表达毒素源性大肠杆菌定居因子抗原CS6的一组基因的克隆

人源毒素源性大肠杆菌(Enterotoxigenic E.Coil ETEC)是引起婴幼儿及旅游者腹泻的主要致病菌。ETEC的致病因子包括定居因子抗原 (Colonization factor antigens,CFAs)和肠毒素。大多数ETEC菌株均能产生抗原特异的菌毛,介导细菌与宿主小肠粘膜表面并在粘膜表面上受体的结合,使得细菌能定殖于粘膜表面并在粘膜的功能性清除中存活下来。已经报道的定居因子抗原包括CFA/Ⅰ,CFA/Ⅱ、CFA/Ⅲ、CFA/Ⅳ(PCF8775)、PCF09和PCFO159等。CFA/Ⅰ和CFA/Ⅲ均由单一的菌毛亚基构成,CFA/Ⅱ、CFA/Ⅳ则由多种表面抗原(colisurface antigen,CS)复合而成。所有的CFA/Ⅳ阳性菌株均表达CS6抗原,其中有些同时表达CS4或CS5抗原。CS4和CS5都是直径6～7nm的菌毛,能引起人和牛血红细胞的甘露糖抗性的凝集反应(MRHA)。迄今为止,没有观祭到CS6明显的菌毛结构,CS6也不能引起MRHA阳性反应。然而动物实验的结果表明,CS6是CFA/Ⅳ复合抗原中一种对定居作用最重要的抗原”,。本研究组已经通过分子克隆的手段获得了能分别表达CFA/Ⅰ和CS3抗原的重组菌株,用于人源ETEC疫苗的研究。本文报道了表达CS6菌毛抗原的DNA片段的克隆,并用免疫吸附制备的CS6抗血清测定了重组菌株表达的菌毛蛋白。     

大肠杆菌热稳定肠毒素与霍乱毒素B亚单位融合蛋白免疫原性的评价

构建了霍乱毒素B亚单位(CTB)和大肠杆菌热稳定肠毒素(ST）的重组表达载体pMCST1、pMCST2。二的不同是,前为单拷贝ST,后为双拷贝ST。在大肠杆菌DH50α中融合蛋白高效表达。用这两种重组蛋白分别免疫小鼠,都诱导产生了高滴度的抗CTB和抗ST的血清。表明这两组融合蛋白具有良好的CTB和ST的免疫原性,为进一步构建抗CTB和抗ST的产毒性细菌腹泻疫苗打下了基础。     

毒素源性大肠杆菌定居因子抗原CS6基因的克隆

通过构建人源毒素源性大肠杆菌野生株E519/66A大质粒的基因文库,成功地筛选出能表达定居因子抗原CS6菌毛的阳性克隆,初步确定了克隆DNA片段的限制性内切酶图谱。CS6抗原的编码和调控基因集中在一大小为4.6kb的DNA区段中,该片段能产生两种分子量大小不同、但抗原反应交叉的菌毛蛋白。本研究获得的CS6抗原阳性的重组菌株可用于人源ETEC多价疫苗的研制,克隆的基因片段亦可作为研究CS6菌毛蛋白基因表达及调控的基础。     

大肠杆菌热稳定肠毒素表位与霍乱毒素B亚单位的重组与表达

霍乱毒素B亚单位(CTB)是半抗原的良好载体,选择CTB基因的翻译调控元件,实现了串联重复的突变型大肠杆菌热稳定肠毒素(ST)表位与CTB的重组,在大肠杆菌中高效分泌表达,经过亲和层析获得了高纯度的重组蛋白,ELISA表明重组蛋白仍保留与神经节苷脂GMl的结合能力和CTB的免疫原性。     

霍乱弧菌zot基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

从霍乱疫苗菌中抽提基因组DNA,用PCR的方法扩增zot基因。序列分析表明,zot基因编码399个氨基酸,其中4个氨基酸与文献报道有差异。将zot基因插入含T7启动子的质粒pET28(a+)构建表达质粒pET-ZOT,转化大肠杆菌BL21(DE3)筛选表达菌株BLZOT。表达菌株经1mmol/L IPTG诱导表达3～5h后,表达大量ZOT蛋白,并形成包涵体。经SDS-PAGE分析重组ZOT蛋白分子量约为47kD,凝胶自动扫描分析表明,重组ZOT约占菌体可溶性蛋白量的15%以上。本工作为进一步研究蛋白多肽类药物的口服奠定了良好的基础。     

猪大肠杆菌耐热肠毒素和热敏肠毒素基因的融合及表达

用聚合酶链反应扩增出猪源大肠杆菌编码ST前体（proST）和LT的B亚单位(LTB)成熟多肽的序列,再通过套式PCR将proST编码序列3′端和LTB编码序列5′端融合,并置于同一阅读框内,得到ST和LTB的融合基因,将此序列克隆到pGEMT质粒中,序列分析后,亚克隆到表达载体pQE30中,在大肠杆菌细胞中得到表达,表达的融合蛋白同时具有ST和LTB的抗原性,且无ST和LT的生物毒性。     

