三株抗恶性疟单克隆抗体(M26-32，F5-3F9，F5-4E9)的鉴定

用约氏疟原虫和恶性疟原虫免疫BALB／c小鼠,取其脾细胞与sP2／o细胞融合,获得11株抗恶性疟原虫红内期的单克隆抗体(McAb)。以多种疟原虫(恶性疟,间日疟,卵圆疟,诺氏疟、食蟹猴疟和约氏疟)的感染血片为抗原,进行间接免疫荧光测定(IFA),发现有3株McAb(M26—32,F5—3F9,F5—4E9)与所试6种疟原虫均发生阳性荧光反应。其中M26—32除能与中国海南岛的2个恶性疟分离株结合外,与东南亚、非洲、拉丁美洲的6个恶性疟分离株及卢旺达临床病人周围血中的环状体亦呈阳性反应。在与我国不同地区的间日疟反应时,几株McAb的IFA结果不同,提示不同间日疟原虫株的抗原成分有所差异。这些McAb与马媾疫锥虫和弓浆虫均无交叉免疫荧光反应。因此可能用于检测病人血中的微量疟原虫抗原,为早期诊断疟疾提供有力的工具,并可能用于鉴定不同地区的间日疟原虫。恶性疟原虫体外生长抑制试验结果表明,McAb M26—32能部分抑制疟原虫对。H－亮氨酸的掺入,并能延缓原虫血症的上升,在疟疾保护性免疫中可能起一定作用。     

抑瘤素McDNA的克隆及表达研究

抑瘤素M（onecostatinM,OSM）是一种多功能的细胞生长调节因子．从PMA刺激后的U937细胞系提取总RNA,采用逆转录-PCR方法分离到了抑瘤素M的cDNA;将抑瘤素M的cDNA克隆到质粒pUC19中,筛选三个阳性克隆进行序列分析,与国外报导序列完全一致;将抑癌素M的cDNA克隆到质粒pBV220后再转化DH5a进行模拟表达,SDS-PAGE分析表明有OSM表达,表达量约占细菌总蛋白5％,经过初步纯化的OSM能明显抑制A375细胞的生长．     

抑瘤素M cDNA的克隆及表达

抑瘤素M(Oncostatin M,OSM)是一种多功能的细胞生长调节因子。从PMA刺激后的U937细胞系提取总RNA,采用逆转录-PCR方法分离到了抑瘤素M的cDNA;将抑瘤素M的cDNA克隆到质粒pUC19中,筛选3个阳性克隆进行序列分析,与国外报道序列完全一致;将抑瘤素M的cDNA克隆到质粒pBV220后再转化大肠杆菌DH5α进行模拟表达,SDS-PAGB分析表明有OSM表达,表达量约占细菌总蛋白的5％;经过初步纯化的OSM能明显抑制A375细胞的生长。     

其它药剂

<正>本文描述了在探求疟疾疫苗中的一种使用多特异性人血清筛选表达恶性疟原虫。D-NA序列的大肠杆菌集落的方法。使用不A-mp3作为表达恶性疟原虫cDNA的克隆化工具。Lambda一Amp3。DNA重组物     

用抑制差减杂交法分离和克隆梭梭幼苗受渗透胁迫诱导相关基因的cDNA片段

以Hoagland溶液培养的梭梭幼苗（H）为对照群体,甘露醇处理的梭梭幼苗（M）为目标群体,进行抑制差减杂交。用经过H cDNA差减的M cDNA构建了一个含有大约400个独立克隆的差减文库;采用差减前的H cDNA和M cDNA以及正向／反向差减杂交后的cDNA为模板标记探针,对随机挑取的100个重组质粒进行差示筛选,获得了21个阳性侯克隆,从这些阳性候选克隆中随机挑取了8个进行Northern blot分析。证实其中3个候选克隆代表了在M中特异表达或表达增强的基因,序列分析和同源性比较表明它们与逆境胁迫有关;而另外5个候选克隆无Northern杂交信号,推测它们为低丰度转录本。     

用抑制差减杂交法分离和克隆梭梭幼苗受渗透胁迫诱导相关基因的cDNA片段

以Hoagland溶液培养的梭梭幼苗(H)为对照群体,甘露醇处理的梭梭幼苗(M)为目标群体,进行抑制差减杂交.用经过H cDNA差减的M cDNA构建了一个含有大约400个独立克隆的差减文库;采用差减前的H cDNA和M cDNA以及正向/反向差减杂交后的cDNA为模板标记探针,对随机挑取的100个重组质粒进行差示筛选,获得了21个阳性候选克隆.从这些阳性候选克隆中随机挑取了8个进行Northern blot分析,证实其中3个候选克隆代表了在M中特异表达或表达增强的基因,序列分析和同源性比较表明它们与逆境胁迫有关;而另外5个候选克隆无Northem杂交信号,推测它们为低丰度转录本.     

