种生物活性,如抗炎、抗肿瘤、抗病毒等。基于非核糖体多肽合成酶(nonribosomal peptide synthetases, NRPS)模块化线性合成多肽的原理对其催化模块进行改造、重组,定向设计多肽的生物合成途径以获得目的多肽已成为一个研究热点。然而杂合NRPS存在催化模块无法加载目标氨基酸或多肽合成效率显著降低等诸多问题,限制了其应用。近年来,NRPS腺苷酰化域(adenylation domain, A域)及缩合结构域(condensation domain, C域)的底物选择性、NRPS亚基间对接域(docking domain, DD)和模块间连接区(linker)的研究已取得较大突破。从C域对底物的选择性及以不同融合边界进行催化单元替换两方面进行综述,介绍NRPS催化模块重构的研究进展,并概述了各替换方案的优点与局限性。     

肽基载体蛋白结构功能的研究进展

肽基载体蛋白(peptidyl carrier protein,PCP)是非核糖体肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetase,NRPS)的核心结构域。根据NRPS的装配机制,每个模块都至少包含一个PCP,PCP对于非核糖体肽合成中氨基酸残基及多肽在不同催化结构域中的传递起着重要作用,并为氨基酸残基和多肽向模块内其他修饰酶的转移提供一个平台。本文主要对PCP的结构功能、与其他催化结构域的相互作用及重组模块活性降低的问题等方面进行了综述,期望为重组NRPS模块的构建提供理论依据。     

非核糖体肽合成酶的末端硫酯酶与多肽环化

非核糖体肽合成酶（nonribosomal peptide synthetases,NRPSs）能以多载体巯基化模板机制合成各种结构复杂、种类繁多的次生代谢非核糖体环肽.根据环肽末端环化的方式,可分为两大类：大环内酯型和内酰胺型.负责非核糖体环肽最终环化的硫酯酶（thioesterase,TE）属于α/β水解酶超家族.该家族包括：脂酶、蛋白酶、酯酶等,其共有特征是含有保守的催化三元件（Ser-His-Asp）,起到终止反应和释放产物的功能. TE具有区域定向性（regiospecific）、化学定向性（chemospecific）及立体定向性（stereospecific）的特点,在非核糖体肽（nonribosomal peptide,NRP）的合成反应中具有决定性作用,直接影响到最终环肽的生成. 同时,TE由于其特有的环化和水解的双重活性,在体外的线性多肽环化中越来越受到众多学者的关注. 综合国内外相关文献,本文着重从TE介导下的产物释放机制和影响因素两个方面综述非核糖体末端硫酯酶的研究进展及其应用.     

非核糖体肽合成酶基因腺苷酰化结构域序列克隆及分析

微生物许多非核糖体肽类次生代谢产物主要是由非核糖体肽合成酶(NRPS)催化合成。参考Gontang发布的非核糖体肽合成酶(NRPS)通用引物设计扩增NRPS腺苷酰化结构域基因序列的特异引物,从海洋链霉菌L1的基因组DNA中扩增获得一个715 bp的NRPS基因序列。测序结果及比对分析表明该片段属于NRPS腺苷酰化结构域部分序列。对其拟翻译的氨基酸序列组成成分、理化性质进行分析,显示其包含AFD class I超基因家族核心结合区,为NRPS腺苷酰化结构域(A结构域)所在区域。对氨基酸序列的二级结构预测和三级结构模拟,发现与数据库中肠菌素合酶F组分的结构相似。为后续研究A结构域的特异性及完整NRPS基因簇克隆提供了参考。     

Ⅱ型硫脂酶与次生代谢产物合成

Ⅱ型硫脂酶(type Ⅱ thioesterases,TEⅡ)属于α/β水解酶,含有保守的催化三元件(Ser-His-Asp),广泛存在于非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetases,NRPS)和聚酮合成酶(polyketide synthases,PKS)系中。与Ⅰ型硫脂酶(type Ⅰ thioesterases,TEⅠ)不同,TEⅡ作为一个独立的蛋白质行使硫脂键水解功能。以往的数据研究发现,合成途径中TEⅡ基因缺失导致聚酮(polyketides,PK)或非核糖体肽(nonribosomal peptide,NRP)的产量显著降低。本文通过对硫酯酶(thioesterases,TE)的聚类分析,显示序列同源性方面TE聚类成两个不同的进化枝,一个含有所有TEⅠ,第二个包含所有TEⅡ。对TEⅡ的多序列比对及结构分析,结果显示TEⅡ序列中的标记序列"GHSMG"为保守序列,结构的差异性导致TEⅡ功能的差异性,综合前期相关数据研究,对TEⅡ在生物合成中的功能途径进行了概括性论述,并对其今后在次生代谢物合成研究中的应用进行了展望,以期加深对TEⅡ的认识和理解。     