大肠杆菌tktA基因的克隆表达

tktA是芳香族氨基酸生物合成共同途径的关键酶基因之一,在大肠杆菌中,tktA编码转酮酶A,在磷酸戊糖途径生成4－磷酸赤藓糖中起主要作用。采用PCR方法从大肠杆菌K－12株中扩增到tktA,并实现了高效表达,tktA活性提高了3．9倍,并且使芳香族氨基酸生物合成共同途径中关键中间产物DAHP的产量有所提高。     

霍乱肠毒素基因在大肠杆菌中的克隆与表达

霍乱弧菌569B染色体DNA,经毒源性大肠杆菌不耐热毒素基因探针定位,确定霍乱毒素基因分别位于EcoRI/pst I 酶解的5.1和5.4kb片段。我们分离其EcoR I/Pst I 酶解的4.5—6．0kb片段,与经EcoR I／Pst I 酶解的质粒pBR322体外连接转化大肠杆菌,经原位菌落杂交及重组质粒DNA的电泳分析鉴定,获得了霍乱毒素基因的克隆。通过生物活性和抗原性测定,表明霍乱毒素基因在大肠杆菌中获得了表达。     

霍乱弧菌肠毒素基因在大肠杆菌的表达

霍乱毒素基因在大肠杆菌获得了表达,在大肠杆菌中产生的毒素,具有霍乱毒素同样的生物活性、抗原性和免疫原性。但它产生的霍乱毒索,90％是保持在胞内的,其毒性可被胰酶激活。     

猪源肠出血性大肠杆菌CD18株fedA基因的克隆及表达

目的:获得重庆猪源肠出血性大肠杆菌(EHEC)强毒株CD18株fedA基因表达产物。方法:根据GenBank中的fedA基因序列设计引物,从重庆猪源EHEC强毒株CD18株基因组中经PCR扩增目的片段,克隆到pUC19质粒,亚克隆到表达载体pET28b( )的SalⅠ-HindⅢ位点后转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,Ni柱法纯化,SDS-PAGE及Western印迹检验表达产物。结果:CD18株fedA与文献报道的fedA的序列同源性为99.3%,推导的氨基酸序列的同源性为98.7%,表达产物在50～100mmol/L咪唑洗脱时出峰,SDS-PAGE显示其相对分子质量20000,Western印迹证明该蛋白条带能与分子标记蛋白His6抗体发生特异反应。结论:克隆到猪源EHECCD18株fedA基因,并在大肠杆菌中得到表达。     

大肠杆菌trpBA基因的克隆表达

目的:提高大肠杆菌中色氨酸合成酶的表达量和表达活性。方法:利用PCR方法从大肠杆菌K-12的基因组中直接克隆出紧密连锁trpB和trpA基因(简称trpBA),并将其连接到原核表达载体pet22b( )中,得到重组质粒pet22b( )-trp-BA,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导重组蛋白表达,表达产物经SDS-PAGE分析并用比色法测定其活性。结果:凝胶电泳可见PCR扩增产物大小约为2kb,SDS-PAGE鉴定目的蛋白的Mr分别约为29000和44000,色氨酸合成酶α、β亚基分别得到了高效表达,色氨酸合成酶活性提高到对照菌的3.7倍。结论:成功构建了重组质粒pet22b( )-trpBA,色氨酸合成酶的表达量和表达活性在大肠杆菌中得到了提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定基础。     

环境对产毒性大肠杆菌肠毒素表达的影响

通过体外试验,探讨一些与人体肠道微环境有关因素的变化对ＥＴＥＣ主要毒力因子肠毒素产生的影响。研究结果表明,细菌培养基的ｐＨ、渗透浓度、气体组成及温度的不同均可影响ＥＴＥＣ肠毒素的产生,而且ＬＴ与ＳＴ对有关环境因素的反应有所不同,一些与肠道环境有关环境条件的变化可影响ＥＴＥＣ肠毒素的表达,提示机体肠道微环境的变化可能与ＥＴＥＣ的致病有关。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A Asp227Ala基因的克隆及表达

目的：金黄色葡萄球菌肠毒素A Asp227ala基因的克隆及表达。方法：利用错配PCR方法,从含有金黄色葡萄球菌肠毒素A（Staphylococcal enterotoxn A,SEA)基因的质粒中扩增出约720bp的DNA片段,将其克隆到表达载体7ZTS中,并转化于JM109（DE3）。结果：重组质粒的测序结果表明,它含有702bp（不包括N端72bp的信号肽编码区）,其核苷酸序列与文献报道完全一致,推导的氨基酸序列显示227位的天冬氨酸已突变为丙氨酸。结论：该基因所表达的蛋白为可溶性蛋白,表达量占总蛋白51.5%。表达的蛋白与天然肠毒素A产生的抗体能发生凝集作用,具有与天然SEA类同的抗原活性。     