cDNA文库及其在原虫研究中的应用

cDNA文库构建和筛选是基因克隆的重要方法之一,它是目前发现新基因和研究基因功能的基本工具.从cDNA文库中可以筛选到目的基因,并直接用于该基因的表达.由于cDNA文库在基因分离和克隆中具有重要作用,因此其应用也日益广泛.简要介绍自cDNA文库创建以来,发展起来的各类文库及其构建cDNA文库的方法.作者重点阐述了弓形虫、利什曼原虫、阴道毛滴虫、疟原虫等原虫cDNA文库的构建及其应用.     

恶性疟原虫海南株(FCC1)翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因的克隆及序列测定

为了获得翻译控制肿瘤蛋白 (TCTP)基因 ,提取恶性疟原虫海南株 (FCC1)总RNA ,直接用总RNA反转录成单链DNA ,再用长距PCR方法扩增出双链cDNA .根据小鼠约氏疟原虫TCTP基因序列设计引物 ,以cDNA为模板合成了恶性疟原虫海南株TCTP基因 .以pMD18 T为载体 ,用大肠杆菌XL1 blue对基因克隆 .测序结果表明 ,此基因序列与小鼠约氏疟原虫TCTP基因序列有 85 %同源性 .由此基因序列推导出的TCTP氨基酸序列 ,与小鼠约氏疟原虫TCTP氨基酸序列有 88%同源性 .进入GenBank国际基因库 (美国 )检索 ,所克隆的基因与基因库中恶性疟原虫基因同源性为 97% ;由所克隆的基因序列推导的TCTP氨基酸序列 ,与国际基因库恶性疟原虫TCTP基因推导的TCTP氨基酸序列仅有 1个氨基酸差异 .恶性疟原虫海南株TCTP基因克隆为进一步研究奠定了基础     

甜菜坏死黄脉病毒RNA4 cDNA克隆、序列分析及其编码蛋白基因在大肠杆菌中的表达

以甜菜坏死黄脉病毒(Beet Necrotic Yellow Vein Virus,简称BNYVV)内蒙分离物(NM)RNA为模板,通过反转录和PCR扩增得到了BNYVV RNA4基因组的cDNA克隆pGBF6。序列分析结果表明,pGBF6含有全长RNA4 cDNA插入片段,大小为1465个核苷酸,含有一个849个核苷酸的开放阅读框架,编码产生由282个氨基酸组成的分子量为31kDa的蛋白。与法国F2分离物RNA4相比,其核苷酸序列和由此推导的氨基酸序列同源性分别为97.1％和96.4％,并在5'端非编码区比F2分离物缺失了3个核苷酸。将RNA4编码区cDNA克隆到原核表达载体pFLAG·MAC上,获得融合蛋白表达质粒pFMBF87。所构建的融合蛋白由载体序列编码的14个氨基酸和31kDa蛋白C端的233个氨基酸组成。经IPTG诱导,Westem blotting分析表明,该融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达。本文还对内蒙分离物的株系划分进行了讨论。     

甜菜M14品系花期cDNA文库的构建及特异表达基因的筛选

构建了甜菜M14品系在花期的ZAP表达载体的cDNA文库,利用抑制消减杂交方法所获得的M14品系特异表达的2个EST片段为探针筛选cDNA文库,获得了M14品系特异表达cDNA片段Me-86和Me-84;进一步利用RACE技术获得了基因M14-86 cDNA片段的全长序列。生物信息学分析表明M14品系特异表达基因M14-86的cDNA片段与cDNA片段Me-84分别与大花马齿苋(Portulaca grandiflora)及瓶子草(Sarracenia purpurea)的26S核糖体RNA具有很高的同源性。     

用人染色体14q24.3区带探针池直接分离表达顺序

本文报道了从显微切割的人染色体区带直接分离区带专一性表达序列的方法和结果。以区带探针池为基础构建了单拷贝DNA分子库,并以该库和人骨髓细胞cDNA分子库为主要研究材料,从5×10~5个DNA克隆中筛选到68个初级阳性克隆,复筛得到了32个次级阳性克隆,分别命名为cFD14-1～32。再经14q24.3 DNA、17q11-12 DNA和人基因组总DNA作dot blot DNA杂交验证,最终得到24个14q24.3区带专一性表达顺序。测定了其中13个片段的部分序列,在NCBI数据库查新,均为新的cDNA片段,并与某些已知基因有一定的同源性。其中cFD14-1的初步表达谱分析提示了本实验所得cDNA片段均有可能用来进一步筛选位于14q24.3区带内的尚未克隆的基因。     