Ⅱ型硫脂酶与次生代谢产物合成北大核心CSCD

Ⅱ型硫脂酶(type Ⅱ thioesterases,TEⅡ)属于α/β水解酶,含有保守的催化三元件(Ser-His-Asp),广泛存在于非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetases,NRPS)和聚酮合成酶(polyketide synthases,PKS)系中。与Ⅰ型硫脂酶(type Ⅰ thioesterases,TEⅠ)不同,TEⅡ作为一个独立的蛋白质行使硫脂键水解功能。以往的数据研究发现,合成途径中TEⅡ基因缺失导致聚酮(polyketides,PK)或非核糖体肽(nonribosomal peptide,NRP)的产量显著降低。本文通过对硫酯酶(thioesterases,TE)的聚类分析,显示序列同源性方面TE聚类成两个不同的进化枝,一个含有所有TEⅠ,第二个包含所有TEⅡ。对TEⅡ的多序列比对及结构分析,结果显示TEⅡ序列中的标记序列"GHSMG"为保守序列,结构的差异性导致TEⅡ功能的差异性,综合前期相关数据研究,对TEⅡ在生物合成中的功能途径进行了概括性论述,并对其今后在次生代谢物合成研究中的应用进行了展望,以期加深对TEⅡ的认识和理解。     

木霉菌抗菌活肽peptaibols合成调控机制研究进展

木霉菌Trichoderma spp.是广泛存在于土壤环境的丝状真菌,能够产生丰富的次生代谢物,具有抑制病原菌和促植物生长等功效,在农业和医药领域有广泛应用。Peptaibols是一类由非核糖体肽合成酶（non-ribosomal peptide synthetase,NRPS）合成的富含α-氨基异丁酸（Aib）的线性、具抗菌活性及长度不等的多肽。本文基于国内外关于木霉菌产生peptaibols的研究发展现状,重点介绍了peptaibols生物合成酶NRPSs基因簇,合成途径和调控模式,提出未来peptaibols类抗菌肽研究关注的焦点,有利于深入挖掘更具生物医药价值的抗菌肽产物。     

放线菌环二肽类活性天然产物生物合成研究进展

环二肽(cyclodipeptide,CDP)是一类由2个α-氨基酸缩合而成的最小环肽分子,也可称为二酮哌嗪类化合物(diketopiperazines,DKPs)。CDP具有稳定的DKP环状骨架结构,活性广泛而显著,药用前景良好,发掘意义重大。放线菌是重要的CDP生产菌,同时具有非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase, NRPS)与环二肽合酶(cyclodipeptide synthase, CDPS)两种DKP骨架合成催化酶,并从中发现多种骨架结构修饰酶,研究开发价值巨大。本文系统介绍了放线菌CDP类活性化合物的DKP骨架合成途径及其结构修饰机制两方面的研究工作,以期为新型CDP类天然产物的发掘、新颖CDP分子生物合成机制的阐明及合成生物学设计与应用等领域的研究与实践提供参考。     

非核糖体肽合成酶(NRPSs)作用机理与应用的研究进展

许多微生物能利用非核糖体肽合成酶(NRPSs)合成结构复杂、种类繁多的的生物活性肽。非核糖体肽因其独特的理化特性和药理学特性已被广泛关注,极具商业开发潜力。NRPSs由多个模块组成,模块的不同空间排列顺序决定其多肽产物的氨基酸序列特异性。NRPSs以多载体巯基化模板机理进行多肽合成,其底物特异性由腺苷酰化结构域和缩合结构域共同实现。目前,人们已经利用天然的NRPSs、某些特定结构域、将已知NRPSs的模块或特定结构域进行组合甚至杂合组合而构建成的新的NRPSs来合成目的多肽。     