人毒素原性大肠杆菌肠毒素ST、LT-B基因的融合

将毒素原性大肠杆菌(ETEC)编码耐热肠毒素(ST)的基因片段与编码热敏肠毒素B亚基(LT—B)的基因进行融合,并在此基础上进行不同数目ST基因的串联。ELISA检测融合基因表达蛋白产物,观察到ST与LT-B之间存在着相互影响。ST的检测滴度随基因串联个数增加而逐渐升高,而LT的ELISA滴度则减弱。本研究说明ST可以通过基因串联提高表达产物抗原活性。这为毒素原性大肠杆菌多价疫苗的研制提供了重要的研究基础。     

抗菌肽-X基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用PCR技术获得抗菌肽—X基因、TNFα基因,与温度诱导的表达载体pRC连接成为重组表达载体,导入大肠杆菌TG1,通过温度诱导表达重组蛋白。将重组质粒转入不同的表达菌中进行表达,经SDS—PAGE选出E.coil BL21(DE3)为最佳表达的宿主菌。培养后,离心得菌体,经超声破碎离心得包涵体,溶解后用CNBr切割并透析,最后经CM52纤维素柱分离纯化得到有活性高纯度的抗菌肽—X。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的克隆、表达及初步纯化

为研究大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）的佐剂活性。从大肠杆菌中调出LTB的原始基因,将该基因克隆、构建pET21b—LTB表达载体、转化大肠杆菌B121（DE3）进行表达,并对表达产物进行初步纯化;经DNA测序、SDS—PAGE、ELISA检测,结果表明成功构建了能够稳定表达可溶性LTB的菌株,并获得初步纯化LTB的方法。为今后LTB的研究及应用奠定了基础。     

产肠毒素大肠杆菌的热敏肠毒素B亚基(LT-B)和耐热肠毒素(ST)基因融合及其表达

采用基因重组技术构建了表达产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的耐热肠毒素(ST)基因和热敏肠毒素B亚基(LT-B)基因融合抗原的疫苗候选株。将ST基因的5’端与LT-B基因的3’端连接,并置于同一阅读框。编码ST的基因是通过PCR从pSLM004质粒中扩增得到的,含有ST的pro序列(其编码ST前体的pro区域),并应用寡核苷酸定点突变技术将编码ST的第14位氨基酸残基发生突变,使ST的第14位氨基酸残基Ala突变为Leu。在所构建的结构中,于LT-B和proST之间分别插入了不同长度的氨基酸Linkers。表达的融合多肽同时具有ST和LT-B的抗原性,并保留结合GM-1神经节苷脂的能力,且无LT和ST的生物毒性。表达的融合蛋白免疫动物,能诱导产生相应的特异性抗体。     

人源产肠毒素大肠杆菌疫苗的研发进展

腹泻是全球范围内引起5岁以下幼童死亡的第二大病因,而产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是引起腹泻的最常见病原菌,其产生的细菌定植因子(CFs)和肠毒素是关键的毒力因子。CFs介导细菌黏附宿主小肠上皮细胞并完成定植,产生热敏肠毒素(LT)和热稳定肠毒素(ST)破坏宿主上皮细胞内的体液平衡,使体液和电介质过量分泌从而导致腹泻。预防ETEC腹泻的首选方法是使用能激发宿主产生抗黏附素免疫力和抗肠毒素免疫力的疫苗,阻断ETEC黏附和定植并中和肠毒素。目前一种名为Dukoral~的霍乱疫苗因能刺激机体产生抗热敏毒素免疫,已经被一些国家批准用于短期保护和预防旅行者腹泻。新型试验性ETEC候选疫苗正在研发中,旨在提供保护期长、反应谱广的抗ETEC感染免疫保护力。本文针对疫苗研发的关键问题和研究现状作一综述,并对未来的研究作出展望。     

人白细胞介素—18基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用反转录ＰＣＲ（ＲＴＰＣＲ）法从人肝组织中分离人白介素１８（ｈＩＬ１８）基因。克隆到Ｔｖｅｃｔｏｒｅａｓｙ载体中,经酶切初步鉴定后进行ＤＮＡ序列分析,结果表明与文献报道完全一致。以ｐＢＶ２２０为表达载体,在大肠杆菌中高效表达了ｈＩＬ１８基因,重组蛋白占菌体总蛋白的２７．２％。为进一步研究其生物活性奠定了重要基础。