人细胞差异表达基因cDNA消减杂交体系的建立

为克隆肺腺癌分化相关基因, 采用诱导分化与消减杂交相结合的策略, 建立了全反式维甲酸(RA)诱导前后人肺腺癌细胞系的cDNA消减文库, 得到124个cDNA消减克隆. 经加减法杂交差异筛选、DNA和RNA印迹、cDNA全序列测定和生物学功能分析, 分离到3个在人肺腺癌细胞系分化过程中由RA激活而特异表达的新的cDNA序列这一策略和技术路线适用于分离细胞中呈过量表达或表达抑制基因的cDNA克隆, 并具有反映细胞分化过程中基因表达动态变化特征和相对简便适用的特点.     

绵羊基因组MHC ClassⅢ区段部分基因的分离与鉴定

绵羊基因组MHC段分为ClassⅠ、Class Ⅲ和ClassⅡ（含Ⅱa和Ⅱb两个亚区）3个区段,与另外2个区段相比,Class Ⅲ区的基因信息远少于ClassⅠ和ClassⅡ区.为丰富绵羊基因组 MHC Class Ⅲ 区段基因信息. 本研究用位于中国美利奴羊基因组BAC文库中 MHC ClassⅢ 区段4个BAC克隆的酶切片段制备32P 标记探针,继而采用噬菌斑原位杂交筛选法筛选中国美利奴羊混合组织cDNA 文库,并对分离到的cDNA 阳性克隆进行全序列测定及生物信息学分析.本实验共筛选出 31 个 cDNA 阳性克隆,对其序列进行了测定及分析,确定了序列在ClassⅢ 区段上的位置,并通过在NCBI中的同源检索对其功能做了初步鉴定.由实验可知,利用BAC 文库与 cDNA 文库杂交筛选法对较大区段基因的筛选和分离是有效的.同时,对分离到的表达序列结合生物信息学进行分析,这将有助于对该序列功能的深入研究.     

染色体7q32-ter鼻咽癌相关基因的初步研究

为克隆7q32-ter区域等位基因杂合性丢失最小共同缺失区的鼻咽癌相关基因.以STS D7S509为探针,PCR法筛选位于该区的细菌人工染色体(BAC)克隆,应用EST介导的定位-候选克隆策略并结合生物信息学筛选出在鼻咽癌细胞株和活检组织中表达增强的EST AA773454,cDNA克隆测序和生物信息学资源获取全长cDNA,DNA印迹和甲基化分析研究其表达增强的机制.结果表明,克隆的NAG18基因cDNA全长802 bp,编码227个氨基酸,定位于胞核.该基因分别与人、鼠TAXREB107基因及RPL6基因高度同源.其表达增强的机制不是基因拷贝数的丢失和甲基化位点的改变.可以断定NAG18是定位于7q32-ter最小共同缺失区的鼻咽癌相关基因,它是一高度保守的基因,参与了DNA的转录活化.     

小鼠小脑区域性特异表达基因的分离和筛选——乳化酚递减杂交

哺乳类脑组织有着极其复杂和众多的基因表达,许多遗传性神经退行性疾病起源于不同的脑功能区域的基因表达缺陷。分离和筛选小脑特异表达基因是认识小脑疾病的重要途径。本文采用递减杂交法,大脑前皮层和肝组织单链cDNA为驱动物与小脑双链cDNA进行乳化酚杂交,经过重组噬菌体λgt11 DNA连接选择,特异性地克隆那些仅在小脑中优势表达的cDNA。杂交后的小脑eDNA文库容量仅是起始文库容量的0.049%(2.5×10~3/5.15×10~6)。用小脑和肝cDNA探针与PERT cDNA进行克隆杂交和斑点印迹杂交,结果显示绝大多数克隆仅与小脑cDHA杂交阳性。选择10个克隆cDNA与小脑等5种组织mRNA做Northern杂交,有2个小脑特异表达克隆,6个小脑优势表达克隆。对其中PC7和PD8克隆cDNA做部分DNA序列分析,它们是以前未报道过的新基因。     