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶在真菌和细菌的研究进展

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyl transferases,PPTase)可催化脂肪酸合酶(fatty acid synthases,FAS)、聚酮合成酶(polyketide synthases,PKS)以及非核糖体肽合成酶(non-ribosomal peptide syntethases,NRPS)的酰基载体蛋白(acyl carrier protein,ACP)及肽酰载体蛋白(peptidyl carrier protein,PCP)等的翻译后修饰反应,将辅酶A(coenzyme A,CoA)上的磷酸泛酰巯基乙胺基转移到ACP及PCP的保守丝氨酸残基上,从而激发ACP及PCP的活性,由此脂肪酸、聚酮、非核糖体肽得以合成。在大部分真菌及细菌中都存在着PPTase,且其在生物代谢中起到重要的作用。现对其研究进展进行阐述。     

新颖的黏细菌模块化天然产物装配线

黏细菌的显著特征之一是能够合成结构多样、功能丰富的天然产物．模块化聚酮合酶(PKS)和非核糖体肽合成酶(NRPS)途径是黏细菌合成天然产物的主要方式．与经典模块PKS/NRPS相比,黏细菌来源的模块化PKS/NRPS常表现出新颖的装配特征,显示出多样化的遗传加工潜能和装配产物结构多样性．本文综合归类分析了黏细菌来源的模块化PKS/NRPS遗传装配线类型及其对应化合物的生化结构特征,图文并茂地呈现了黏细菌在遗传、生化、组合生物合成、进化和药物开发领域的生机和潜能,并展望了基因组学时代带来的契机．     

牛樟芝非核糖体多肽合成酶基因(AcNRPS)的克隆与鉴定

胶霉毒素属于真菌天然次生代谢产物epipolythiodioxopiperazine(ETP)家族,具有免疫抑制剂、抗真菌等多种生物活性,是由非核糖体多肽合成酶(NRPSs)催化合成。从牛樟芝(Antrodia camphorata)基因组中挖掘出非核糖体多肽合成酶基因(AcNRPS,NCBI登录号为KX430967),克隆获取其全长cDNA,并对其进行生物信息学分析和表达谱分析。结果显示AcNRPS基因cDNA全长6 687 bp;与其DNA序列比对发现AcNRPS基因含有12个内含子;其开放阅读框编码2 229个氨基酸残基,BLAST比对发现其含有2个A-C-T结构域,底物需2个氨基酸;系统发育树结果显示AcNRPS与其他合成产物为胶霉毒素的NRPS基因聚为一类,其可合成胶霉毒素类化合物;表达谱分析显示,以葡萄糖和土豆蛋白胨作为碳、氮源的培养基能够有效促进牛樟芝NRPS基因的表达。     

芍药内生真菌的鉴定及产生活性次生代谢产物的评估

【目的】研究药用植物芍药(Paeonia lactiflora Pall.)内生真菌的种群多样性,同时对其可能存在的聚酮合酶(Polyketide synthase,PKS)和非核糖体多肽合成酶(Non-ribosomal peptide synthetase,NRPS)基因多样性进行评估,预测芍药内生真菌产生活性次生代谢产物的潜力。【方法】采用组织分离法获得芍药根部内生真菌菌株,结合形态学特征和ITS序列分析,进行鉴定;利用兼并性引物对内生真菌中存在的聚酮合酶(PKS)基因和非核糖体多肽合成酶(NRPS)基因进行PCR扩增及序列测定分析,构建系统发育树,明确芍药内真菌PKS基因序列和NRPS基因序列的系统进化地位。【结果】从芍药组织块中共分离得到105株内生分离物,去重复后获得52株内生真菌,菌株ITS基因序列信息显示,52株芍药内生真菌隶属于7目、13科、15属,其中小球腔菌属(Leptosphaeria)、土赤壳属(Ilyonectria)和镰孢属(Fusarium)为优势种群;从52株内生真菌中筛选获得13株含PKS基因片段的菌株,8株含NRPS基因片段的菌株,部分菌株功能基因的氨基酸序列与Gen Bank中已知化合物的合成序列具有一定的同源性,预示芍药根部内生真菌具有合成丰富多样的次生代谢产物的潜力。【结论】药用植物芍药根部具有丰富的内生真菌资源,且具有产生活性次生代谢产物的潜力,值得进一步开发研究和应用。     

