培养基组分和发酵温度对重组酵母表达HBsAg的影响

分析酵母基因工程菌生产目的基因表达产物——乙型肝炎表面抗原的发酵过程,降低培养基中葡萄糖浓度,补充甘油和蔗糖,能使乙型肝炎表面抗原相对浓度从3．89提高至8．12,比活值增加2．69倍。根据实验观察的结果,造成发酵过程的温度序列,能合理地分配受体细胞代谢能量的消耗,使目的基因的表达量提高至13．51相对浓度。同时,对流加式操作系统中表现出的重组质粒稳定性的变化规律给予描述和解释。另外,提出了异源DNA与受体细胞的转化过程存在着一个分布,此分布对通过发酵提高乙型肝炎表面抗原的产量造成影响。     

乙型肝炎病毒表面抗原在乳酸克鲁维酵母中的表达

将乙型肝炎表面抗原基因插入具调控型启动子PH05的乳酸克鲁维酵母表达载体中,构建完成质粒pLSl．转化宿主菌Kluyveromyces lactis CXJ1—7A,ELISA结果表明．其表达水平受无机磷浓度的调控。为了进一步提高表达水平,我们将Pls1中的乙型肝炎表面抗原表达单元插入带完整Pkd1序列的载体Pe1,并将构建成的质粒Pls2转化MW98—8C。在比较了CXJ-7A／Pls1和MW98—8c／Pls2后,我们发现MW98—8c／Pls2的稳定性大大提高．表达量也增加4～8倍。     

人基因工程r—干扰素发酵过程的研究

分析大肠杆菌K802(pLY—4)生产人r—干扰素的发酵过程后发现,采用丰富培养基(改良LB+M9),既适合于细菌生长,又适合于r—干扰索的表达。采用逐步升温、控制不同发酵阶段的pH及保持高的溶解氧浓度,可提高重组质粒的稳定性和细胞的生长速率,使r—干扰素的表达量达4．0 X 106IU／ml,表达水平约占菌体蛋白的55％。     

含preS2免疫表位的HBsAg基因质粒的构建及表达

目的：应用表位设计构建高效表达乙型肝炎表面抗原含preS2免疫原位基因的真核表达质粒。方法：PCR法从慢性乙型肝炎患者血清中扩增和分离preS2 120-146表位和S基因片段,将两者融合并置于载体pcDNA3.1的巨细胞病（CMV）启动子作用之下,构建真核表达质粒pcDNA-S2S。序列分析和脂质体转染COS-7细胞瞬时表达鉴定。结果：序列测定结果表明插入序列与乙型肝炎病毒中国株全基因参照序列（adr亚型）一致,COS-7细胞瞬时表达鉴定实验中,ELISA检测到preS2-Ag和HBsAg的OD450分别为0.469和0.426。结论：应用表位设计成功地构建了含preS2免疫表位基因的重组质粒pcDNA-S2S所构建质粒能高效表达和分泌目的的蛋白。     

家兔个体表达系统的建立

将乙肝表面抗原基因及人生长激素基因用微注射法转入家兔受精卵发育成为有整合,有表达的当代兔,并繁殖出了有外源基因存在,有表达的子代兔,转基因所用的质粒是含（1）乙肝病毒表面抗S基因与小鼠MT启动子的pMTSA.(2)乙肝病毒核心抗原基因和乙肝病毒S基因启动子的pHBV3.0,和（3）含有人生长激素基因SV40启动子和小鼠MT启动子的pSMGH,质粒均切成线性人子后再注射,从757个微注射并移植的受精卵经发良娩出得101仔兔。其中有57％具有整合的微注射基因,用ELISA法测出28只转基因兔内有8只的血清中有表达的乙肝病毒表面抗原,占总数约30％,转基因兔与转基因兔和其与正常兔交配获得的子代中有83％含有转基因,有15％在血清中可测出乙型肝炎表面抗原,对转入人生长激素基因的兔也作了整合和表达的检测。     