条锈菌诱导的小麦抗病与感病近等基因系SSH文库构建及分析

为分析条锈菌诱导下的小麦抗病与感病近等基因系之间差异表达的基因,以接种小麦条锈菌CY26小种的抗病近等基因系Yr4/6×Taichung 29幼苗叶片cDNA作为实验方,接种CY26的感病亲本Taichung 29幼苗叶片cDNA为驱动方,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建了一个包含1 300余克隆的消减文库。对文库中600个克隆进行了反向Northern点杂交筛选,对获得的阳性克隆进一步进行了Northern杂交验证,获得显著差异的克隆12个。经测序和BlastX分析,其中6个差异表达序列的推测产物分别为亮氨酸重复序列蛋白、过氧化氢酶、硫氧还蛋白、RNA结合蛋白、抗坏血酸过氧化物酶和热激蛋白。除亮氨酸重复序列为信号传导类蛋白外、其他几个均为抗病防御类蛋白。     

HSV-1 UL30基因cDNA的克隆及筛选有效siRNA的融合载体构建

目的：克隆HSV-1 UL30 cDNA并测序,构建pEGFP-N1-Fi融合表达载体,为靶向UL30基因的siRNA的设计和筛选奠定基础。方法：从感染HSV-1 F株的病变VERO细胞提取总RNA,二次PCR扩增出UL30cDNA并克隆至pEGFP-N1质粒,测序鉴定序列;将UL30cDNA4个小片段亚克隆至pEGFP-N1-Fi融合表达质粒,转染VERO细胞,荧光显微镜观察融合蛋白表达情况。结果：成功克隆出UL30 cDNA,序列对比显示与基因库中的HSV-1株UL30序列同源性为99.4%;成功构建pEGFP-N1-Fi融合表达载体并实现Fi-EGFP融合蛋白的表达。结论：成功克隆出UL30cDNA,成功构建pEGFP-N1-Fi融合表达载体,为靶向UL30基因的siRNA的设计和筛选奠定基础。     

人巨细胞病毒IE基因调节子特异DNA结合蛋白cDNA的克隆和鉴定

本文利用人巨细胞病毒(HCMV)IE基因调节子中特异DNA片段作为探针,自人Hela细胞cDNA表达库中筛选并分离出两个编码能与该探针结合的DNA结合蛋白cDNA克隆(DJ-1和EH-2)。其中EH-2编码的蛋白具有明显的DNA结合序列特异性。比较DJ-1和EH-2克隆在HCMV戚染不容性和可容性畸胎瘤细胞中mRNA表达水平,未见明显差异。DJ-1和EH-2克隆可能涉及IE基因表达调控过程。     

一个小鼠未分化胚胎癌细胞特异cDNA的分子克隆

用胚胎癌细胞株(EC)PCC_3,的poly(A)~+RNA及质粒pBR 322在大肠杆菌中建立了一个eDNA文库。用另一株EC细胞F(?)及由EC细胞衍生的分化细胞株滋养层母细胞癌TDM_1的~(32)PcDNA作探针,对PCC_3 eDNA文库作了差别筛选。自3,000个cDNA克隆中筛出25个克隆。其中1个克隆MS,含有长250bp的cDNA。用MS,cDNA作探针,在F(?)细胞中能检出1个占poly(A)~+RNA约0.2—0.4％、长6kb的RNA(MS_3RNA)。用点印迹杂交及Northern印迹杂交分析法,证明MS_3RNA还存在于供试的另2株未分化EC细胞株PCC_3、PSA_1-NG_2中。在供试的全部分化细胞株,即TDM_1、PSA_1-2、3/A/1-D3、C_(17)-S_1-T(284)中,均查不到MS_3RNA。用Southern印迹杂交分析法,证明MS_3基因在小鼠基因组中存在着大量的拷贝,对小鼠胚胎基因文库的筛选表明,MS_3基因有一个中等重复的基因家族,这个家族在小鼠基因组中约有3,000个成员。     

人参植物与皂苷生物合成相关的差减cDNA文库构建及基因差异表达分析

应用抑制差减杂交技术,分别以源于4年和1年生人参根组织cDNA群体作为检测子(tester)与驱赶子(driver),成功构建了与人参植物皂苷生物合成相关的差减cDNA文库,并时从中筛选的阳性cDNA克隆进行DNA测序及其序列分析、PCR及Northern印迹杂交鉴定．结果显示,获得的13个克隆为新基因序列．其中6个差减克隆系人参植物根生长发育阶段差异表达基因．目前,6个差异表达新基因的结构与功能仍在进一步研究中．