枯草芽孢杆菌抗菌肽生物合成的研究进展

革兰氏阳性菌模式生物--枯草芽孢杆菌能分泌多种肽类及由肽类衍生的抗菌活性物质,按合成途径不同,可分为核糖体肽和非核糖体肽。其中,非核糖体肽分子量较小,一般为3000Da以下,其生物合成是通过多功能复合酶系--非核糖体肽链合成酶来完成的,多发生在菌体生长停止之后;而核糖体肽分子量较大,其合成多于菌体快速生长时期。非核糖体肽链合成酶和核糖体肽的合成及其调控均需基因参与,而这一系列基因就构成了各种抗菌肽生物合成的基因簇。对核糖体肽和非核糖体肽的生物合成及其相关调控机制进行了综述。     

非核糖体肽合成酶工程改造研究进展

非核糖体肽合成酶合成的非核糖体肽类天然产物具有丰富的结构和多样的功能,在医药、农业、工业等领域具有广泛的应用潜力.利用合成生物技术工程改造非核糖体肽合成酶,在微生物细胞工厂中组合生物合成新型非核糖体肽分子顺应绿色化学的发展理念,是国内外学者关注的热点.文中归纳了3种不同的非核糖体肽合成酶工程改造策略,并对近年来相关领域...     

海绵共生萎缩芽孢杆菌C89 PPTase bap基因的异源表达

【背景】磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)催化非核糖体肽合成酶(NRPS)中肽酰载体蛋白(PCP)从无活性的脱辅基形态转化为有活性的全辅基形态,从而启动非核糖体肽类化合物的生物合成。【目的】鉴定贪婪倔海绵共生萎缩芽孢杆菌C89中Sfp型PPTase Bap,验证Bap激活NRPS中PCP的能力。【方法】通过BLAST和氨基酸多序列比对鉴定萎缩芽孢杆菌C89中Sfp型PPTase Bap。将bap基因在sfp基因突变株枯草芽孢杆菌168中异源表达,通过重组菌枯草芽孢杆菌168-bap的代谢物检测非核糖体肽类化合物Surfactin。【结果】Bap为Sfp型PPTase,检测到重组菌枯草芽孢杆菌168-bap中Surfactin的产生。【结论】本研究为海洋萎缩芽孢杆菌中NRPS基因簇的异源表达奠定了基础。     

炭团木霉中非核糖体多肽基因NRPS1的功能研究

[目的] 木霉属真菌是应用最为广泛和潜力最大的生防真菌,其产生的典型化合物哌珀霉素（peptaibols）类抗生素在生物防治中发挥重要作用。本研究采用基因组挖掘技术（genome mining）发现炭团木霉（Trichoderma hypoxylon）的潜在哌珀霉素生物合成基因簇及对病原菌的防治作用。[方法] 生物信息学分析预测合成哌珀霉素的基因簇,利用Quick-change技术构建基因骨架敲除盒,通过PEG介导的原生质体转化方法获得敲除突变株,通过平板对峙法和菌丝生长毒力实验验证该基因簇对炭团木霉生物活性的影响。[结果] 基因挖掘鉴定一个非核糖体多肽合成酶（nonribosomal peptide synthetases,NRPS）可能合成哌珀霉素类抗生素,命名为NRPS1,对该基因进行部分敲除,成功获得3株NRPS1缺失突变株。对峙实验表明,突变株对寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、黑白轮枝菌（Verticillium alboatrum）等9株植物病原真菌的抑制作用与野生株相比显著下降,且突变株的粗提物的抑菌活性明显弱于野生型。[结论] NRPS1是一个潜在的哌珀霉素合成基因,该基因在宿主与病原真菌对抗过程中起关键作用,该研究为炭团木霉哌珀霉素结构解析及生物防治机理研究奠定了基础。     

非核糖体多肽合成酶研究进展

细菌和真菌采用非核糖体系统合成一些重要的多肽类物质.近年来的研究表明,在该系统中发挥关键作用的是一类分子巨大的非核糖体多肽合成酶.它们由顺序排列的组件构成,酶分子结构本身即蕴涵着多肽合成的信息.对非核糖体多肽合成酶结构和功能的了解,使人们期望可以通过对这类酶的修饰和重组来合成一些新的多肽类物质.