生长速度对β干扰素工程菌稳定性和产物表达的影响研究

为了研究发酵培养阶段生长速度对重组人干扰素β(hIFN-β)工程菌稳定性、菌体密度和干扰素表达的影响,采用日本LE．Marubishi MSJ-50L发酵罐,在发酵过程中于诱导后通过控制不同的补料速度,检测低和高生长速度及发酵结束后菌体密度、稳定性和重组人干扰素β的表达量。诱导后维持低生长速度,发酵结束后平均密度A600值为7．52,表达量达20．7％,质粒稳定率好,达到91％,粗制干扰素收获2．37克;维持高生长速度,发酵结束后平均密度A600值达20．57,而表达量降为4．13％,质粒稳定率降为27％,粗制干扰素收获仅为0．59克。诱导后生长速度对工程菌稳定性和产物表达有明显影响。     

疫苗

923619乙型肝炎表面抗原在乳酸克会维醉母中的克隆和表达〔英〕/Martinez,E.…2 Bioteehnol.Lett一1092,14(2)。一53~56〔译自DBA,1992,11 (7),92一03754〕 为了用乳酸克鲁维酵母生产乙肝病毒表面抗原,构建了含lac4基因启动子(来自质粒BSLAC4)、表面抗原基因(来自质粒pHBI)、LAC4终止区及其后的URA3基因(来自酿酒酵母)和LAC4基因的3‘非编码区(来自质粒pJAAS12)的质粒pDLHZ。用含表达盒区的pDLHZ转化乳酸克鲁维酵母VDI,转化子于1%酵母粉、2%蛋白膝和2%葡萄糖的培界基中进行摇瓶培养(21摇瓶装40001培养基,于50℃、25orPm培养…     

乙型肝炎病毒adr和adw亚型表面抗原在非洲绿猴肾细胞中的表达

用pSV2-gPt作载体,将乙型肝炎病毒adr亚型的全序列基因和adw亚型的Bgl Ⅱ大片段DNA分别插入PSV 2-gpt BamHI及Bgl Ⅱ切口,获得4种重组质粒。它们都含有SV40DNA复制起始点、早期启动子、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)和氨苄青霉素抗性基因(Apr)。经酶切鉴定,选出正向重组质粒PSV 2-gbr1和pSV 2-gbw1,并分别转化Vero细胞,在选择培养基的压力下,两个质粒所含乙型肝炎表面抗原DNA均得到表达。     

温度对大肠杆菌L-色氨酸发酵过程的影响

目的：研究变温控制对大肠杆菌TRTH L-色氨酸补料分批发酵过程中生物量、色氨酸产量、比生长速率及质粒稳定性的影响。方法：利用5L自控发酵罐对L-色氨酸补料分批发酵过程进行温度控制,对不同温度下相关参数进行分析比较,确定优化的温度控制方案。结果：以30-36％顺序升温的工艺进行发酵得到理想结果,与单一温度控制策略相比,L-色氨酸产量提高了15．4％;色氨酸的比合成速率提高了21．6％;质粒稳定性增加,未出现质粒丢失现象,质粒拷贝数保持在恒定水平。结论：温度对大肠杆菌L-色氨酸发酵有重要影响。     

重组人内皮抑素工程菌菌种稳定性考察

研究重组人内皮抑素突变体质粒HM-E的宿主菌E．coliBL21（DE3）在LB培养基中传代50代过程中菌种的稳定性。研究表明,重组人内皮抑素工程菌在传代50代的过程中质粒稳定性（ST）高,为98％,菌体与菌落呈典型的大肠杆菌形态,反复冻融后表达量未下降,目标蛋白在菌体超声的沉淀中质量分数为（58．75±3．78）％,同时,四甲基偶氮唑盐微量反应比色法（MTT）结果表明目的蛋白质量浓度为20μg／mL时对内皮细胞ECV-304具有很高的抑制率,达（94．72±2．10）％。     

毕赤酵母发酵生产颗粒性乙肝表面抗原的条件优化

乙型肝炎病毒的流行对人们的生命健康造成了极大的威胁, 而有效准确的诊断和预防性疫苗是阻止其流行的主要手段, 乙肝表面抗原是诊断试剂和疫苗的主要成分。本试验在构建稳定表达HBsAg的毕赤酵母菌株后, 对其发酵条件进行了研究。采用摇瓶分批培养方法, 探讨了不同培养基、溶解氧、诱导物甲醇的浓度以及pH值等因素对菌体生长与重组蛋白表达的影响。在10 L发酵罐上采用分批补料培养的方法研究了进行扩大培养生产重组HBsAg。结果表明, FBS无机盐合成培养基是理想的工业发酵培养基, 溶解氧对菌体的生长与表达有显著的影响, 甲醇诱导最佳终浓度为1% (V/V), 发酵的最适pH值为5.4~6.0。发酵罐放大培养后, ELISA和 SDS-PAGE分析表明重组HBsAg获得了高效表达, 最终菌体生物量达到310 OD600, 表达量达到27 mg/L。电子显微镜观察表达重组乙肝抗原可以自组装为22 nm类病毒颗粒, 为HBV的新一代早期血清学诊断和疫苗的大规模生产提供了一定的参考。     

高密度培养大肠杆菌YK537／pSBHL—11生产重组人细胞白介素—3

在Ｂ．Ｂｒａｕ ＥＳ－１０型１５Ｌ和ＮＢＳ ＤｉｏＦｌｏ３０００型５Ｌ发酵罐中,利用补料分批培养技术高工表达培养含重组质粒ｐＳＢＨＬ－１１的大肠杆菌ＹＫ５３７,生产重组人白细胞介素－３（ＩＬ－３）,发现在发酵过程中,限制性流加甘油,控制溶解氧在３０％－４０％左右,３０℃生长,１１ｈ,４２℃诱导培养４ｈ,能将发酵液中最终菌体密度从ＯＤ１６６００提高到ＯＤ５３６００,并且保持了白细胞介素－３的表达量。     

乙型肝炎病毒表面抗原基因在大肠杆菌中的表达

通过次级克隆我们组建了乳糖操纵子启动基因控制下的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因片段和乙型肝炎病毒(HBV)基因组两种表达质粒,能在大肠杆菌中合成β-半乳糖苷酶乙型肝炎病毒表面抗原杂合蛋白,可被放射免疫分析和蛋白凝胶电泳所检测。     

产乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶基因工程菌的构建及遗传稳定性研究

利用质粒pET22b( )为表达载体,成功构建了产N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶基因工程菌BL21 - pET22b( )-argE,并考察了重组质粒的稳定性.双酶切鉴定了质粒构建正确,SDS-PA GE电泳证实了该菌可高效表达目的蛋白.连续传代50次实验表明重组质粒具有结构稳定性.无选择压力连续传代时,质粒丢失严重;有选择压力时连续传代未发生质粒丢失现象,具有较好的分离稳定性.发酵过程中,用羧苄青霉素代替氨苄青霉素,质粒稳定率由77.78%提高到8 6.42%.羧苄青霉素浓度为200μg/mL时,质粒稳定率提高到98.33%.     

两种新型HBsAg基因的毕赤酵母表达载体构建及其表达

目的：从乙肝患者血清中发现2个有突变的乙型肝炎病毒株,从中扩增出HBsAg(乙肝表面抗原)基因,构建酵母表达载体,并在巴斯德毕赤酵母中表达,以鉴定这2个基因表达产物的活性。方法：利用PCR技术从乙肝患者血清中扩增出乙肝表面抗原基因．并将其连接到pPIC3．5K中,转化毕赤酵母,通过甲醇诱导,利用SDS-PAGE和ELISA检测表达的蛋白。结果：通过序列测定结果表明成功地构建了毕赤酵母表达载体,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)和ELISA证明这2个基因在毕赤酵母中能有效表达。且表达产物均具有生物活性。结论：从实验结果发现乙肝表面抗原决定簇以外的少数氨基酸变化不影响其活性。因此可以利用这2个基因对乙肝表面抗原进行表达。     

高密度发酵生产突变型重组人肿瘤坏死因子rhTNFα-DK2的研究

通过对发酵基质和发酵关键参数的优化,确定了发酵培养基的磷酸盐浓度为０．１５Ｍ,甘油浓度为１．２ｍｌ／Ｌ,补料中甘油浓度为２０ｍｌ／Ｌ,发酵过程中溶解氧控制在３０％～６０％,ｐＨ控制在６．８５左右。在５Ｌ在ＮＢＳ－Ｂｉｏｆｌｏ３０００型自动控制发酵罐中采取加速补料的补料分批培养,重组大肠杆菌ＹＫ５３７／ｐＳＢ－ＴＫ经１０ｈ３０°Ｃ培养和５ｈ４２°Ｃ诱导培养,最终密度达到６０ＯＤ６００,ｒｈＴＮＦα－ＤＫ２的表达量占菌体总蛋白的５０％以上,每升发酵液纯化可得到近２ｇ的ｒｈＴＮＦα－ＤＫ２。     

表达乙肝病毒融合表面抗原基因SA-28的二倍体酵母工程菌的选育

将乙肝病毒融合表面抗原基因SA-28的单倍体酵母工程菌Y19/YFD158和与其不同接合型的单倍体酵母菌Y95接合,筛选到二倍体酵母工程菌Y95xY19/YFD158。对两种工程菌的研究表明：二倍体工程菌发酵密度为单倍体工程菌的3倍;表达质粒在二倍体酵母中的稳定性明显高于单倍体工程菌;二倍体工程菌对融合抗原的表达量为单倍体的3倍以上;表达质粒在二倍体细胞中的平均拷贝数略低于单倍体工程菌。     

甲醇诱导条件和方式对乙肝表面抗原产率的影响

发酵条件是影响汉逊酵母表达乙肝表面抗原的重要因素,通过对甲醇诱导浓度、方式及诱导周期的调控,研究了不同发酵条件对汉逊酵母表达乙肝表面抗原的影响。结果表明：控制甲醇流加速率15ml／h、甲醇诱导周期40h有利于发酵过程中乙肝表面抗原产率的提高。在发酵末期,细胞浓度最高达410mg／ml,抗原水平达46mg/l。     

组成型表达粪产碱杆菌青霉素G酰化酶重组大肠杆菌发酵条件研究

目的:对重组大肠杆菌组成型表达粪产碱杆菌青霉素G酰化酶(AfPGA)进行了发酵条件研究。方法:在摇瓶和5L发酵罐中研究了(NH4)2SO4和葡萄糖浓度对质粒的分离稳定性及青霉素G酰化酶表达的影响。结果:该工程菌质粒具有分离不稳定性,培养基中无(NH4)2SO4时发酵过程中pH和糊精水解生成葡萄糖的浓度变化较小,细胞前期(0h-12h)的生长速率降低,质粒分离稳定性和青霉素G酰化酶的表达水平提高。发酵过程中维持低葡萄糖水平可以限制细胞的生长速率,提高质粒稳定性和促进青霉素G酰化酶的合成。采用混合碳源发酵,发酵培养基含糊精2g/L,12h后以1g/L.h恒速流加葡萄糖至35h,控制流加过程葡萄糖浓度0.1g/L左右,平均比生长速率为0.06h-1,发酵结束时质粒稳定性为86%,青霉素G酰化酶的表达水平达23 000U/L。结论:重组大肠杆菌组成型表达青霉素G酰化酶的研究对工业生产有一定指导意义。     

下调bla表达提高pcDNA3.1+在重组菌中的稳定性

高拷贝质粒pcDNA3.1＋在鼠伤寒沙门氏菌S1.7207中不稳定。通过去除pcDNA3.1＋中氨繁青霉素抗性基因（bla基因）的启动子序列,仅保留其核糖体结合位点,构建了新质粒pmcDNA3.1＋。SL7207（pmcDNA3．1＋）在岔与不含氨苄青霉素的培养基中均能稳定保留其质粒。SI.7207（pmcDNA3．1＋）的β-内酰胺酶活力明显低于SL7207（pcDNA3．1＋）,且接种SL7207（pmcDNA3．1＋）的液体培养基中的氨苄青霉素不易被降解。腹腔接种小鼠7d后,脾脏中SL7207（pmcDNA3．1＋）的质粒稳定性仍保持在95％以上,而SL7207（pcDNA3．1＋）免疫后第3d99％丢失质粒。所以,通过降低bla基因的表达水平,为解决高拷贝质粒在沙门氏菌中的稳定性问题提供了新方法。